劉康，李杰，王蘭，趙云霞，葉俊，李佳，秦家元，宋桂芹

(1.川北醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所;2.南充市中心醫(yī)院生物治療中心;3.川北醫(yī)學(xué)院2012級臨床醫(yī)學(xué)系;4.川北醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)系;5.川北醫(yī)學(xué)院2011級臨床醫(yī)學(xué)系;6.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，四川 南充 637000)

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的發(fā)病率、死亡率均位居世界前列，每年的發(fā)病人數(shù)占全世界的一半以上［1］，而以四川南充、鹽亭為代表的川東北地區(qū)是中國食管癌的主要高發(fā)區(qū)之一［2］。食管癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是造成預(yù)后差和死亡的主要原因之一，因此進(jìn)一步探討食管癌發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)理，對盡早發(fā)現(xiàn)和治療具有重要的現(xiàn)實意義。因此，有必要從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)角度對食管癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入研究，探討食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中細(xì)胞內(nèi)各種基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨?，并針對細(xì)胞內(nèi)的基因和信號通路中的重要分子開發(fā)定向拮抗藥物，為診斷和治療食管癌提供新靶點和策略。

特異AT序列結(jié)合蛋白1(special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)是一種組織特異性核基質(zhì)區(qū)結(jié)合蛋白，可特異性的與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列結(jié)合，參與染色體的高級包裝和組織特異性基因表達(dá)的調(diào)控及核骨架的形成［3］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，SATB1基因在胃癌組織和細(xì)胞中均呈高表達(dá)［4］，體內(nèi)外試驗證實，經(jīng)SATB1沉默的胃癌細(xì)胞其侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力均有明顯降低。但SATB1基因在食管癌中的表達(dá)和作用如何，目前國內(nèi)外尚無探討。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和熒光定量PCR等方法，分析SATB1基因在食管癌中的表達(dá)與腫瘤發(fā)生、分化轉(zhuǎn)移的關(guān)系，希望通過以上研究加深對食管癌生物學(xué)行為的了解，對食管癌的早期診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年10月至2014年4月我院附屬醫(yī)院心胸外科手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織48例。其中男性34例、女性14例，年齡43～75歲，平均60歲。病理分級:高分化10例，中分化25例，低分化13例。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。

1.2 主要試劑

qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自Thermo公司，兔抗人SATB1多克隆抗體購自bioss公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉素抗生素蛋白－過氧化酶連接法(S-P法)按試劑盒說明書進(jìn)行操作。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性后高壓鍋行抗原修復(fù)10 min，正常山羊血清封閉20 min后，滴加一抗(以PBS代替一抗作為陰性對照)4℃孵育過夜，PBS洗2遍，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗2遍后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。SATB1基因陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。結(jié)果判定在雙盲法下進(jìn)行，每張切片由2名病理醫(yī)師分別判斷，兩者結(jié)論不一致時重新評判。

1.4 實時熒光定量PCR

按照Omega RNA提取試劑盒說明書分別提取食管癌組織和癌旁組織RNA，按cDNA合成試劑盒說明書分別將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按照Bio-Rad熒光定量試劑盒說明書加樣檢測不同組織SATB1表達(dá)差異。qRT-PCR引物由上海捷瑞生物工程工程有限公司合成，引物序列見表1。所有反應(yīng)均設(shè)有3個復(fù)孔，采用SYBR Green嵌合熒光方法在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。

表1 實時熒光定量PCR擴(kuò)增的引物序列及擴(kuò)增片段的大小

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SATB1蛋白在食管癌和癌旁的表達(dá)情況

SATB1定位于細(xì)胞核，呈淡黃色至棕黃、棕褐色，在食管癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織中的表達(dá)，為83.3%。見圖1。

2.2 SATB1的表達(dá)與食管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

SATB1在食管癌組織各級總的表達(dá)率見表2。SATB1基因在食管癌中呈陽性表達(dá)，在食管癌組織各級的表達(dá)分別為:與患者年齡和性別無關(guān)，但與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分期等呈顯著正相關(guān)。腫瘤分化程度低、臨床病理分期較晚和出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織SATB1蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度高、臨床分期較早和未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織比較，統(tǒng)計學(xué)有顯著意義(P＜0.05)。

圖1 SATB1在食管癌和癌旁中的表達(dá)情況（×200）

表2 SATB1與食管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)系性分析

2.3 SATB1基因在食管癌組織中的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示，SATB1基因在癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織，結(jié)果見圖2。

3 討論

食管癌(esophageal carcinoma)是目前世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，而我國又是食管癌高發(fā)地區(qū)，年平均死亡人數(shù)約15萬人，占全國腫瘤死亡率21.8%［5］。在導(dǎo)致死亡最多的癌癥中，食管癌名列第4，侵襲轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因。迄今為止，食管癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，食管癌的早期診斷和預(yù)后評估等一系列問題一直困擾著廣大臨床工作者。但大量研究表明，食管癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因、多步驟的癌變過程，涉及大量相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控的改變，尤其是癌基因的活化和抑癌基因的失活起著重要作用［6］。相關(guān)基因在食管癌的發(fā)生及發(fā)展中扮演重要角色，腫瘤發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)，食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移及發(fā)展和食管癌轉(zhuǎn)移基因及食管癌轉(zhuǎn)移抑制基因有密切聯(lián)系。已知與食管癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因很多，如 Survivin、β-catenin、c-myc、EGFR、ras和p16等，針對這些基因的基因治療也取得了一定的進(jìn)展［7－12］，但是效果并不明顯，因此，深入研究食管癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的干預(yù)靶點對于食管癌的預(yù)防和治療具有重要意義。

圖2 熒光定量PCR檢測SATB1基因在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)情況

2008年，Han等［5］對乳腺癌的一項研究表明SATB1(special A-T rich sequence binding protein 1)蛋白是乳腺癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移性所必需的，其在具有侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中有所表達(dá)，而在正常細(xì)胞中并不出現(xiàn)。SATB1表達(dá)上調(diào)與侵襲性腫瘤表型和患者存活時間下降相關(guān)。SATB1通過限定多個基因組的位點和補充染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)。在有較強侵襲性的癌細(xì)胞中敲除SATB1可以改變基因表達(dá)，通過恢復(fù)癌細(xì)胞的極性來逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生，并且抑制在體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在非侵襲性腫瘤細(xì)胞中SATB1的異位表達(dá)可以導(dǎo)致與侵襲性腫瘤表型相關(guān)的基因表達(dá)模式，從而使之獲得轉(zhuǎn)移的能力。SATB1起到基因組組織器的作用，構(gòu)成了一個功能性的核結(jié)構(gòu)，被稱為SATB1調(diào)節(jié)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。比較SATB1移除前后幾種轉(zhuǎn)移性細(xì)胞型中基因表達(dá)圖譜的變化，結(jié)果表明SATB1控制著1/4－1/3“預(yù)后不良基因”，包括控制黏附性、細(xì)胞周期、細(xì)胞外基質(zhì)、數(shù)個信號通路、細(xì)胞間連接和凋亡的基因。因此SATB1通過染色質(zhì)基因重排促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，SATB1增量調(diào)節(jié)可能是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移必須基因簇的開關(guān)。

進(jìn)一步的研究表明，SATB1在肝癌、子宮內(nèi)膜癌和直腸癌中均為高表達(dá)［13－15］，抑制 SATB1在相關(guān)腫瘤中的表達(dá)可以達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)，SATB1基因在胃癌組織中均呈高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)或無表達(dá)［4］。但目前為止，SATB1與食管癌的關(guān)系如何，其在食管癌中的表達(dá)情況及調(diào)控機(jī)制等研究尚未見公開報道。

本研究結(jié)果表明，食管癌組織中 SATB1的mRNA及其蛋白的表達(dá)與癌旁組織比較明顯增高，SATB1的表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)，但與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分期等呈顯著正相關(guān)，這提示SATB1可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起到一定的作用，表明其可作為食管癌惡性程度及預(yù)后的重要參考指標(biāo)，進(jìn)一步提示其有可能作為食管癌生物治療的重要靶點，為食管癌侵襲轉(zhuǎn)移和治療提供一個新的研究方向。

［1］辛亮.食管癌的治療進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2014，54(2):97 －99.

［2］Uemura N，Kondo T.Current status of predictive biomarkers for neoadjuvant therapy in esophageal cancer［J］.World J Gastrointest Pathophysiol，2014，5(3):322 －34.

［3］Cai S，Han HJ，Kohwi-Shigematsu T.Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1［J］.Nat Genet，2003，34(1):42 －50.

［4］宋桂芹，劉康，白亦光，等.SATB1在胃癌細(xì)胞SGC-7901中表達(dá)的研究［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12(1):21 －23.

［5］田東，賀巧，王洋，等.食管癌高發(fā)區(qū)農(nóng)村居民飲食狀況及對食管癌認(rèn)知調(diào)查［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，25(5):470 －473.

［6］白海鵬，孫維敏，康娜.食管癌及其治療的研究進(jìn)展［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，30(3):134 －136.

［5］Han HJ，Russo J，Kohwi Y，et al.SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis［J］.Nature，2008，452(7184):187 －193.

［6］Zhang M，Zhou S，Zhang L，et al.Role of cancer-related inflammation in esophageal cancer［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2013，23(1):27－35.

［7］Li C，Yan Y，Ji W，Bao L，et al.OCT4 positively regulates Survivin expression to promote cancer cell proliferation and leads to poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］.PLoS One，2012，7(11):e49693.

［8］He H，Ding F，Li S，et al.Expression of migfilin is increased in esophageal cancer and represses the Akt-β-catenin activation［J］.Am J Cancer Res，2014，4(3):270 －278.

［9］Wang F，Xia J，Wang N，et al.miR-145 inhibits proliferation and invasion of esophageal squamous cell carcinoma in part by targeting c-Myc［J］.Onkologie，2013，36(12):754 － 758.

［10］Kwon J，Yoon HJ，Kim JH，et al.Cetuximab inhibits cisplatin-induced activation of EGFR signaling in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Oncol Rep，2014，32(3):1188 －1192.

［11］Jin Z，F(xiàn)eng X，Jian Q，et al.Aberrant methylation of the Ras-related associated with diabetes gene in human primary esophageal cancer［J］.Anticancer Res，2013，33(11):5199 －5203.

［12］Xu R，Wang F，Wu L，et al.A systematic review of hypermethylation of p16 gene in esophageal cancer［J］.Cancer Biomark，2013，13(4):215－226.

［13］Tu W，Luo M，Wang Z，et al.Upregulation of SATB1 promotes tumor growth and metastasis in liver cancer［J］.Liver International，2012，32(7):1064 －1078.

［14］Mokhtar NM1，Ramzi NH，Yin-Ling W，et al.Laser capture microdissection with genome-wide expression profiling displayed gene expression signatures inendometrioid endometrial cancer［J］.Cancer Invest，2012，30(2):156 － 164.

［15］杜超，成超，盧曉明，等.AT富集序列特異性結(jié)合蛋白1在直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中華實驗外科雜志，2014，31(5):1120 －1122.