向小燕，蔡燕，周國富，黃佳佳

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是一種皮膚纖維化疾病。病理性瘢痕的存在，嚴(yán)重地影響著患者的身體健康及生命質(zhì)量。對瘢痕的防治，一直是目前創(chuàng)傷修復(fù)研究的熱點問題。瘦素(leptin)是由肥胖基因所編碼的含有167個氨基酸殘基的分泌性蛋白質(zhì)，作為一種特殊的致纖維化因子參與了眾多組織增生、肥大及纖維化［1－6］。leptin參與了皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程［7－9］，它能刺激成纖維細(xì)胞(FB)的增殖和合成膠原。leptin是否在病理性瘢痕這一纖維化疾病的發(fā)生方面也起到類似的作用呢?目前國內(nèi)外學(xué)者尚無相關(guān)的報道。本實驗期望通過檢測增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中l(wèi)eptin的表達(dá)情況，研究leptin與病理性瘢痕發(fā)生的關(guān)系，拓展病理性瘢痕在細(xì)胞因子致病機(jī)理方面的研究，期望為今后的瘢痕防治提供一條新的線索。

1 資料與方法

1.1 臨床病例及資料收集

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷科2010年1月至2010年6月間增生性瘢痕10例，瘢痕疙瘩10例，正常皮膚10例。所有瘢痕標(biāo)本均取自患者要求進(jìn)行瘢痕整復(fù)手術(shù)時所切除的增生性瘢痕，瘢痕疙瘩組織標(biāo)本，正常皮膚來自包皮環(huán)切手術(shù)中切除的丟棄的皮膚組織或者植皮手術(shù)中供皮區(qū)多余的皮膚。所有瘢痕病程均在12～24個月。所有患者均無合并皮膚疾病，結(jié)締組織疾病和其它重要臟器的疾病，未使用類固醇激素，青霉胺和抗腫瘤藥物，均未經(jīng)過化療，放療，激光治療及免疫治療。標(biāo)本均經(jīng)病理證實。每例標(biāo)本切下后15 min內(nèi)冰下采集，置入－70℃冰箱保存。

表1 受試者一般臨床資料(n=10±s)

表1 受試者一般臨床資料(n=10±s)

正常對照組5/5 18±2 －增生性瘢痕組 6/4 25±4 18±5瘢痕疙瘩組3/7 22±7 17±8

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 PCR儀、凝膠成像儀(美國BIO-RAD)、Trzol總 RNA提取試劑盒(美國 Invitrogen公司)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Fermentas RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(印度Fermenta biotech LTD)，PCR聚合酶(北京天根生化科技有限公司)。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)Genebank中的Leptin基因編碼序列(序列號NM_000230.2)，用在線引物設(shè)計軟件Primer3設(shè)計引物，并交上海生工生物工程有限合成。Leptin引物:FP:5'-CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG-3'，RP:5'-TTGATGGCTGAAGACCTTGG-3'，產(chǎn)物長度為 250bp。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)Trizol試劑盒提取各組織中的總RNA，測定其濃度和純度后，各取約1 μg用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。定量PCR擴(kuò)增Leptin，同時擴(kuò)增GAPDH作內(nèi)參，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，51℃退火延伸30 s，以每一標(biāo)本的平均拷貝數(shù)與相應(yīng)內(nèi)參平均拷貝數(shù)的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS12.0軟件包，組間比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)有學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常皮膚，增生性瘢痕，瘢痕疙瘩組織中瘦素mRNA的相對表達(dá)情況:瘦素mRNA表達(dá)在250 bp處出現(xiàn)一條亮帶。電泳結(jié)果顯示10例正常皮膚呈現(xiàn)低表達(dá)，表達(dá)量為0.55±0.17;增生性瘢痕組織有高表達(dá)，表達(dá)量為0.86±0.13;瘢痕疙瘩組織呈現(xiàn)超高表達(dá)，表達(dá)量為 1.32±0.15。Leptin mRNA的表達(dá)量在增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組都明顯高于正常皮膚組(P＜0.01)，在瘢痕疙瘩組又明顯高于增生性瘢痕組(P＜0.01)。(圖1，表2)

圖1 Leptin PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表2 Leptin在各組間表達(dá)情況(±s)

表2 Leptin在各組間表達(dá)情況(±s)

正常對照組10 0.55 ±0.17增生性瘢痕組 10 0.86 ±0.13*瘢痕疙瘩組 10 1.32 ±0.15*

3 討論

瘦素(leptin)是由肥胖(ob)基因所編碼的含有167個氨基酸殘基的分泌性蛋白質(zhì)，主要由白色脂肪產(chǎn)生，是一種具有多樣性功能的活性因子。leptin與器官纖維化的發(fā)生關(guān)系密切:(1)能夠誘血管平滑肌及心肌成纖維細(xì)胞的增生肥大［4－5］;(2)Leptin能促肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，并且是肝纖維化過程中必不可少的因素［1，10－11］;(3)Leptin 也參與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展過程［12－14］;(4)瘦素還能促進(jìn)矽肺組織纖維化和氣道纖維化形成［3，6］;(5)瘦素參與了胰腺纖維化［2］。leptin的致纖維化作用可能主要是通過調(diào)節(jié) TGF-β1 等細(xì)胞因子的表達(dá)而實現(xiàn)［15－17］。學(xué)者們［18－20］通過抑制或沉默leptin的表達(dá)，能夠成功阻抑肝纖維化。Leptin有望成為纖維化疾病基因治療的新靶點。

Leptin還參與了創(chuàng)傷修復(fù)過程，因為研究發(fā)現(xiàn):皮膚創(chuàng)面滲出物中l(wèi)eptin水平增高［7］，并且leptin受體表達(dá)上調(diào)［8］，受體表達(dá)越強(qiáng)則上皮增殖越快［9］，外源性leptin能顯著促進(jìn)創(chuàng)傷愈合［21－22］。成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)是主要的創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞，F(xiàn)B含所有類型的leptin受體，并且能合成和分泌leptin;外源性leptin能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)FB增殖和膠原合成［23］。上述表明，在創(chuàng)傷修復(fù)過程，F(xiàn)B能分泌leptin，同時又作為leptin作用的靶細(xì)胞之一，介導(dǎo)了leptin促進(jìn)創(chuàng)面愈合的過程。瘢痕是皮膚組織創(chuàng)傷修復(fù)后的必然產(chǎn)物。病理性瘢痕是由于全身和局部因素的影響，發(fā)生異常的損傷修復(fù)過程，是創(chuàng)傷過度修復(fù)的結(jié)果。組織學(xué)上以成纖維細(xì)胞(FB)的過度增生和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度聚集為特征，是一種真皮纖維化疾病。病理性瘢痕包括增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩較增生性瘢痕而言，其膠原合成代謝功能失去正常的約束控制，持續(xù)處于亢進(jìn)狀態(tài)，以致其膠原纖維增生的程度高于增生性瘢痕。考慮到leptin參與皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程，結(jié)合到leptin能致器官纖維化這一點，我們不禁想到，和致其它器官纖維化一樣，leptin在病理性瘢痕這一皮膚創(chuàng)傷過度修復(fù)過程中是否也發(fā)生了相同的促進(jìn)作用呢?leptin是否可能也作用于病理性瘢痕的成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致其過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積?

本研究的結(jié)果顯示，在病理性瘢痕中存在leptin的高表達(dá)，而在瘢痕疙瘩中的表達(dá)比在增生性瘢痕中的表達(dá)尤高，Leptin的表達(dá)程度與瘢痕纖維化程度一致。結(jié)果顯示leptin參與到了病理性瘢痕的形成過程中。但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實。

通過本研究，使瘦素致器官纖維化作用的研究進(jìn)一步擴(kuò)展，對病理性瘢痕發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞因子方面的研究進(jìn)一步深入。如果進(jìn)一步深入研究其致病機(jī)理以期進(jìn)行藥物干預(yù)，這也為延緩病理性瘢痕發(fā)生的進(jìn)程提供了一條新的思路，為病理性瘢痕的治療提供新的理論支持，這將可能為病理性瘢痕患者帶來新的希望。

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