金鐘曄，王少賢，白明華，李娜，景玉霞，3，劉群，陳家旭*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029；2.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，石家莊050051；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830054）

逍遙散對(duì)慢性束縛應(yīng)激所致肝郁脾虛證大鼠饑餓素的影響

金鐘曄1，王少賢2，白明華1，李娜1，景玉霞1，3，劉群1，陳家旭1*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029；2.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，石家莊050051；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830054）

目的觀察逍遙散對(duì)慢性束縛應(yīng)激所致肝郁脾虛證大鼠饑餓素（Ghrelin）的影響，探討逍遙散的作用機(jī)制。方法24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、逍遙散組，每組8只；正常組不進(jìn)行任何處理，模型組和逍遙散組通過(guò)連續(xù)21 d慢性束縛應(yīng)激建立肝郁脾虛證候模型，逍遙散組于每天上午束縛前灌服逍遙散混懸液3.854 g／kg，正常組和模型組灌服生理鹽水2 mL。比較各組大鼠的一般情況、飲水量及攝食量、體質(zhì)量變化情況，用ELISA方法測(cè)定大鼠血漿及胃底部組織中Ghrelin的濃度。結(jié)果束縛21 d后，模型組大鼠體質(zhì)量、攝食量、飲水量較正常組降低，增加減緩。與模型組相比，逍遙散組體質(zhì)量、攝食量、飲水量均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。模型組的血漿及胃底部Ghrelin含量比正常組低（P＜0.05），而逍遙散組的胃底部Ghrelin含量比模型組高（P＜0.05），與正常組相近；模型組的血漿Ghrelin含量低于逍遙散組（P＜0.01）。結(jié)論肝郁脾虛證模型大鼠血漿及胃底部組織中Ghrelin含量下降，逍遙散能提高Ghrelin水平，對(duì)肝郁脾虛證有明顯調(diào)節(jié)作用，對(duì)Ghrelin的調(diào)節(jié)作用可能是逍遙散治療肝郁脾虛證的可能機(jī)制之一。

慢性束縛應(yīng)激；肝郁脾虛；逍遙散；饑餓素

饑餓素（Ghrelin）是KOJIMA等［1］于1999年首先應(yīng)用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)在人和小鼠的下丘腦弓狀核的核心處和胃內(nèi)的分泌細(xì)胞有一種含28個(gè)氨基酸殘基的多肽。Ghrelin能刺激釋放生長(zhǎng)激素，同時(shí)透過(guò)食欲的促進(jìn)，使脂肪增加而升高體質(zhì)量［2］。它廣泛分布于多種組織器官，其中胃底泌酸腺的頸部和基部組織中濃度最高，占全身的20%左右，血液循環(huán)中70%的Ghrelin也是由胃底分泌的［3］。Ghrelin對(duì)調(diào)節(jié)攝食活動(dòng)具有舉足輕重的作用。研究表明，正常人體皮下注射Ghrelin往往引起饑餓反應(yīng)，食物攝入量明顯增加［4］。為了明確逍遙散對(duì)肝郁脾虛證調(diào)節(jié)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用21 d慢性束縛應(yīng)激方法建立肝郁脾虛模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用ELISA方法對(duì)胃底部及血漿中Ghrelin含量進(jìn)行觀察，分析肝郁脾虛證Ghrelin的變化及逍遙散的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與分組健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量180～200 g，清潔級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2006-0009。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提前購(gòu)入，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組8只，不予束縛，灌服生理鹽水；模型組8只，束縛21 d，灌服生理鹽水；逍遙散組8只，束縛21 d，灌服逍遙散。動(dòng)物每籠8只群養(yǎng)，室溫（25±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照明暗各12 h（明7：00-19：00，暗19：00-次日7：00），喂常規(guī)飼料和飲用水。

1.2 中藥及制備實(shí)驗(yàn)用藥復(fù)方選用《太平惠民和劑局方》的逍遙散（北柴胡30 g，當(dāng)歸30 g，白芍30 g，白術(shù)30 g，茯苓15 g，炙甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g），由北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司提供，根據(jù)《北京市中藥炮制規(guī)范》，按原書配伍比例由中日友好醫(yī)院中藥制劑室煎煮、濃縮成藥粉備用。用時(shí)根據(jù)需要量用蒸餾水配制成一定濃度的溶液。

1.3 主要儀器大鼠束縛架和代謝籠由動(dòng)物室提供。高速冷凍離心機(jī)，日立公司。超低溫冰箱Forma-86℃，Thermo USA。自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器ZDX-35BI，上海申安醫(yī)療器械廠。Ghrelin ELISA試劑盒，美國(guó)R＆D公司（由北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司檢測(cè)，檢測(cè)儀器：Multiskan Mk3全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備及藥物干預(yù)以慢性束縛方式制備大鼠模型［5］，將模型組和逍遙散組2組大鼠，束縛于特制的束縛架上（T型束縛臺(tái)：底座寬10 cm、長(zhǎng)20 cm、厚2.8 cm，上端束縛臺(tái)長(zhǎng)22 cm，最寬處6.6 cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺(tái)有兩條可調(diào)的軟帶，分別在胸、腹部固定），每天3 h，束縛時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)，每次開始造模前30 min各組大鼠灌胃，逍遙散組灌服逍遙散混懸液［用藥量3.854 g／（kg·d），按成人平均體質(zhì)量70 kg／d用藥量換算］。正常組和模型組灌服生理鹽水2 mL。

2.2 體質(zhì)量、攝食量、飲水量實(shí)驗(yàn)1、2、3周早上8：00，束縛前用電子稱進(jìn)行體質(zhì)量、飲用水、飼料的稱量。

2.3 取材及指標(biāo)檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)第22天，按0.4 g／100 g給藥量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取血2 mL于事先加入抗凝劑的試管中，4℃3 000 r／min離心10 min，分離血漿，抽取上清液，分別裝至凍存管內(nèi)，標(biāo)記編號(hào)后-70℃保存，以備檢測(cè)。解剖大鼠腹腔，取出胃，剪開胃大彎，用生理鹽水涮洗2次至干凈，濾紙吸干，剪取胃底部組織約100 mg，加入1 mL生理鹽水制作10%勻漿，于4℃3 000 r／min離心30 min，取上清液于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。依照試劑盒說(shuō)明書，用ELISA法檢測(cè)大鼠胃底部和血漿中Ghrelin水平變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件，對(duì)一般數(shù)據(jù)作正態(tài)分布和組間方差齊性檢驗(yàn)。兩項(xiàng)均符合，應(yīng)用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用LSD法作組間比較，以P＜0.05作為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界限。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠攝食量變化第1周，模型組和逍遙散組攝食量與正常組相比都有減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第2周，各組與第1周相比進(jìn)食量基本沒(méi)有變化。模型組與正常組相比有顯著下降（P＜0.05），逍遙散組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第3周，正常組與第2周相比攝食量幾乎無(wú)變化，模型組攝食量有減少，但逍遙散組的攝食量增加。3組之間比較發(fā)現(xiàn)模型組和正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），逍遙散組和模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），逍遙散組與正常組攝食量接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠攝食量變化情況（ˉx±s，n＝8）g

3.2 各組大鼠體質(zhì)量變化第1周，模型組和正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），逍遙散組和正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第2周，模型組和正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），逍遙散組和模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第3周，模型組和正常組相比差異仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），逍遙散組和模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況（ˉx±s，n＝8）g

3.3 各組大鼠飲水量變化造模第1周，模型組大鼠飲水量明顯少于正常組（P＜0.01）。第2、3周，模型組大鼠飲水量較正常組有減少趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，逍遙散組飲水量與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠飲水量變化情況（ˉx±s，n＝8）g

3.4 慢性束縛應(yīng)激后各組大鼠胃底部和血漿Ghrelin含量的變化模型組胃底部Ghrelin含量，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；逍遙散組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

模型組血漿Ghrelin含量，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；逍遙散組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 胃底部和血漿Ghrelin含量的變化分析（ˉx±s，n＝8）

4 討論

中醫(yī)經(jīng)典《靈樞》里的“司外揣內(nèi)，司內(nèi)揣外”是指通過(guò)觀察事物外在表象，以揣測(cè)分析其內(nèi)在狀況和變化的一種思維方法。應(yīng)激是動(dòng)物受到各種因素強(qiáng)烈刺激時(shí)，所出現(xiàn)的一連串神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，以及由此所引起的機(jī)體的各種變化［5］。對(duì)于適當(dāng)?shù)膽?yīng)激，哺乳動(dòng)物可以透過(guò)行為及內(nèi)分泌方面的變化來(lái)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)，但慢性應(yīng)激可能引起各種程度的心理或者身體障礙，引起臟腑失調(diào)、氣血紊亂產(chǎn)生疾病，屬于肝郁脾虛的范疇［6］。中醫(yī)肝病的證候跟神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的功能紊亂有密切關(guān)系［7］。逍遙散是治療肝郁脾虛證的經(jīng)方，許多實(shí)驗(yàn)已證明逍遙散對(duì)機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。以慢性束縛應(yīng)激方法制作的肝郁脾虛證大鼠模型，可通過(guò)進(jìn)食量、飲水量、體質(zhì)量的變化判斷模型的成功與穩(wěn)定性［8］。正常組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中與實(shí)驗(yàn)前基本一致，精神良好、活動(dòng)度好、皮毛潔白潤(rùn)澤無(wú)脫落、眼角無(wú)異物、糞便麥粒形且干稀適中。逍遙散組大鼠動(dòng)作靈敏、毛發(fā)潤(rùn)澤整潔，逍遙散組較模型組好，起到穩(wěn)定的效應(yīng)，表明逍遙散有很好的干預(yù)調(diào)節(jié)作用。

實(shí)驗(yàn)中，模型組隨著造模的進(jìn)行，逐步適應(yīng)，束縛時(shí)大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量增加緩慢，攝食量、飲水量有少于正常組的趨勢(shì)。第2、3周，模型組明顯出現(xiàn)攝食量減少。逍遙散組第1、2周與模型組類似，但由于藥物作用，大鼠狀況較模型組好。第3周，逍遙散組與正常組接近，與模型組比較有明顯的差別。該結(jié)果與本課題組前期研究一致［9］。逍遙散組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，體質(zhì)量、攝食量、飲水量都高于模型組，逍遙散起到穩(wěn)定的效應(yīng)，表明逍遙散有很好的干預(yù)調(diào)節(jié)作用，證明慢性束縛應(yīng)激方法建立肝郁脾虛大鼠模型成功。

Ghrelin主要由胃合成，通過(guò)原位雜交方法表明，Ghrelin的mRNA主要存在于胃底泌酸腺頸部和底部［1］。Ghrelin具有刺激垂體千葉釋放生長(zhǎng)激素（GH）、增加食欲、調(diào)節(jié)能量代謝平衡以及促進(jìn)胃酸分泌等生物學(xué)功能［10］。Ghrelin對(duì)攝食和體質(zhì)量調(diào)節(jié)的作用，長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)增加進(jìn)食量，體質(zhì)量增加［11］。大鼠在禁食、低血糖和注射瘦素（Leptin）時(shí)，胃內(nèi)Ghrelin的表達(dá)上調(diào)，這說(shuō)明Ghrelin在攝食活動(dòng)中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明Ghrelin對(duì)大鼠的攝食量和胃酸分泌有促進(jìn)作用［12］；正常人皮下注射Ghrelin會(huì)引起饑餓反應(yīng)，食物攝入量明顯增加［4］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組的血漿Ghrelin濃度明顯低于正常組和逍遙散組，與預(yù)測(cè)一致，經(jīng)逍遙散治療后可以升高血漿中的Ghrelin濃度，說(shuō)明逍遙散能夠調(diào)節(jié)Ghrelin的濃度。模型組胃底部的Ghrelin水平與正常組相比有顯著性差異，逍遙散組與模型組之間也存在著明顯的差異。由此可知，逍遙散能有效地行干預(yù)調(diào)節(jié)作用，調(diào)整組織中Ghrelin的濃度，進(jìn)而有效地調(diào)整胃功能及增強(qiáng)食欲。綜合分析實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量、攝食量、飲水量結(jié)果，Ghrelin與體質(zhì)量、攝食量、飲水量的關(guān)系為正比率關(guān)系，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與各家的眾多研究一致［13-14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明逍遙散對(duì)消化和代謝功能也有很好的干預(yù)調(diào)節(jié)作用。這可能是逍遙散治療肝郁脾虛證的作用機(jī)制之一。而具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有許多可深入研究的部分。

逍遙散是疏肝解郁的名方，是針對(duì)肝郁脾虛血弱患者而設(shè)。慢性束縛應(yīng)激是肝郁日久，木郁乘土，肝郁脾虛，氣血紊亂而出現(xiàn)病理變化。逍遙散對(duì)肝郁脾虛證具有很好的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)［15］證明逍遙散能夠有效地提升肝郁脾虛證大鼠的脾胃功能，這種調(diào)節(jié)作用應(yīng)該是經(jīng)由多種通路和機(jī)制調(diào)控。本研究提示Ghrelin與慢性抑郁可能存在必然聯(lián)系，并驗(yàn)證了逍遙散對(duì)Ghrelin的調(diào)節(jié)作用。本研究?jī)H就有限的條件做一表淺的研究，但為進(jìn)一步深入研究逍遙散對(duì)Ghrelin調(diào)節(jié)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Xiao Yao San on Ghrelin levels in rats with liver depression and spleen deficiency syndrome indeced by immobilization stress

JIN Zhongye1，WANG Shaoxian2，BAI Minghua1，LI Na1，JING Yuxia1，3，LIU Qun1，CHEN Jiaxu1*
（1.School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.College of Chinese Medicine，Hebei Medicine University，Hebei 050051，China；3.College of Chinese Medicine，Xinjiang Medicine University，Urumchi 830054，China）

ObjectiveThis experiment was designed to measure the effect of Xiao Yao San on treating liver depression and spleen deficiency syndrome by recording the changes of Ghrelin levels in the blood and the stomach bottom of fundic glands in chronic immobilization stress（CIS）model rats.MethodsThe 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups（8 rats for each group）：normal group，model group and Xiao Yao San group.We didn’t make any deal with normal group，but model and Xiao Yao San groups by continuous 21 day immobilization stress cause induced liver depression and spleen deficiency syndrome，before every morning bondage administered Xiao Yao San（3.854 g／Kg·d）to the Xiao Yao San group and administered a saline liquid（2 mL）to the normal and model groups.We used ELISA to measure the Ghrelin levels inboth the blood and stomach bottom after death on day 22.ResultAfter 21 days，the model group rat body weight，food intake，water quantity increase slower than normal group.The Xiao Yao San group increase faster than model group，they have a statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.The model group showed a significant decrease in the Ghrelin level contents in both the blood and stomach bottom compared to the Xiao Yao San and the normal groups（P＜0.05），but the Xiao Yao San group had a higher level of Ghrelin in stomach bottom than model group（P＜0.05）.Normal groups had similar Ghrelin level contents in stomach bottom；The model group had a lower level of Ghrelin in the blood than Xiao Yao San group（P＜0.01）.ConclusionXiao Yao San can effectively treat rats with immobilization stress induced liver depression and spleen deficiency condition by raising the levels of Ghrelin in both the blood and stomach bottom.

chronic immobilization stress；liver depression and spleen deficiency；Xiao Yao San；Ghrelin

R256

A

1003-5699（2015）09-0934-04

：張瑞彬

2014-11-17）

10.13463／j.cnki.jlzyy.2015.09.021

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30672578）；國(guó)家杰出青年科學(xué)基金課題（30825046）。

金鐘曄（1974-），男，韓國(guó)籍，博士研究生，主要從事中醫(yī)證候的病理生理基礎(chǔ)研究。

*通信作者：陳家旭，電話-（010）64286656，電子信箱-chenjx＠bucm.edu.cn