朱旅聰，劉學(xué)紅，張泳，何淑英

（1.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院，浙江紹興312000；2.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興312000；3.紹興市計劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站，浙江312000）

TRAIL、MAP-2和Nestin在流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)及意義

朱旅聰1，劉學(xué)紅2，張泳2，何淑英3

（1.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院，浙江紹興312000；2.紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興312000；3.紹興市計劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站，浙江312000）

目的探討腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）、微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）和巢蛋白（Nestin）與自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)絨毛發(fā)育的關(guān)系。方法選擇2007年6月至2008年6月在浙江省紹興市計劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站門診接受自然流產(chǎn)的患者40例及同期進(jìn)行人工流產(chǎn)的患者60例（作為對照）。應(yīng)用免疫組化法檢測第40～90天自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者胎盤絨毛和蛻膜組織中TRAIL、MAP-2和Nestin的表達(dá)，并分析其分布規(guī)律。結(jié)果妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織中少數(shù)細(xì)胞TRAIL呈陽性表達(dá)，自然流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織中多數(shù)細(xì)胞TRAIL呈陽性表達(dá)；人工流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈陰性表達(dá)，自然流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈廣泛陽性表達(dá)；人工流產(chǎn)患者絨毛組織中位于絨毛腔、緊靠細(xì)胞滋養(yǎng)層血管內(nèi)皮細(xì)胞Nestin呈陽性表達(dá)，自然流產(chǎn)患者絨毛腔內(nèi)僅少量血管內(nèi)皮細(xì)胞Nestin呈弱陽性表達(dá)。結(jié)論TRAIL、MAP-2和Nestin的表達(dá)狀況與絨毛組織細(xì)胞發(fā)育及妊娠關(guān)系密切。

流產(chǎn)，自然；絨毛膜；微管相關(guān)蛋白質(zhì)類；TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；免疫組織化學(xué)

自然流產(chǎn)是常見妊娠并發(fā)癥，在育齡婦女中發(fā)病率高，其中不明原因自然流產(chǎn)占自然流產(chǎn)發(fā)生率的50%。胎盤是胎兒與母體的接觸面，絨毛的正常發(fā)育是胚胎正常發(fā)育的前提和關(guān)鍵。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）及其受體在調(diào)節(jié)母胎界面細(xì)胞凋亡、維持母胎界面免疫耐受中具有重要作用[1-2]。微管相關(guān)蛋白 2（microtubules related protein 2，MAP-2）作為細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白，參與了細(xì)胞分化、發(fā)育及衰老過程，反映細(xì)胞內(nèi)微管的變化狀況[3-4]。巢蛋白（Nestin）作為干細(xì)胞標(biāo)記蛋白分子，反映細(xì)胞的增殖、分化狀況[5]。目前，TRAIL、MAP-2和Nestin廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的研究[6-9]，但有關(guān)TRAIL、MAP-2和Nestin與流產(chǎn)關(guān)系的研究較少。本研究聯(lián)合應(yīng)用TRAIL、MAP-2和Nestin 3種蛋白研究其在人工流產(chǎn)和自然流產(chǎn)胎盤組織中的表達(dá)及分布規(guī)律，旨在探索自然流產(chǎn)等病理性妊娠的發(fā)生機(jī)制，為自然流產(chǎn)的診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年6月至2008年6月在浙江省紹興市計劃生育宣傳技術(shù)指導(dǎo)站門診接受自然流產(chǎn)的患者40例及同期進(jìn)行人工流產(chǎn)的患者60例（作為對照）?；颊吣挲g20～35歲，身體健康，月經(jīng)規(guī)律（月經(jīng)周期28～30 d），經(jīng)婦科檢查均排除陰道炎、宮頸糜爛和宮頸息肉等其他妊娠并發(fā)癥，3個月內(nèi)未服用甾體類藥物，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。經(jīng)婦科、B超檢查證實為宮內(nèi)妊娠且符合孕周（第40～90天）。

1.2 方法

1.2.1 取材 吸宮術(shù)后分別迅速取大小0.5 cm×0.5 cm胎盤絨毛、蛻膜組織放于預(yù)先配好的10%中性甲醛水溶液（pH=7.4）內(nèi)固定4～6 h后脫水、包埋，制成蠟塊。

1.2.2 免疫組化染色 將制備好的各組絨毛和蛻膜組織蠟塊進(jìn)行石蠟切片，厚4 μm，每例標(biāo)本取8片，進(jìn)行免疫組化染色[TRAIL山羊抗人多克隆抗體、MAP-2和 Nestin小鼠抗人單克隆抗體（一抗）及其輔助試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司]。TRAIL免疫組化染色采用SP法，即切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）滅活內(nèi)源性酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗（1∶100）及生物素化山羊抗兔血清（二抗），滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，在以上各步驟之間均用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，用自來水沖洗，蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。MAP-2和Nestin免疫組化染色采用PV法，即切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，滴加一抗（1∶130）及PV6002，DAB顯色，在以上各步驟之間均用PBS洗滌3次，每次5 min；蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 切片經(jīng)染色后TRAIL、MAP-2和Nestin表達(dá)陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或褐黃色，細(xì)胞核不著色。妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛組織的合體滋養(yǎng)層和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育正常，細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；自然流產(chǎn)患者絨毛組織完整結(jié)構(gòu)受到不同程度破壞，絨毛組織的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞不完整或缺失。

2.2 TRAIL在絨毛和蛻膜組織中的表達(dá) 妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織內(nèi)少數(shù)細(xì)胞TRAIL呈陽性表達(dá)，自然流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織內(nèi)多數(shù)細(xì)胞TRAIL呈陽性表達(dá)，且陽性表達(dá)與孕齡無關(guān)，見圖1～4。

2.3 MAP-2在絨毛組織中的表達(dá) 妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈陰性表達(dá)，見圖5；自然流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈廣泛陽性表達(dá)，見圖6。

圖1 妊娠第65天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中TRAIL呈陽性表達(dá)（SP，400×）

圖2 妊娠第65天自然流產(chǎn)患者絨毛組織中TRAIL呈陽性表達(dá)（SP，400×）

圖3 妊娠第45天人工流產(chǎn)患者蛻膜組織中TRAIL呈陽性表達(dá)（SP，400×）

圖4 妊娠第45天自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中TRAIL呈陽性表達(dá)（SP，400×）

圖5 妊娠第74天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈陰性表達(dá)（PV，400×）

圖6 妊娠第74天自然流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈陽性表達(dá)（PV，400×）

2.4 Nestin在絨毛組織中的表達(dá) 妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中位于絨毛腔、緊靠細(xì)胞滋養(yǎng)層血管內(nèi)皮細(xì)胞Nestin呈陽性表達(dá)，見圖7；自然流產(chǎn)患者絨毛腔內(nèi)僅少量血管內(nèi)皮細(xì)胞Nestin呈弱陽性表達(dá)，見圖8。

圖7 妊娠第60天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中Nestin呈陽性表達(dá)（PV，400×）

圖8 妊娠第60天自然流產(chǎn)患者絨毛組織中Nestin呈弱陽性表達(dá)（PV，400×）

3 討 論

正常妊娠者胎盤絨毛和蛻膜組織中存在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的動態(tài)平衡過程，若細(xì)胞凋亡異常增高打破這一平衡狀態(tài)將會引發(fā)自然流產(chǎn)。TRAIL參與了腫瘤的發(fā)病機(jī)制、感染性疾病的炎癥過程、胚胎組織的發(fā)育過程、組織細(xì)胞凋亡調(diào)控過程等，尤其在胚胎植入過程中TRAIL在誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞及滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡過程中具有重要作用[10-12]。TRAIL基因是腫瘤壞死因子家族新成員，與FasL具有高度同源性，定位于人類染色體3q26，包含281個氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白，目前發(fā)現(xiàn)，其有DR4（TRAILR1）、DR5（TRAILR2）、DcR1（TRAILR3）、DcR2（TRAILR4）和骨保護(hù)素（TRAILR5）5種受體，各自具有不同的生物學(xué)活性并發(fā)揮不同作用[13]。本研究結(jié)果顯示，TRAIL在自然流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織中陽性表達(dá)強(qiáng)于人工流產(chǎn)患者。與高巍等[14]報道的“反復(fù)自然流產(chǎn)組絨毛組織中TRAIL表達(dá)較強(qiáng)”的結(jié)果基本一致。張晉平等[15]報道，TRAIL具有將蛻膜基質(zhì)細(xì)胞阻滯在G0/G1期、抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖并促使其凋亡的功效。說明在胚胎正常發(fā)育階段胎盤作為胎兒與母體間進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫調(diào)節(jié)和生物合成的重要器官，不僅是產(chǎn)生TRAIL的場所，也是TRAIL的靶器官。少量的TRAIL表達(dá)，誘導(dǎo)胎盤絨毛和蛻膜組織細(xì)胞對抗凋亡，維持正常發(fā)育。當(dāng)自然流產(chǎn)發(fā)生，迅速啟動了TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，誘發(fā)大量細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動及細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞功能方面具有非常重要的作用。MAP-2作為細(xì)胞骨架系統(tǒng)重要成分之一，是一種高度保守蛋白，在維持微管動力學(xué)穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中MAP-2呈陰性表達(dá)，自然流產(chǎn)患者絨毛組織中 MAP-2呈廣泛陽性表達(dá)。說明妊娠第40～90天胎盤絨毛和蛻膜組織中細(xì)胞微管聚合及解聚活動能力相對較弱，與早期絨毛侵襲性生長比較，該期絨毛生長能力明顯下降，處于相對靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)自然流產(chǎn)發(fā)生后胎盤絨毛和蛻膜組織中細(xì)胞受到TRAIL等各種凋亡信號的調(diào)控，細(xì)胞中維持細(xì)胞形態(tài)的微管等細(xì)胞骨架成分發(fā)生改變。吳旭等[16]報道，MAP-2 mRNA在大鼠腦損傷后30 min表達(dá)增強(qiáng)，傷后2d達(dá)峰值，并維持高水平表達(dá)至傷后7d。錢軍等[17]報道，大鼠脊髓損傷后損傷區(qū)MAP-2表達(dá)先降低后升高，可能與損傷后突觸結(jié)構(gòu)重建及受損神經(jīng)功能代償和修復(fù)作用有關(guān)。MAP-2在自然流產(chǎn)患者絨毛組織中表達(dá)增強(qiáng)，提示自然流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜組織可能也存在與神經(jīng)細(xì)胞相同的損傷修復(fù)過程。

Nestin屬第Ⅵ類中間絲蛋白，與細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)，參與定位和運(yùn)行亞細(xì)胞器，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生存和分化。本研究結(jié)果顯示，妊娠第40～90天人工流產(chǎn)患者絨毛組織中大量血管內(nèi)皮細(xì)胞Nestin呈陽性表達(dá)。Suzuki等[18]報道，Nestin在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)而在成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)，并認(rèn)為Nestin可作為新生血管的標(biāo)志蛋白。說明妊娠第40～90天絨毛組織中仍有部分血管處于發(fā)育形成階段，該期絨毛組織較脆弱。而同期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞Nestin陽性表達(dá)少且弱。說明絨毛組織細(xì)胞受到外界或內(nèi)在因素影響，多條細(xì)胞凋亡通路啟動，絨毛組織中新生血管內(nèi)皮祖細(xì)胞能力下降，新生血管數(shù)量減少，組織缺血、缺氧，影響了胚胎發(fā)育，誘發(fā)自然流產(chǎn)。

總之，TRAIL、MAP-2和Nestin表達(dá)狀況與絨毛組織細(xì)胞發(fā)育及妊娠發(fā)展關(guān)系密切。

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Expression and significance of TRAIL，MAP-2 and Nestin in chorionic villus tissue of abortion patients

Zhu Lvchong1，Liu Xuehong2，Zhang Yong2，He Shuying3
（1.Affiliated Hospital of Shaoxing University，Shaoxing，Zhejiang 312000，China；2.Medical College of Shaoxing University，Shaoxing，Zhejiang 312000，China；3.Shaoxing Municipal Guidance Station of Family Planning Publicity Technique，Zhejiang 312000，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between TNF-related apoptosis inducing ligand（TRAIL），microtubules related protein 2（MAP-2）and Nestin with chorionic villus development in the spontaneous abortion and artificial abortion．Methods40 cases of spontaneous abortion and contemporaneous 60 cases of artificial abortion as the controls in the outpatient department of the Shaoxing Municipal Guidance Station of Family Planning Publicity Technique were selected and detected the expressions of TRAIL，MAP-2 and Nestin in the decidual and chorionic villus tissues on pregnant 40-90 d by using the immunohistochemistry.The distribution rule was analyzed.ResultsTRAIL was positively expressed in the minority cells of the decidual and chorionic villus tissues on pregnant 40-90 d in the patients with artificial abortion，while the majority cells of the decidual and chorionic villus tissues in the patients with spontaneous abortion showed the TRAIL positive expression；MAP-2 was negatively expressed in the chorionic villus tissue of the patients with artificial abortion，but MAP-2 showed extensively positive expression in the chorionic villus tissue of the patients with spontaneous abortion；Nestin was positively expressed in the intervillous lacuna and close to cytotrophoblast vascular endothelial cells of the patients with artificial abortion，while Nestin showed weakly positive expression only in minority vascular endothelial cells of the intervillous lacuna in the patients with spontaneous abortion.ResultsThe expressional situation of TRAIL，MAP-2 and Nestin in the decidual and chorionic villus tissues is closely related to the chorionic villus tissue cell development and pregnancy.

Abortion，spontaneous；Chorion；Microtubule-associated proteins；TNF-related apoptosis-inducing ligand；Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.17.001

A

1009-5519（2015）17-2569-03

2015-04-22）

浙江省教育廳項目（Y201328640）；浙江省紹興市哲學(xué)科學(xué)規(guī)劃項目（125071）。

朱旅聰（1990-），女，浙江仙居人，主要從事早期妊娠及放射醫(yī)學(xué)方面的研究；E-mail：644921468@qq.com。

張泳（E-mail：hhren6588@sina.com）。