張 奇,林成仁,李 濤

柴胡對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎癥的干預(yù)作用

張 奇,林成仁,李 濤

目的探討柴胡對(duì)自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠干預(yù)作用,為臨床應(yīng)用柴胡治療多發(fā)性硬化(MS)提供依據(jù)。方法C57雌性小鼠40只,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、EAE模型組、潑尼松組[7.8 mg/(kg·d)]和柴胡組[1.95 g/(kg·d)],每組10只。EAE模型組、潑尼松組和柴胡組6周齡時(shí)用MOG35-55多肽免疫建立EAE模型,造模后第3天灌胃給予蒸餾水或藥物至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。自造模當(dāng)天觀察各組小鼠體重、行為學(xué);造模后第16天(發(fā)病高峰期)取脊髓組織行HE染色,觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況;采取尾靜脈血,檢測(cè)與多發(fā)性硬化主要相關(guān)炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)17E、γ-干擾素(IFN-γ)、IL-4、IL-21、IL-10、IL-23、IL-12(p70)、IL-17A、IL-17F和腫瘤壞死因子(TNF) α水平。結(jié)果與空白對(duì)照組比較,EAE模型組小鼠發(fā)病高峰外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平升高(P<0.05),IL-4水平降低(P<0.05);與EAE模型組比較,發(fā)病高峰期潑尼松組外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平降低(P<0.05或P<0.01),柴胡組IL-17E和IFN-γ水平降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論柴胡通過抗炎機(jī)制減輕EAE小鼠的病情,可作為MS治療的參考。

自身免疫性腦脊髓炎;多發(fā)性硬化;柴胡;潑尼松;炎性細(xì)胞因子

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,以髓鞘脫失和進(jìn)行性神經(jīng)功能喪失為主要特點(diǎn)[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis, EAE)的臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)和病理組織學(xué)方面都與MS相似,因而EAE被普遍應(yīng)用于研究MS臨床和病理學(xué)特征動(dòng)物模型[2]。細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié),與MS急性期病情密切相關(guān)[3]。由Th1和Th17分泌的γ-干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素(IL) -17已經(jīng)被檢測(cè)存在于MS病灶中[4]。尤其IL-17促進(jìn)炎癥發(fā)生,可以激活T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞黏附分子。IL-17在EAE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。而Th2或Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子例如IL-4和IL-10可以減輕炎癥反應(yīng),改善MS患者的癥狀[6]。柴胡為導(dǎo)師李濤教授治療MS的常用藥物[7],本研究采用C57小鼠EAE作為動(dòng)物模型,探討柴胡對(duì)EAE小鼠模型的干預(yù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠4周齡,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物 柴胡顆粒(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院顆粒藥房提供),潑尼松片(天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn),批號(hào)1303040)。

1.3 試劑MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,上海吉爾生化公司合成,純度98.4%,批號(hào):P130819-XZ051716),百日咳毒素(PT,Catalog Number:P7208,Sigma),滅活結(jié)核桿菌H 37RA(100 mg,Lot Number:2072054,Difco),完全弗氏佐劑(F5881-10ml,Lot Number:SLBB1387,Sigma),蛋白液相芯片試劑盒(美國(guó)EMD Millipore公司Cat.# MTH17MAG-47K),Mouse Th17 Magnetic bead panel(美國(guó)EMD Millipore公司Cat.#MTH17MAG-47K)。

1.4 儀器 Luminex液相芯片檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)(美國(guó)EMD Millipore公司),ICE-CL31R低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

1.5 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境 飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房。動(dòng)物飼養(yǎng)條件:溫度20℃～ 25℃,標(biāo)準(zhǔn)12h光照/12h黑暗節(jié)律,標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。

1.6 方法

1.6.1 分組與造模 隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、EAE模型組、潑尼松組和柴胡組,每組10只,適應(yīng)2周后造模。將髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)粉按2 mg∶1 mL比例溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中,完全弗氏佐劑加結(jié)核桿菌5 g/L,將MOG35-55水溶液與同體積的佐劑混合,充分乳化;50μg PT,用25 mL 0.01 mol/L PBS液溶解,濃度為2μg/mL。每只小鼠注射0.2 mL的乳化劑,MOG35-55注射量為每只200μg。經(jīng)小鼠背部皮下分3～4點(diǎn)注射0.2 mL抗原配劑。于造模當(dāng)天、第2天每只小鼠腹腔注射200 ng百日咳毒素。

1.6.2 動(dòng)物行為學(xué)觀察 自造模當(dāng)天起,每天對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并進(jìn)行EAE評(píng)分。EAE評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]:0分,無臨床癥狀;0.5分,部分尾癱;1分,完全尾癱;2分,失去協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和后肢部分癱瘓;2.5分,一側(cè)后肢全癱;3分,雙側(cè)后肢全癱;3.5分,雙側(cè)后肢全癱伴有前肢力量減弱;4分,雙側(cè)前肢癱瘓;5分,死亡。

1.6.3 給藥方式及途徑 造模后第3天開始灌胃給藥,每日1次。潑尼松組予潑尼松7.8 mg/(kg·d)灌胃,柴胡組予柴胡顆粒1.95 g/(kg·d)灌胃,空白對(duì)照組和EAE模型組給予等量純水灌胃。

1.6.4 外周血中主要相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè) 于造模后第16天(發(fā)病高峰期)尾靜脈采血(n=3)。全血常溫靜止1 h后,高速離心,取上層血清,-80℃保存。采用Merck Millipore公司的液相芯片Luminex技術(shù),由Milliplex analyst軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6.5 HE染色 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于造模后第16天(發(fā)病高峰期)水合氯醛麻醉后,先以適量生理鹽水經(jīng)左心室沖洗,待沖洗液清亮后,繼以4%多聚甲醛灌注固定,然后切取脊髓腰膨大部位浸泡于30%蔗糖后固定液中。石蠟包埋后按5μm厚度連續(xù)切片,切片行HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠發(fā)病情況及行為學(xué)觀察 造模后正常對(duì)照組小鼠精神活動(dòng)正常,體重逐漸增加。EAE模型組(灌胃死亡1只,給予剔除)、潑尼松組、柴胡組發(fā)病動(dòng)物表現(xiàn)精神差、攝食減少、毛色淡暗無光、體重下降、共濟(jì)失調(diào)等。3組造模后以潑尼松組發(fā)病最晚,柴胡組略晚于EAE模型組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以潑尼松組的最高平均評(píng)分最低,高峰期持續(xù)時(shí)間最短,其次為柴胡組,且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明柴胡可以減輕EAE小鼠發(fā)病,縮短高峰期發(fā)病時(shí)間,但作用不及潑尼松。詳見表1。

表1 各組小鼠發(fā)病情況及行為學(xué)評(píng)分比較

2.2 發(fā)病高峰期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥浸潤(rùn)情況 與空白對(duì)照組脊髓組織HE染色比較,高峰期EAE小鼠腰髓組織內(nèi)呈大量的單核淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn),可見明顯“袖套樣”改變。與同時(shí)間點(diǎn)的EAE模型組比較,潑尼松組和柴胡組小鼠脊髓組織內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕,尤其是潑尼松組接近空白對(duì)照組小鼠組織。

2.3 發(fā)病高峰期外周血中炎性細(xì)胞因子水平的變化

與空白對(duì)照組比較,EAE模型組小鼠發(fā)病高峰外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平升高,IL-4水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-17A、腫瘤壞死因子(TNF-α)有上升的趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-10、IL-12p70和IL-23各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-21未能檢測(cè)出。與EAE模型組比較,發(fā)病高峰期潑尼松組外周血中IL-17E、IFN-γ、IL-17F水平降低,柴胡組IL-17E和IFN-γ水平降低,但降低程度不及潑尼松組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表2。

表2 發(fā)病高峰期各組外周血中炎性細(xì)胞因子水平的變化(±s) pg/mL

表2 發(fā)病高峰期各組外周血中炎性細(xì)胞因子水平的變化(±s) pg/mL

_____________________________________________組別nIL-17E_______________________________ _IFN-γIL-17F_____________________________________________ IL-4IL-17A空白對(duì)照組3193.56±9.911.42±0.273.50±0.710.38±0.030.02±0.00 EAE模型組3296.85±44.121)2.14±0.241)45.32±4.971)0.12±0.031)0.22±0.13潑尼松組3 77.20±13.163)0.48±0.103)5.85±0.772)0.20±0.070.01±0.01 _柴胡組_____________________3___________ _201.41±26.612)4)___0.87±0.173)5)________75.53±13.69_______1.4_______________________________ 9±1.260.05±0.03 _____組別TNFαIL10IL12p70IL23空白對(duì)照組1.05±0.151.19±0.086.64±1.2520.02±0.90 EAE模型組3.28±0.851.29±0.122.83±0.136.97±2.64潑尼松組0.80±0.041.08±0.161.64±0.412.14±0.37 _柴胡組5.57±1.181.30±0.041.86±0.2518.27±6.47 _____與空白對(duì)照組比較,1)P<0.05;與EAE模型組比較,2)P<0.05,3)P<0.01;與潑尼松組比較,4)P<0.05,5)P<_________________ 0.01。

3 討 論

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白特定地表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘最外層薄板和細(xì)胞上及少突膠質(zhì)細(xì)胞中,是MS脫髓鞘過程的關(guān)鍵性自身抗原,MOG35-55誘導(dǎo)C57小鼠的EAE與MS有著相似臨床表現(xiàn)和病理學(xué)特征,廣泛應(yīng)用于MS動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)EAE模型組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)為:發(fā)病時(shí)出現(xiàn)體重下降,尾癱和肢體癱瘓。造模后EAE小鼠發(fā)病率在50%左右,個(gè)體小鼠最高評(píng)分3分,接近文獻(xiàn)報(bào)道[9]。IL-17家族是近來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子家族,有6名成員分別是: IL-17A,IL-17B,IL-17C,IL-17D,IL-17E和IL-17F。主要由效應(yīng)CD4+Th17細(xì)胞(Thelper17, Th17)分泌。IL-17 A(即狹義上的IL-17)是最早克隆的IL-17家族成員,與IL-17F一樣,主要由CD4+Th17細(xì)胞產(chǎn)生。IL-17具有免疫調(diào)節(jié)、粒細(xì)胞募集、介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種作用,在MS患者外周血單核細(xì)胞和腦脊液中表達(dá)升高[10]。EAE發(fā)病前期和高峰期中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的IL-17mRNA和IL-17水平升高,緩解期下降,IL-17mRNA表達(dá)水平與EAE病情呈正相關(guān)[11]。IFN-γ是一種重要的細(xì)胞因子,主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥的發(fā)生。Simpson等[12]觀察到IFN-γ對(duì)MS復(fù)發(fā)有很強(qiáng)的影響力,增加IFN-γ可以明顯增加MS的復(fù)發(fā)率。通過對(duì)脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子mRAN表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在第1次發(fā)病時(shí),脾細(xì)胞分泌IFN-γ增加,其mRNA表達(dá)水平升高[13]。顯示IL-17和IFN-γ在MS和EAE發(fā)病中起著重要的作用。IL-4是天然CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵,可以減輕炎性脫髓鞘疾病病情[14]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)各組小鼠外周血中細(xì)胞因子水平檢測(cè),發(fā)現(xiàn)發(fā)病高峰期EAE小鼠外周血中IL-17E、IL-17F和IFN-γ水平升高,IL-4水平降低;潑尼松降低小鼠發(fā)病高峰期外周血中的IL-17和IFN-γ水平抑制炎癥反應(yīng),柴胡可降低外周血中IL-17E和IFN-γ水平減輕炎癥反應(yīng),但強(qiáng)度不如潑尼松。

造模3組中以EAE模型組發(fā)病最早,病情最重,柴胡組與EAE模型組相比發(fā)病稍晚,病情較輕,但柴胡組作用次于潑尼松組。臨床上糖皮質(zhì)激素通常用于MS急性發(fā)作期治療,但長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素治療MS療效目前并不確定,且可導(dǎo)致嚴(yán)重副反應(yīng)[15]。柴胡及其復(fù)方制劑可以作為治療的選擇之一。

柴胡味苦,性微寒,歸肝膽經(jīng),具有和解表里、疏肝、升陽的作用,是疏肝解郁代表藥物。李濤教授認(rèn)為多發(fā)性硬化與肝關(guān)系密切,MS癥狀表現(xiàn)多樣,肢體抽搐和共濟(jì)失調(diào)都與風(fēng)邪亢盛有關(guān)?！秲?nèi)經(jīng)·病機(jī)十九條》:“諸風(fēng)掉弦皆屬于肝”;肝為將軍之官,主疏泄,調(diào)暢一身之氣。MS患者因久受病痛之苦,多伴有肝氣郁結(jié),故從肝論治,采用疏肝健脾益髓方治療MS,柴胡是其中重要藥物[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究柴胡具有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[16]。柴胡主要化學(xué)成分為皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類、多糖類及其他類化學(xué)成分,研究表明柴胡皂苷類有顯著的抗炎效果,對(duì)多種炎癥過程包括炎性滲出、毛細(xì)血管通透性升高、炎性介質(zhì)釋放、白細(xì)胞游走等均有抑制作用[17]。本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物行為學(xué)和組織病理學(xué)證明柴胡對(duì)于EAE模型小鼠病情有一定緩解作用,抗炎作用是干預(yù)的主要途徑。

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Intervention Effect of Chaihu on Inflammation in Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Zhang Qi,Lin Chengren,Li Tao
Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China Corresponding Author:Li Tao

ObjectiveTo explored the effect of Chaihu for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE),and to provide laboratory evidence for clinical application of Chaihu treating multiple sclerosis.MethodsC57 mice were immunized by MOG 35-55 to establish EAE,the model of multiple sclerosis.Forty mice were divided into blank control group,EAE model group,predn-i sone treatment group and Chaihu treatment group,which

oral administrations of different drugs after immunized 3 days.The mice behavior,checked daily and graded on clinical score were observed.It had been observed that cytokines levels of peripheral blood,relating to multiple sclerosis major factors,and inflammatory cell infiltration in spinal by HE staining after immunized 16 days.ResultsCompared with control group,the level of interleukin(IL)17E,IL-17F,interferon(IFN )-γwere increased while the level of IL-4 was decreased in EAE group(P<0.05).Compared with the EAE group,the level of IFN-γand IL-17E significantly reduced in Chaihu group.The difference has statistic significance(P<0.05 orP<0.01).ConclusionChaihu has theapeutic effect on the EAE mice by anti-inflammation.

experimental autoimmune encephalomyelitis;multiple sclerosis;Chaihu;prednisone;cytokines

R744 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.019

1672-1349(2015)06-0760-04

2014-12-06)

(本文編輯郭懷印)

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院(北京100091)

李濤,E-mail:lt0016@263.net