孟 佳,黃希艷,李 倩,朱陵群

片仔癀對局灶性腦梗死大鼠BDNF 和IL6蛋白表達(dá)的影響

孟 佳1,2,黃希艷2,李 倩2,朱陵群2

目的觀察片仔癀對局灶性腦梗死大鼠模型腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)蛋白表達(dá)的影響。方法采用改良的Longa法制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型,SD大鼠隨機(jī)分為7組:假手術(shù)組、模型組、腦得生組、尼莫地平組及片仔癀大、中、小劑量組。通過免疫組化方法檢測腦組織BDNF和IL-6的蛋白表達(dá),HE染色觀察腦組織的病理損傷情況。結(jié)果在梗死中心區(qū),模型組的BDNF和IL-6蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P<0.01),片仔癀各劑量組的BDNF和IL-6蛋白表達(dá)均高于模型組(P<0.05或P<0.01);在梗死周圍區(qū),模型組BDNF和IL-6蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組顯著升高,片仔癀各劑量組BDNF的蛋白表達(dá)均高于模型組(P<0.01),而IL-6蛋白表達(dá)均低于模型組(P<0.05)。片仔癀大、中劑量組的腦組織病理形態(tài)較模型組有明顯改善。結(jié)論片仔癀可以上調(diào)局灶性腦梗死后大鼠BDNF的蛋白表達(dá)水平和下調(diào)IL-6蛋白表達(dá),減輕腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷。

腦梗死;片仔癀;大腦中動脈栓塞;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

腦血管病是目前發(fā)病率、致殘率和病死率均較高的嚴(yán)重疾病之一,缺血性腦血管病在腦血管病的發(fā)病中占60%～80%[1-3]。因此很有必要探討其發(fā)病機(jī)制及藥物保護(hù)問題。片仔癀由三七、天然麝香、天然牛黃、蛇膽等天然藥材組成,具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的顯著功效[3,4]。我們前期的研究表明,片仔癀對腦梗死的缺血性神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[1,2],但在腦梗死后對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)作用的相關(guān)研究較少。本研究為了進(jìn)一步研究片仔癀對腦梗死后的腦保護(hù)作用,探討其恢復(fù)機(jī)制,建立大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,并給予片仔癀進(jìn)行干預(yù),觀察BDNF和IL-6變化,為臨床治療提供理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與藥物 SPF級SD雄性大鼠,體重260 g±20 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,許可證編號:SCXK(京)2006-0009。片仔癀膠囊(漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供,批號: 0711050);腦得生購自廣東國醫(yī)堂制藥股份有限公司(批號:110101);尼莫地平片購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司(批號:113275);兔抗大鼠BDNF和IL-6抗體購自武漢博士德生物有限公司和北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號:BA0565、bs-0782R);尼龍栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司(型號2636),線身直徑0.26 mm,栓頭直徑0.36 mm±0.02 mm,線身長40 mm。

1.2 MCAO模型制備 按照已報(bào)道的改良Longa方法[3,4]制備模型:SD大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和非手術(shù)組(假手術(shù)組),術(shù)前禁食12 h,腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉(1 mL/100 g),頸正中切開皮膚,鈍性分離肌群后暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈,結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈的近心端,在頸總動脈遠(yuǎn)心端剪一小口,將尼龍線栓從此小口插入頸內(nèi)動脈,感覺阻力時(shí)立即停止進(jìn)線,插入18 mm～22 mm,固定栓線和縫合皮膚。假手術(shù)組只行頸部正中切開和縫合。大鼠清醒后參照Longa方法對其神經(jīng)功能進(jìn)行評分[3,4]。

1.3 動物分組及給藥方法 給藥劑量按大鼠與人的體表面積等效劑量折算,手術(shù)組根據(jù)術(shù)后Longa評分將納入大鼠隨機(jī)分為模型組,片仔癀大、中、小劑量組(486 mg/kg、162 mg/kg、54 mg/kg),腦得生組(486 mg/kg),尼莫地平組(10.8 mg/kg)。造模前3 d開始給藥,造模后第7天取材。假手術(shù)組和模型組分別灌胃給予等體積的生理鹽水,各組均每日給藥1次,藥物現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 取材及樣品制備 神經(jīng)功能評分后,各組大鼠3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速斷頭取腦,冰上視交叉后2 mm處取大鼠腦組織置于10%的甲醛溶液中固定24 h,常規(guī)梯度酒精脫水、浸蠟包埋,冠狀連續(xù)切片。部分切片常規(guī)HE染色,部分切片用于免疫組化染色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水, PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)沖洗5 min;0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中微波熱修復(fù)20 min;冷卻至室溫后PBS沖洗3 min×3次;3%過氧化氫避光室溫放置15 min;磷酸緩沖液(PBS)沖洗3 min×6次;滴加一抗BDNF或IL-6(1∶100),4℃冰箱過夜;恢復(fù)室溫后PBS沖洗3 min×3次;滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗后37℃孵育30 min;PBS沖洗3 min×3次;加DAB避光顯色,沖水終止;常規(guī)梯度乙醇和二甲苯脫水、透明,中性樹膠封片。用PBS替代一抗為陰性對照。

1.6 圖像分析 將已免疫染色的切片置于OLYMPUS BX60型顯微鏡下觀察,免疫陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒。分別于腦梗死的中心區(qū)、周邊區(qū)、對側(cè)正常區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野,SPOT-Ⅱ系統(tǒng)采集圖像,Meta Morph圖像分析軟件分析BDNF和IL-6陽性信號的光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理學(xué)改變 模型組可見較大范圍伴大小不等空泡的壞死區(qū),軟化灶明顯,部分殘存神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮深染,核溶解或核仁消失,細(xì)胞界限模糊,水腫明顯,壞死灶的周圍區(qū)可見較多的嗜中性粒細(xì)胞;假手術(shù)組的腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)均正常。與模型組相比,片仔癀大、中劑量組的壞死區(qū)明顯減小,周圍的神經(jīng)元的胞核和核仁清楚可見,水腫明顯減輕,部分大鼠的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)接近正常;腦得生組和尼莫地平組的壞死區(qū)范圍、水腫較模型組明顯減小或減輕,壞死區(qū)周圍的部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)接近正常。

2.2 片仔癀對BDNF蛋白表達(dá)的影響 梗死中心區(qū):模型組的BDNF蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P< 0.01),片仔癀大劑量組、腦得生組和尼莫地平組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。梗死周圍區(qū):模型組的BDNF蛋白表達(dá)明顯高于較假手術(shù)組(P<0.05),片仔癀大劑量組、片仔癀中劑量組、尼莫地平組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);片仔癀大劑量組的BDNF蛋白表達(dá)明顯高于小劑量組(P<0.05)。梗死對側(cè)正常區(qū):模型組的BDNF蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組,各藥物組的BDNF蛋白表達(dá)高于模型組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 片仔癀對BDNF蛋白表達(dá)的影響(±s)OD值

表1 片仔癀對BDNF蛋白表達(dá)的影響(±s)OD值

組別_____________________________n 梗死中心區(qū)梗死周圍區(qū)梗死對側(cè)正常區(qū)______假手術(shù)組80.113±0.0060.113±0.0060.113±0.006模型組80.053±0.0072)0.138±0.0051)0.131±0.007片仔癀小劑量組80.059±0.0080.162±0.0120.134±0.010片仔癀中劑量組80.065±0.0090.173±0.0104)0.128±0.011片仔癀大劑量組80.091±0.0104)0.188±0.0174)5)0.147±0.011尼莫地平組80.101±0.0084)0.201±0.0174)0.154±0.014 _腦得生組_____________________________8______________________________________________________________________________________________ _____________0.074±0.0113)0.162±0.0130.139±0.008 _____與假手術(shù)組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01;與片仔癀小劑量組比較,5)P<____________________ 0.05。

2.3 片仔癀對IL-6蛋白表達(dá)的影響 梗死中心區(qū):模型組IL-6蛋白表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P<0.01),尼莫地平組、腦得生組及片仔癀大劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。梗死周邊區(qū):模型組較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01),片仔癀大劑量組、腦得生組、尼莫地平組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。梗死對側(cè)正常區(qū):模型組IL-6蛋白表達(dá)較正常組升高,各用藥組均低于模型組,尼莫地平組表達(dá)最低,其次為腦得生組及片仔癀大、中、小劑量組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 片仔癀對IL-6蛋白表達(dá)的影響(±s)OD值

表2 片仔癀對IL-6蛋白表達(dá)的影響(±s)OD值

組別____________________________n 梗死中心區(qū)梗死周圍區(qū)梗死對側(cè)正常區(qū)______假手術(shù)組80.126±0.0110.126±0.0110.126±0.011模型組80.043±0.0152)0.233±0.0162)0.144±0.017片仔癀小劑量組80.059±0.0080.201±0.0190.142±0.010片仔癀中劑量組80.062±0.0130.208±0.0110.140±0.011片仔癀大劑量組80.083±0.0164)0.181±0.0133)0.138±0.008尼莫地平組80.114±0.0104)0.178±0.0153)0.125±0.011 _腦得生組80.081±0.0114)0.183±0.0153)_______________________________________________________ 0.131±0.012 _____與假手術(shù)組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<______________________________________________________ 0.01。

3 討 論

BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)素家族,主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)部位[5]。國內(nèi)外的大量研究表明,腦缺血性損傷后,其神經(jīng)元的損傷程度與BDNF的表達(dá)水平密切相關(guān),BDNF的高表達(dá)能夠明顯增強(qiáng)神經(jīng)元抗缺血性損傷的能力,BDNF在維持神經(jīng)元功能、缺血性損傷后的再生修復(fù)和防止神經(jīng)元退行性改變等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5,6]。IL-6主要表達(dá)于神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞,IL-6在腦組織損傷過程中發(fā)揮著雙重作用[7,8],BDNF和炎癥因子間存在相互作用[9],一些研究發(fā)現(xiàn),BDNF對IL-6的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子可減輕受損脊髓的炎癥反應(yīng),并減少神經(jīng)組織IL-6的分泌,保護(hù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞[10,11]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),片仔癀大、中劑量能夠明顯減少壞死區(qū)的范圍,使腦組織水腫明顯減輕,神經(jīng)功能障礙有不同程度的改善,神經(jīng)功能評分顯著好于模型組,提示片仔癀大、中劑量對腦梗死所致的神經(jīng)元等腦組織缺血性損傷有很好的保護(hù)作用。研究還發(fā)現(xiàn),在腦梗死中心區(qū)模型組的BDNF和IL-6的蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組顯著降低,片仔癀各劑量組BDNF和IL-6的蛋白表達(dá)均高于模型組,但均低于假手術(shù)組,這可能是腦梗死中心區(qū)的腦組織缺血水腫、變性壞死嚴(yán)重,神經(jīng)元大量缺血壞死、神經(jīng)纖維溶解等病理損傷,導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)合成減少所致,而片仔癀能夠不同程度地上調(diào)腦梗死中心區(qū)BDNF和IL-6的蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)神經(jīng)元等腦組織缺血性損傷的修復(fù)或再生。在梗死周邊區(qū),模型組BDNF和IL-6蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組顯著升高,片仔癀可顯著上調(diào)BDNF蛋白的表達(dá)和下調(diào)IL-6蛋白的表達(dá),提示BDNF蛋白的高表達(dá)和IL-6蛋白的低表達(dá)可能有利于缺血性損傷的神經(jīng)元對缺血性損傷的耐受,片仔癀對缺血性神經(jīng)元的功能保護(hù)及恢復(fù)有重要作用,片仔癀可以促進(jìn)神經(jīng)元的功能恢復(fù)及再生。而在梗死對側(cè)正常區(qū),模型組BDNF和IL-6蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組高,各藥物組的BDNF蛋白表達(dá)高于模型組,而IL-6蛋白表達(dá)低于模型組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示該區(qū)域的神經(jīng)元等腦組織可能參與了腦梗死后缺血性損傷的神經(jīng)元功能的恢復(fù)與再生,其可能的機(jī)制有待進(jìn)一步觀察和研究。

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Effects of Pien Tze Huang on the Expression of BDNF and IL-6 Protein in Rats with Focal Cerebral Infarction

Meng Jia,Huang Xiyan,Li Qian,Zhu Lingqun
The First Clinical Medical College,Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China Corresponding Author:Zhu Lingqun

ObjectiveTo observe the effect of Pien Tze Huang(PTH)on expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) and interleukin 6(IL-6)protein in rats with focal cerebral infarction model.MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by the modified Longa method.Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into sham operation group,model group,high,medium and low dose PTH group,Naodesheng(NDS)group and nimodipine group.Pathological damage were observed by HE staining.ResultsIn the central area of infarction,the expression of BDNF and IL-6 protein in model group were significantly lower than that in sham operation group.The expression of BDNF and IL-6 protein in Pien Tze Huang group were higher than those in the model group.In the area around the infarction,expression of BDNF and IL-6 protein in model group were significantly higher than those in the sham operation group,BDNF protein expression in PTH group were higher than those in the model group while the expression of IL-6 protein was lower than that in model group.Compared with model group,high and medium dose PTH groups had significant improvement on pathologial changes in brain tissue.ConclusionPTH can up-regulated expression of BDNF protein and down-regulation expression of IL-6 protein after focal cerebral infarction,alleviate nerve function injury caused by cerebral ischemia.

cerebral infarction;Pien Tze Huang;middle cerebral artery occlusion;brain-derived neurotrophic factor

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.017

1672-1349(2015)06-0754-04

2015-02-10)

(本文編輯郭懷印)

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題(No.2008ZX09202)

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(北京100700);2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

朱陵群,E-mail:lingqunzh@vip.sina.com