李 琳,馮 潤,黃 力

·基礎醫(yī)學論著/研究·

桑杞清眩顆粒干預自發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞凋亡的實驗研究

李 琳,馮 潤,黃 力

目的觀察桑杞清眩顆粒對高血壓心肌重構的抑制作用及其可能機制。方法選8只4周齡雄性WKY大鼠和16只4周齡雄性自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠,WKY大鼠作為對照組(WKY),SHR大鼠隨機分為模型組(SHR組)和給藥組(SQ+SHR組),每組8只。每組在治療16周后處死大鼠,尾套法測量SHR尾動脈收縮壓、舒張壓、平均壓,計算心臟重量指數(shù);用脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)染色來檢測凋亡心肌細胞;用蛋白免疫印跡法檢測大鼠心肌組織中B淋巴細胞瘤-2(Bc l-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、活化型半胱天冬酶-3(cleavedCaspas e-3)。結果與WKY組相比,桑杞清眩顆粒顯著抑制SHR大鼠收縮壓的升高、心臟重量指數(shù)的增加、抑制高血壓引起的大鼠心肌細胞凋亡、Bcl-2的降低及Bax和cleaved Caspas e-3的增加。結論桑杞清眩顆粒可以抑制SHR大鼠血壓升高,減輕心肌肥厚,其作用機制可能與抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞凋亡有關。

自發(fā)性高血壓;桑杞清眩顆粒;心肌細胞凋亡

中國疾病預防控制中心(CDC)慢性非傳染性疾病預防控制中心近期公布的一項橫斷面研究顯示,2010年中國成年人中高血壓患病率高達33.5%,估計患病人數(shù)達3.3億,45萬人死于高血壓[1]。長期高血壓造成的左心室重塑是發(fā)生各種心血管并發(fā)癥的獨立危險因素,與心肌梗死、心力衰竭、惡性心律失常、心源性猝死等密切相關。心肌重塑的典型特征是心肌細胞的肥大和凋亡,間質纖維化和炎性改變[2]。桑杞清眩顆粒是一種中藥復方,臨床用于治療高血壓病,主要由桑寄生、枸杞子、杜仲、決明子、野菊花、丹參、葛根、澤瀉等藥物組成。我們前期的研究證實,桑杞清眩顆粒具有干預心室重構和減輕心肌炎癥的抗炎作用[3,4]。本研究旨在觀察桑杞清眩顆粒的降壓作用是否與干預心肌細胞凋亡機制有關。

1 材料與方法

1.1 動物 16只4周齡雄性自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠購于北京維通利華技術有限公司,8只4周齡雄性WKY大鼠購于上海萊斯利實驗動物中心。動物飼養(yǎng)在安靜的房間,恒定的溫度(20℃～22℃)和濕度(50%～60%)與12 h光暗周期。

1.2 分組及給藥方法 SHR大鼠隨機分為模型組(SHR組)、給藥組(SHR+SQ組),每組8只。WKY組作為對照組,WKY組和SHR組每日予蒸餾水2 mL/100 g,SHR+SQ組給予桑杞清眩顆粒每日2 mL/100 g,分2次間隔8 h灌胃,療程共16周。

1.3 藥品與儀器

1.3.1 藥品 桑杞清眩顆粒由桑寄生、枸杞子、杜仲、決明子、野菊花、丹參、葛根、澤瀉組成,由衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院藥學部制劑室制備(批號20090801),取桑杞清眩顆粒40 g,加蒸餾水100 mL充分混勻,配成混懸液,相當于每毫升含飲片1.24 g。

1.3.2 儀器及試劑 BP-98A智能無創(chuàng)血壓計(日本Softron公司),AB204-S精密天平(瑞士梅特勒索-托利多),yp2001N電子秤(上海清海儀器有限公司), CP64精密電子秤(SARTORIUS),TD25-WS多管架自動平衡離心機(湘儀離心機),多功能酶標儀(美國伯樂公司),-80℃冰箱(美國Thermo)。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)Elisa試劑盒購于美國R&D公司。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α、PPARγ、核轉錄因子(NF-κB)Western-blot試劑盒,購于美國Abcam公司。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血壓檢測 每隔2周測血壓1次,每次測3遍,取其平均值,記錄在案。分別在給藥前、給藥后1周～16周每2周相同時間各測血壓1次。采用智能無創(chuàng)性尾套式大鼠血壓計,測量清醒安靜狀態(tài)下SHR尾動脈收縮壓(SBP)、舒張壓以及平均壓。測量之前加熱鼠尾10 min達37℃。

1.4.2 心臟重量指數(shù) 治療后16周,大鼠取完整心臟,4℃冷生理鹽水沖洗,濾紙吸干水分,電子天平稱重。計算心臟重量(HW)/體重(BW)比值(mg/g),評價左室肥厚程度。

1.4.3 用脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL) 染色法來檢測凋亡心肌細胞;石蠟切片脫蠟至水,實驗選用原位凋亡檢測試劑盒(Roche Basel,Switzerland),按試劑盒說明進行操作,用激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(Axiovert 200M,Carl Zeiss, Jena,Germany),在63倍物鏡下,進行觀察和拍照,其中細胞核染成藍色,而TUNEL陽性的細胞核為綠色。1.4.4 蛋白免疫印跡法檢測 蛋白免疫印跡法檢測大鼠心肌組織中B 淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表達。從組織中提取蛋白,經(jīng)過蛋白定量,SDS-PAGE電泳,轉膜,免疫反應,顯影,定影,最后凝膠圖像分析,得到最后結果。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠SBP的影響 治療8周、16周后,SHR組收縮壓逐漸升高,明顯高于WKY組和SHR+SQ組,治療后SHR+SQ組血壓較SHR組明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠SBP的影響(±s)mmHg

表1 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠SBP的影響(±s)mmHg

組別____n治療前治療后8周治療后16周WKY組 8113.80±7.46116.60±10.38117.80±6.57 SHR組 8122.20±11.05176.80±9.831)184.20±6.721)SHR+SQ組8125.60±10.29152.40±8.912)155.40±4.562)______與WKY組比較,1)P<0.05;與SHR組比較,2)P__________ <0.05。

2.2 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心臟重量指數(shù)的影響

治療后,SHR+SQ組心臟重量指數(shù)比SHR組明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心臟重量指數(shù)的影響(±s)

表2 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心臟重量指數(shù)的影響(±s)

組別____nBW(g)HW(mg)HW/BW(mg/g) WKY組 8677.90±79.70 1 831.00±266.98 2.71±0.37 SHR組 8383.33±11.96 1 705.00±107.474.45±0.281)SHR+SQ組8384.50±33.34 1 477.00±173.433.86±0.501)2)______與WKY組比較,1)P<0.05;與SHR組比較,2)P__________ <0.05。

2.3 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌細胞凋亡的影響(見表3、圖1) 桑杞清眩顆粒能夠顯著性地抑制長期高血壓引起的大鼠心肌組織中TUNEL陽性細胞數(shù)的增多。WKY大鼠心肌組織內沒有觀察到TUNEL陽性細胞。SHR組大鼠心肌組織內可以觀察到數(shù)量較多的TUNEL陽性細胞,提示大鼠的部分心肌細胞發(fā)生凋亡。給藥組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯減少。

表3 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌細胞凋亡的影響(±s)

表3 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌細胞凋亡的影響(±s)

組別_________________n 心肌細胞凋亡_________ WKY組80.00±0.00 SHR組820.40±2.881)_SHR+SQ組89.80±1.792)_____與WKY組比較,1)P<0.05;與SHR組比較,2)P<_______ 0.05。

圖1 各組大鼠心肌組織內TUNEL陽性細胞計數(shù)的

2.4 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平的影響 與WKY組相比,SHR組大鼠心肌中抑制凋亡的蛋白Bcl-2顯著降低,促細胞凋亡的蛋白Bax顯著性地升高,桑杞清眩顆粒可以顯著性地抑制Bax/Bcl-2的比值升高。與WKY組相比,SHR組大鼠心肌中的cleavedCaspase-3表達的升高,桑杞清眩顆粒可以抑制高血壓引起的心肌組織中cleaved Caspase-3表達的升高。詳見表4、圖2、圖3。

表4 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白的影響(±s)

表4 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白的影響(±s)

_組別n Bax/Bcl-2(%)_cleaved Caspase-3(%) WKY組81.42±0.81 0.56±0.22 SHR組84.45±1.571)1.26±0.381)_SHR+SQ組81.66±1.222)0.77±0.232)_____與WKY組比較,1)P<0.05;與SHR組比較,2)P<________ 0.05。

圖2 SHR大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白Western Blot分析

圖3 桑杞清眩顆粒對SHR大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白的影響

3 討 論

長期高血壓可引起靶器官的功能損害,心為主要受累之臟,西醫(yī)主要表現(xiàn)為左心室肥厚(LVH),其組織病理學改變是左心室重構,最終可致心力衰竭。中醫(yī)則進而發(fā)展為“喘證”“心悸”“水腫”之證。肝腎陰陽失調是貫穿高血壓—左心室重構—心力衰竭疾病進展過程中關鍵的病理變化,其基本病機為本虛標實。本虛以腎陰虧虛為主,標實以肝陽上亢、瘀血阻滯、痰濁壅滯多見。針對上述病因病機,故在治療上,采用補肝益腎、平肝潛陽、活血化瘀之法。應用桑寄生、決明子、丹參、葛根等藥物,以調整陰陽失衡。諸藥合用雖重在補益肝腎、平肝潛陽、活血化瘀,同時又用丹參入心經(jīng),養(yǎng)血益陰,使心腎兩臟相互交通,水火相濟,陰陽協(xié)調,從而達到相生互化,標本同治之功。桑杞清眩顆粒(原名降壓脈凈液)已在臨床應用多年,其降壓效果及預防靶器官損害作用已得到臨床驗證[5],并獲批為院內制劑。本研究應用該方作用于自發(fā)性高血壓大鼠,旨在探討其降壓作用是否與干預心肌細胞凋亡機制有關。

研究顯示自發(fā)性高血壓大鼠在代償期心肌重構過程中就存在有心肌細胞凋亡現(xiàn)象;而在病程進展到左心擴大,心功能減退時,心肌細胞凋亡程度進一步加重[2,6,7]。表明凋亡在心臟代償性肥厚到心力衰竭的轉折過程中起著重要的作用。長期心室后負荷增加除引起心肌細胞肥大外,還觸發(fā)Bax蛋白表達上調,Bax/ Bcl-2比值增加,從而導致心肌細胞凋亡。Bcl-2原癌基因是一種主要存在于線粒體膜及核膜的蛋白質,與細胞凋亡呈負相關,Bcl-2高表達可抑制凋亡。目前發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族成員有十幾個之多,可分為促凋亡因子及抑凋亡因子。Bcl-2為凋亡抑制因子;而另一個家族成員Bax則為促凋亡因子,其過度表達將誘導細胞凋亡。當長期高血壓時,Bcl-2/Bax的比值決定著細胞是存活或是走向凋亡[6]。

本研究用TUNEL染色的方法來檢測凋亡, TUNEL染色的方法已在心肌組織廣泛應用于標記凋亡細胞。Bcl-2基因是細胞凋亡的潛在抑制因子, Bax和cleaved Caspase-3等是促細胞凋亡的蛋白。本研究顯示桑杞清眩顆粒可以使SHR心肌組織內TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯減少。桑杞清眩顆?？梢燥@著性地抑制Bax/Bcl-2的比值升高,抑制SHR心肌組織中cleaved Caspase-3表達的升高。提示其降壓及干預左室重構的作用可能和抑制心肌細胞凋亡有關。進一步可對凋亡相關通路信號深入研究,探討其上游及下游的相關因子,具體闡明其抑制心肌細胞凋亡的機制。

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Effects of Sangqi Qingxuan Granule on Cardiomyocyte Apoptosis in Spontaneously Hypertensive Rats

Li Lin,Feng Run,Huang Li
China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China Corresponding Author:Huang Li

ObjectiveTo observe the inhibitory effects of Sangqi Qingxuan granule(SQG)on hypertensive myocardial remodeling,and investigate its possible mechanism.MethodsEight only 4 weeks of male WKY rats and 16 only 4 weeks male spontaneously hypertensive rats(SHR)were selected.WKY rats as the control group,SHR were randomly divided into model group and SQG treatment group,each group of eight.Rats were executed after the treatment of 16 weeks.The tail artery systolic pressure,diastolic blood pressure,average pressure were measured by tail set method.The cardiac weight index was observed.The myocardial cells apoptosis was detected by DNA nucleotides terminal transferase mediated Nick end labeling method(TUNEL)staining method.The B lymphocyte tumor-2(Bc l-2),Bc l-2 associated protein X(Bax),activated caspase 3(cleaved caspas e-3)in myocardial tissue were detected by protein immunoblot method.ResultsCompared with WKY group,the levels of systolic blood pressure,heart weight index,myocardial cell apoptosis,Bax and cleave d-caspase 3 were decreased while the level of Bc l-2 was increased in SQG treatment group.ConclusionSQG can inhibit the blood pressure,reduce the myocardial hypertrophy in SHR.Its mechanism may be related to inhib-i ting myocardial apoptosis in SHR.

spontaneously hypertensive rats;Sangqi Qingxuan granule;cardiomyocyte apoptosis

R541.1R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.013

1672-1349(2015)06-0743-03

2015-02-04)

(本文編輯郭懷印)

國家自然科學基金專項基金項目(No.81041039)

中日友好醫(yī)院(北京100029)

黃力,E-mail:lihstrong@163.com