王秋艷,牛小媛,胡林森,房亞蘭

蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的PD 細(xì)胞模型中p47表達(dá)及磷酸化水平研究

王秋艷1,牛小媛1,胡林森2,房亞蘭1

目的探討蛋白酶體抑制劑(PSI)作用于PC12細(xì)胞后細(xì)胞總蛋白及其磷酸化水平的變化。方法收集實(shí)驗(yàn)組(PSI,10 μmol/L)和對(duì)照組[二甲基亞砜(DMSO)]細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行雙向電泳,應(yīng)用Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝膠染色技術(shù)獲得蛋白點(diǎn)磷酸化水平的差異信息,運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定出差異蛋白質(zhì)。結(jié)果差異蛋白點(diǎn)2、3均為p47,為2個(gè)同功體,蛋白酶體抑制劑干預(yù)后二者磷酸化水平均增加。結(jié)論p47表達(dá)上調(diào)及磷酸化水平增高與蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的異常蛋白聚集及空泡形成有關(guān),p47可能參與帕金森病的發(fā)病機(jī)制。

蛋白酶體抑制;PC12細(xì)胞;p47;磷酸化

帕金森病(Parkinson disease,PD)是最常見的神經(jīng)變性疾病之一,迄今為止PD的病因和發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。近年來研究表明家族性和散發(fā)PD都與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system, UPS)功能障礙有關(guān)[1]。經(jīng)典的PD模型[包括6-羥基多巴胺(6-OHDA)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)/1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)、百草枯、魚藤酮模型]中也存在UPS功能障礙。應(yīng)用蛋白酶體抑制劑已成功地建立了新的PD細(xì)胞和動(dòng)物模型[2-4]。

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最常見的一種共價(jià)修飾方式,在許多生物效應(yīng)中起著開/關(guān)的作用。據(jù)估計(jì),真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子中約有1/3發(fā)生磷酸化修飾。新近推出的Pro-Q Diamond磷酸化蛋白染色技術(shù)適用于包括磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸以及磷酸酪氨酸的蛋白分子的定量熒光檢測(cè),且可直接在凝膠上進(jìn)行,與MALDI-TOF-MS兼容,使大規(guī)模和系統(tǒng)性進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)研究成為可能[5,6]。

目前關(guān)于泛素-蛋白酶體功能障礙與PD的關(guān)系還不完全清楚,本研究應(yīng)用蛋白酶體抑制劑作用于PC12細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化亞蛋白質(zhì)組技術(shù),以期發(fā)現(xiàn)可能與PD相關(guān)的異常磷酸化蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料來源 PC12細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitor 1,PSI)購自Merck公司。Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝膠染液(ProQDiamandPhosphoproteinGelStain, MP33300)和Peppermint Stick磷酸化蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品(PeppermintStickPhosphoproteinMolecular Weight Standards,P33350)均購自Molecular Probes公司。高糖DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司;新生牛血清購自杭州四季青公司;L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶均購自Sigma公司。雙向電泳和質(zhì)譜分析所需試劑均購自GE Healthcare-Biosc-i ences公司。

1.2 細(xì)胞模型制備 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞,以1×105/mL密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶(每瓶10 mL),孵育24h后,實(shí)驗(yàn)組加入PSI(以DMSO配成儲(chǔ)備液,-20℃凍存,應(yīng)用終濃度為10μmol/L),對(duì)照組加入等體積的DMSO,繼續(xù)孵育24 h。取至少4批不同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),每組培養(yǎng)至少包括4個(gè)平行的培養(yǎng)瓶。在制備蛋白樣品前,對(duì)每個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞均進(jìn)行H&E染色。

1.3 蛋白樣品制備 收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞,按重量比1∶10加入裂解液[30 mmol/L Tris,7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS(w/v),60 mmol/L DTT, 2%Pharmalytes,pH 3～10,1%蛋白酶抑制劑(v/v),和1%核酸酶(v/v)]及1%磷酸酶抑制劑(v/v),室溫作用60 min。19 500 r/min,15℃,離心30 min,收集上清。清潔收集的樣品(具體操作按Clean-Up試劑盒操作說明進(jìn)行),樣品最終溶于水化液[7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS(w/v),40 mmol/L DTT,0.5% IPG buffer(v/v),pH 3～10和0.002%(w/v)溴酚藍(lán)]中。取少量樣品用于蛋白定量(具體操作按2-D Quant試劑盒說明進(jìn)行),剩余樣品分裝后保存于-70℃以進(jìn)行下一步操作。

1.4 磷酸化蛋白檢測(cè)及鑒定 取適量樣品(含有240 μg蛋白)配制250μL液體(包括適量樣品、0.28% DTT、0.5%IPG buffer和水化液),采用13 cm線性pH 3～10 IPG膠條及12.5%的SDS-PAGE膠(16 cm× 15 cm×1.0 mm),在Ettan IPGphor II/Hoefer SE600 Ruby系統(tǒng)上按常規(guī)方法進(jìn)行雙向電泳,二向電泳時(shí)酸性端旁置PeppermintStick磷酸化蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品。電泳結(jié)束后進(jìn)行Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝膠染色(具體操作按Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝膠染液說明進(jìn)行),采用Typhoon 9400成像系統(tǒng)在532 nm激光激發(fā)和560 nm發(fā)射濾光條件下獲取凝膠圖像。圖像采集后,將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,并用圖像掃描儀采集圖像(300dpi)。然后應(yīng)用ImageMaster 2D Evolution軟件對(duì)所獲取的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組磷酸化蛋白的圖像進(jìn)行蛋白點(diǎn)搜尋、背景削減和差異比較。在考染后的凝膠上找到有差異的蛋白質(zhì)點(diǎn),應(yīng)用MALDITOF PRO MS進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白酶體的抑制誘導(dǎo)PC12細(xì)胞死亡和胞漿中嗜酸性包涵體形成 與以前的報(bào)道一致,通過DNA染料染色PSI組可以觀察到很多PC12細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮、斷裂,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PSI誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。HE染色后,對(duì)照組PC12細(xì)胞的胞漿中沒有觀察到包涵體,而PSI組可以看到嗜酸性包涵體,同時(shí)細(xì)胞和細(xì)胞核均增大,胞漿中空泡明顯增多。此外,胞漿中嗜酸性包涵體隨著PSI濃度增高而增多。10μmol/L PSI處理后大約能在80%的細(xì)胞中誘導(dǎo)出包涵體形成。

2.2 PSI作用后p47表達(dá)及其磷酸化水平的變化 正常PC12細(xì)胞中有部分蛋白發(fā)生磷酸化修飾。應(yīng)用ImageMaster 2D Evolution軟件分析發(fā)現(xiàn)蛋白點(diǎn)2和3磷酸化水平增加,PSI組/對(duì)照組比值分別為1.895和1.123,經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定這2個(gè)點(diǎn)為NSFL1 (p97)cofactor(p47)。詳見圖1～圖3。

圖1 對(duì)照組和PSI組磷酸化蛋白圖譜

圖2 對(duì)照組的考染后總蛋白圖譜

圖3 點(diǎn)2的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

3 討 論

本研究將蛋白酶體抑制劑PSI作用于PC12細(xì)胞后,成功地再現(xiàn)帕金森病的兩個(gè)病理特征:細(xì)胞凋亡和胞漿內(nèi)嗜酸性包涵體形成。值得注意的是,本研究還觀察到在多種神經(jīng)變性疾病中經(jīng)?？吹降陌麧{內(nèi)空泡形成/空泡化。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化亞蛋白質(zhì)組技術(shù),我們首次發(fā)現(xiàn)NSFL1(p97)輔因子p47具有2個(gè)同功體,蛋白酶體抑制劑干預(yù)后這2個(gè)同功體的磷酸化水平也增高。

P97/VCP/Cdc48是一種分子量為97kDa的ATP酶,屬于AAA(與不同細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的ATP酶)家族,在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞通路時(shí)采用不同輔因子,目前已鑒定的包括p47、異二聚體Ufd1-Npl4、SVIP和VCIP135,各種輔因子與p97的結(jié)合呈現(xiàn)明顯的競(jìng)爭(zhēng)性[7]。近年來的研究表明p97/p47介導(dǎo)高爾基體的組裝及其他膜融合,也參與UPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的降解[810]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PSI干預(yù)后p47表達(dá)上調(diào),因?yàn)榈鞍酌阁w受到抑制后VCP與異常聚集的蛋白質(zhì)結(jié)合而抑制VCP的ATP酶活性和功能[11],所以p47表達(dá)上調(diào)可能為代償性增加,以彌補(bǔ)VCP的功能抑制,p47增加可能產(chǎn)生的結(jié)果仍不清楚。

蛋白酶體抑制劑能引起空泡形成,蛋白酶體抑制劑與VCP的RNA干涉共同作用顯著增加空泡形成[8],空泡可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常出芽和增大的結(jié)果[11], p97/p47介導(dǎo)的膜融合與空泡形成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑作用于PC12細(xì)胞可致胞漿內(nèi)空泡形成。輔因子SVIP與p97結(jié)合的功能是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整性,全長(zhǎng)SVIP或縮短的突變體過表達(dá)可致廣泛的細(xì)胞內(nèi)空泡化,這種空泡可能來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),空泡形成的原因與其他輔因子能結(jié)合的VCP減少無關(guān),p47與SVIP為競(jìng)爭(zhēng)性輔因子,單純p47過表達(dá)未能誘導(dǎo)空泡形成[12],本研究中p47的表達(dá)上調(diào)可能參與空泡形成,但可能不是根本原因。p47在Serine-140被Cdc2激酶磷酸化后,不能與膜結(jié)合,p97/p47介導(dǎo)的膜融合受到抑制[13],本研究中p47磷酸化水平增高,可能導(dǎo)致膜融合的抑制,進(jìn)而形成空泡,但是尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化亞蛋白質(zhì)組技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)p47具有2個(gè)同功體,蛋白酶體抑制劑干預(yù)后這2個(gè)同功體的表達(dá)都增加,二者的磷酸化水平也增高,為進(jìn)一步的PD發(fā)病機(jī)制研究提供了新的線索。

[1]Betarbet R,Sherer TB,Greenamyre JT.Ubiquitin-proteasome system and Parkinson’s diseases[J].Exp Neurol,2005,191 (Suppl 1):S17-S27.

[2]Rideout HJ,Larsen KE,Sulzer D,et al.Proteasomal inhibition

leads to formation of ubiquitin/alpha-synuclein-immunoreactive inclusions in PC12 cells[J].J Neurochem,2001,78(4):899 908.

[3]Yu R,Ren SG,Melmed S.Proteasome inhibitors induce asome inhibitors induce apoptosis in growth hormone-and prolactinsecreting rat pituitary tumor cells[J].J Endocrinol,2002,174(3): 379-386.

[4]McNaught KS,Perl DP,Brownell AL,et al.Systemic exposure to proteasome inhibitors causes a progressive model of Parkinson’s disease[J].Ann Neurol,2004,56(1):149-162.

[5]Steinberg TH,Agnew BJ,Gee KR,et al.Global quantitative phosphoprotein analysis using multiplexed proteomics technology[J].Proteomics,2003,3(7):1128-1144.

[6]Wu J,Lenchik NJ,Pabst MJ,et al.Functional characterization of two-dimensional gel-separated proteins using sequential sta-i ning[J].Electrophoresis,2005,26(1):225-237.

[7]Yuan X,Simpson P,McKeown C,et al.Structure,dynamics and interactions of p47,a major adaptor of the AAA ATPase,p97[J]. EMBO J,2004,23(7):1463-1473.

[8]Wojcik CI,Yano M,DeMartino GN.RNA interference of valosincontaining protein(VCP/p97)reveals multiple cellular roles linked to ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis[J].J Cell Sci,2004,117(Pt 2):281-292.

[9]Schuberth CI,Richly H,Rumpf S,et al.Shp1 and Ubx2 are adaptors of Cdc48 involved in ubiquitin-dependent protein degradation[J].EMBO Rep,2004,5(8):818-824.

[10]Hartmann-Petersen RI,Wallace M,Hofmann K,et al.The Ubx2 and Ubx3 cofactors direct Cdc48 activity to proteolytic and nonproteolytic ubiquitin-dependent processes[J].Curr Biol,2004, 14(9):824-828.

[11]Hirabayashi MI,Inoue K,Tanaka K,et al.VCP/p97 in abnormal protein aggregates,cytoplasmic vacuoles,and cell death,phenotypes relevant to neurodegeneration[J].Cell Death Differ,2001, 8(10):977-984.

[12]Nagahama M,Suzuki M,Hamada Y,et al.SVIP is a novel VCP/ p97-interacting protein whose expression causes cell vacuolation[J].Mol Biol Cell,2003,14(1):262-273.

[13]Uchiyama K,Kondo H.p97/p47-Mediated biogenesis of Golgi

and ER[J].J Biochem,2005,137(2):115-119.

R743 R259

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.018

1672-1349(2015)06-0757-03

2015-03-16)

(本文編輯郭懷印)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原030001);2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院

房亞蘭,E-mail:fangyalan.2008@163.com