何劍營(yíng)，周吉航，竺王玉，陳冬冬，黃燕燕，李世波

（浙江省舟山醫(yī)院：1.細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.感染科，舟山316021）

海島地區(qū)NA治療無(wú)良好應(yīng)答CHB患者HBV P區(qū)耐藥突變分析

何劍營(yíng)1，周吉航1，竺王玉1，陳冬冬1，黃燕燕1，李世波2

（浙江省舟山醫(yī)院：1.細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；2.感染科，舟山316021）

目的分析舟山地區(qū)經(jīng)核苷類(lèi)似物（NA）治療無(wú)良好應(yīng)答的慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）P區(qū)耐藥突變模式。方法收集2011年10月至2013年11月188例于浙江省舟山醫(yī)院接受NA治療無(wú)良好應(yīng)答的CHB患者血清，采用直接測(cè)序法檢測(cè)患者HBV P區(qū)基因突變狀態(tài)。結(jié)果188例經(jīng)NA治療無(wú)良好應(yīng)答的CHB患者HBV P區(qū)基因突變率為71.28%（134/188），主要模式：rtL180M+rtM204V/I/S突變率為26.12%（35/134），rtM204V/I/S突變率為25.37%（34/134），rtM181T/V/S突變率為16.42%（22/134）；其中113例服用單種NA無(wú)良好應(yīng)答患者有73例發(fā)生耐藥變異（73/113，64.60%），多位點(diǎn)（3個(gè)及以上耐藥位點(diǎn)）突變率為12.33%（9/73）；75例服用多種NAs無(wú)良好應(yīng)答患者有61例發(fā)生變異（61/75，81.33%），多位點(diǎn)突變率為16.39%（10/61），多藥使用者發(fā)生耐藥突變率明顯高于單藥使用者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ2=6.631，P＜0.05）。結(jié)論在NA治療無(wú)良好應(yīng)答CHB患者中耐藥變異發(fā)生率高，且長(zhǎng)期服用多種NAs易發(fā)生多點(diǎn)突變；監(jiān)測(cè)HBV P區(qū)耐藥突變可為NA耐藥CHB患者用藥提供依據(jù)。

肝炎病毒，乙型；肝炎，乙型，慢性；核苷類(lèi)；DNA突變分析；藥物耐受性

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，但不同地區(qū)HBV流行趨勢(shì)差異很大，我國(guó)是全球HBV感染最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。目前，乙型肝炎患者遇到的最大問(wèn)題是藥物治療效果不理想，其很大原因是病毒產(chǎn)生了耐藥性。研究證實(shí)，HBV耐藥與HBV P區(qū)突變存在著密切關(guān)系[1-2]。本研究選擇對(duì)核苷類(lèi)似物（nucleoside anologue，NA）治療無(wú)良好應(yīng)答的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者為研究對(duì)象，分析其感染HBV P區(qū)的變異情況及NA類(lèi)藥物使用情況，以期為臨床合理使用NA類(lèi)藥物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集并篩選2011年10月至2013年11月在本院接受NAs[拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定、恩替卡韋（ETV）]單藥或聯(lián)合用藥治療1年以上且無(wú)良好應(yīng)答的CHB患者188例，診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[3]標(biāo)準(zhǔn)。其中男151例，女37例；平均年齡（45.8±11.1）歲。

1.2 方法

1.2.1 HBV核酸提取與DNA定量檢測(cè) 采集受檢者空腹靜脈血1 mL，注入1.5 mL無(wú)菌離心管中，于室溫靜置2 h，轉(zhuǎn)入4℃靜置1 h，8 000 r/min離心5 min，吸取200μL上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 mL無(wú)菌EP管中，-20℃保存待測(cè)；采用上海申友生物技術(shù)有限公司HBV DNA檢測(cè)試劑盒抽提HBV DNA后，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量檢測(cè)。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 HBV P區(qū)耐藥基因突變檢測(cè) 采用上海申友生物技術(shù)有限公司HBV DNA檢測(cè)試劑盒抽提HBV DNA，美國(guó)BIO-RADMyCyclerTMthermalcycler擴(kuò)增DNA，反應(yīng)條件為42℃5 min、94℃5 min后，94℃10s、55℃30 s、72℃40 s，共45個(gè)循環(huán)。用1.5%M/V瓊脂糖凝膠鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。取陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL，加入蝦堿性磷酸酶（SAP）2 μL進(jìn)行酶解后，取酶解產(chǎn)物3 μL、測(cè)序試劑bigdye 1 μL和測(cè)序引物2 μL進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：96℃1 min，96℃10 s，50℃5 s，60℃4 min，共25個(gè)循環(huán)。將測(cè)序產(chǎn)物用乙醇/EDTA-Na2法進(jìn)行純化，高度去離子甲酰胺（Hidi）10 μL溶解后，ABI 3130XL測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）直接測(cè)序，數(shù)據(jù)收集和分析軟件分別為3 130 xl Data Collection SW V3.1和Sequencing Analysis V5.4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將患者HBV DNA水平（U/mL）轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)結(jié)果（lg U/mL）進(jìn)行分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析或t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用Χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NA治療無(wú)良好應(yīng)答CHB患者HBV P區(qū)基因突變模式 188例經(jīng)NA治療無(wú)良好應(yīng)答的CHB患者HBV P區(qū)基因突變率為71.28%（134/188），其中主要有3種突變模式：rtL180M+rtM204V/I/S模式突變35例，占26.12%（35/134），rtM204V/I/S突變34例，占25.37%（34/ 134），rtA181T/V/S突變22例，占16.42%（22/134）。其他小于3例的突變模式共17種，共計(jì)23例。單點(diǎn)突變模式共6種，共計(jì)66例，占49.25%（66/134）。見(jiàn)表1。

2.2 NA治療無(wú)良好應(yīng)答CHB患者用藥情況比較 188例經(jīng)NA治療無(wú)良好應(yīng)答的CHB患者中，單一NA用藥113例，檢測(cè)出耐藥突變73例，突變率為64.60%，其中多位點(diǎn)（3個(gè)及以上耐藥位點(diǎn)）突變9例（9/73，12.33%）；多NAs用藥75例，檢測(cè)出耐藥突變61例，突變率為81.33%，其中多位點(diǎn)突變10例，占16.39%（10/61）。多NAs用藥突變率明顯高于單一NA用藥，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ2=6.631，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 NA治療無(wú)良好應(yīng)答CHB患者HBV P區(qū)基因突變模式

表2 HBV P區(qū)基因多位點(diǎn)耐藥患者用藥情況

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，HBV對(duì)NA耐藥性的產(chǎn)生與HBV P區(qū)變異密切相關(guān)[3]。本研究對(duì)188例服用NAs治療1年以上且無(wú)良好應(yīng)答的CHB患者進(jìn)行基因耐藥檢測(cè)發(fā)現(xiàn)134例出現(xiàn)突變，突變率（71.28%）顯著提高，提示NAs治療后產(chǎn)生耐藥突變是CHB患者對(duì)NAs治療無(wú)良好應(yīng)答的重要原因。

本研究主要檢測(cè)到的突變模式為rtL180M+rtM204V/ I/S、rtM204V/I/S、rtA181T/V/S，這與LAM和ADV的耐藥位點(diǎn)相匹配，可能與臨床主要應(yīng)用這兩類(lèi)藥物有關(guān)。其中最主要的兩類(lèi)突變模式rtL180M+rtM204V/I/S和rtM204V/I/S為L(zhǎng)AM耐藥的HBV P區(qū)突變模式[4-5]，提示本組患者以LAM耐藥的CHB患者為主。有研究認(rèn)為，rtV173L突變不足以導(dǎo)致LAM的耐藥，但可作為補(bǔ)償性的突變提高rtM204位點(diǎn)突變病毒的復(fù)制能力[6]，本研究中也檢測(cè)到rtV173L聯(lián)合突變3例，說(shuō)明這一突變?cè)贑HB患者中可與其他突變伴隨出現(xiàn)，但此類(lèi)突變是否可致患者免疫功能缺陷有待進(jìn)行大樣本的針對(duì)性研究證實(shí)。另外，LAM治療發(fā)生耐藥的CHB患者少見(jiàn)有rtV207I/L/G突變的報(bào)道，但在本研究中可見(jiàn)rtV207I/L/G突變11例（其中單純r(jià)tV207I/L/G 5例），提示此類(lèi)突變應(yīng)在NA耐藥的CHB患者中引起重視。本研究結(jié)果顯示，ADV耐藥突變點(diǎn)以rtA181V/T/S單點(diǎn)突變?yōu)橹?，可?jiàn)N236T聯(lián)合A181T及rtV214A單點(diǎn)突變，但未見(jiàn)N236T聯(lián)合A181V突變，這可能與LAM長(zhǎng)期應(yīng)用出現(xiàn)rtA181T變異有關(guān)[7]。相對(duì)于LAM，ADV的應(yīng)用相對(duì)較少，出現(xiàn)耐藥的概率也較低。此外，無(wú)論是單一形式還是組合形式，rtM204V/I/S突變率均最高，提示應(yīng)對(duì)這一位點(diǎn)加以保護(hù)[8-9]。

多NAs用藥患者耐藥位點(diǎn)突變率及多位點(diǎn)突變率均高于單一NA用藥組，提示應(yīng)用多種藥物并不能根本解決耐藥問(wèn)題，相反，可能導(dǎo)致多藥耐藥[10]。本研究結(jié)果顯示，LAM耐藥后改用ADV易發(fā)生多位點(diǎn)突變。且已有研究證實(shí)，對(duì)LAM耐藥的患者，改用ADV比加用ADV更易導(dǎo)致多重耐藥變異[11]，提示對(duì)未用過(guò)ADV患者LAM耐藥后應(yīng)加用ADV。

綜上所述，目前通過(guò)對(duì)乙型肝炎患者進(jìn)行HBV突變檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)臨床用藥越來(lái)越受到重視，本研究總結(jié)了NA治療無(wú)良好應(yīng)答CHB患者HBV P區(qū)突變特點(diǎn)，初步揭示了CHB患者中存在的各類(lèi)HBV P區(qū)突變模式及與NAs用藥之間存在的關(guān)聯(lián)，提示對(duì)于初治及長(zhǎng)期應(yīng)用NA類(lèi)藥物無(wú)良好應(yīng)答的患者更換藥物之前均應(yīng)進(jìn)行基因耐藥檢測(cè)，根據(jù)用藥史及臨床特點(diǎn)，合理選擇藥物，實(shí)行個(gè)體化治療，盡量避免因用藥不當(dāng)而產(chǎn)生耐藥的情況。

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Analysis on drug resistance mutation of HBV P region in CHB patients without good response to NA treatment in island area

HeJianying1，ZhouJihang1，Zhu Wangyu1，Chen Dongdong1，Huang Yanyan1，Li Shibo2
（1.Laboratyory of Cellular and Molecular Biology；2.Department of Infection，Zhejiang Zhoushan Hospital，Zhoushan 316021，China）

ObjectiveTo analyze the drug resistance mutation patterns of the HBV P region in CHB patients without good response to the nucleoside analogues（NA）treatment in Zhoushan area.MethodsSera were collected from the chronic hepatitis B （CHB）patients without good response to the NA treatment in our hospital from October 2011 to November 2013 and detected the gene mutation status of the HBV P region by using the direct sequencing method.ResultsIn 188 CHB patients without good response to the NA treatment，the gene mutation rate of HBV P region was 71.28%（134/188），the main patterns included rtL180M+ rtM204V/I/Sin35 cases（35/134，26.12%），rtM204V/I/Sin34cases（34/134，25.37%）and rtM181T/V/S in 22 cases（22/134，16.42%）；among 113 CHB patients without good response to single NA treatment，73 cases（73/113，64.60%）developed the drug resistance mutation，the incidence rate of multi-site（three ormore sites）mutations was 12.33%（9/73）；in 75 cases of multiple NAs without good response，61 cases（61/75，81.33%）developed the variation，the multiple site mutation rate was 16.39%（10/61），the drug resistance rate in the cases of multiple NAs was significantly higher than that in the cases of single NA，the differences was statistically sig nificant（Χ2=6.631，P＜0.05）．Conclusion The CHB patients without good response to the NA treatment have higher drug resistance mutation rate，moreover long term taking multiple NAs is easy to generate the multi-site drug resistance mutation；monitoring the drug resistance mutation of HBV P region can provide the basis for the medication in the patients with NA-resistant CHB patients.

Hepatitis B virus；Hepatitis B，chronic；Nucleosides；DNA mutational analysis；Drug tolerance

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.001

A

1009-5519（2015）16-2409-03

2015-05-19）

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本刊編輯部

浙江省科技廳項(xiàng)目（2011C37030、2013C37079）。

何劍營(yíng)（1986-），男，浙江舟山人，主要從事臨床分子診斷、基因組學(xué)研究；E-mail：hjyncmcstudent@163.com。

李世波（E-mail：lsb0398@126.com）。