高文勇

(武漢市漢口醫(yī)院 神經(jīng)內科，湖北 武漢 430010)

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腎上腺皮質激素對脊髓炎患者血清NMO-IgG抗體檢測的影響

高文勇

(武漢市漢口醫(yī)院 神經(jīng)內科，湖北 武漢 430010)

目的 腎上腺皮質激素對視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)患者血清中NMO-IgG抗體檢測研究影響。方法 收集武漢市漢口醫(yī)院中臨床診斷為視神經(jīng)脊髓炎的患者30例，按隨機數(shù)字表法分為腎上腺皮質激素組和對照組，每組15例。腎上腺皮質激素組患者在常規(guī)治療的基礎上給予腎上腺皮質激素治療，對照組患者給予常規(guī)治療。底物為穩(wěn)定表達人源水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)的人胚腎293(human embryonic kidney 293，HEK293)細胞株，患者血清NMO-IgG水平的檢測采用間接免疫熒光法。結果 30例視神經(jīng)脊髓炎患者血清NMO-IgG陽性19例(63.3%)，血清抗體滴度為1:115～1:6355。腎上腺皮質激素組視神經(jīng)脊髓炎患者血清NMO-IgG陽性率(86.7%)高于對照組患者(40.0%)(χ2=7.03，P<0.05)。結論 腎上腺皮質激素有助于NMO-IgG抗體的檢測，可以提高臨床診斷率。

腎上腺皮質激素；脊髓炎；NMO-IgG；水通道蛋白-4

腎上腺皮質激素簡稱皮質激素，其包括糖皮質激素以及鹽皮質激素，糖皮質激素類藥物有較強的抗炎作用。腎上腺皮質激素對感染性、化學性、物理性、免疫性或無菌性反應等原因引起的炎癥，包括炎癥病理發(fā)展過程的不同階段有著顯著的非特異性抑制作用。糖皮質激素通過對炎癥抑制蛋白及某些靶酶的影響和對細胞因子及黏附分子的影響來實現(xiàn)抗炎癥作用。糖皮質激素能夠通過與細胞膜的非特異作用發(fā)揮抗炎作用，其在炎癥疾病中有廣泛的應用。糖皮質激素的主要作用是對炎癥反應的抑制，當有較高的糖皮質激素濃度時，其能通過嵌入細胞膜從而對膜相關蛋白的理化性質以及活性進行改變，如對鈣-ATP酶和鈉-鉀-ATP酶的改變[1]，導致異常的離子跨膜轉運，對免疫細胞的功能以及減輕炎癥反應有抑制作用[2]、使血液中的乳酸濃度降低[3]。

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica，NMO)又稱為Devic綜合癥，是對脊髓和視神經(jīng)選擇性侵犯的疾病，其能對脊髓和視神經(jīng)選擇性地累積，復發(fā)率高，Devic綜合癥為特發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，其病因病機尚不清楚。視神經(jīng)脊髓炎為一種嚴重的單相病程疾病，近年來研究顯示，NMO患者血清中有特異性的視神經(jīng)脊髓炎-免疫球蛋白G(neuromyelitisoptica-immunoglobulin G，NMO-IgG)存在，即水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)抗體[4-5]。水通道蛋白-4抗體能夠對疾病預后進行預測，以及作為反映疾病活動和評價藥物療效的指標[6-7]。NMO-IgG的發(fā)現(xiàn)不但為NMO的診斷提供了支持標準，也為進一步了解NMO提供了有效途徑。本文探討腎上腺皮質激素對脊髓炎患者血清NMO-IgG抗體檢測的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年8月～2014年2月武漢市漢口醫(yī)院符合NMO診斷標準[8]的30例NMO患者作為研究對象，其中男性12例，女性18例；發(fā)病年齡11～70歲，平均發(fā)病年齡為(31.2±11.3)歲；病程0.3～34年，平均(14.5±8.0)年；發(fā)病次數(shù)為2～17次，平均(10.6±3.5)次。排除對象：存在肝腎功能嚴重損害的患者；存在嚴重精神病，無法自主用語言交流的患者；在實驗前1周內服用過類似激素類藥物的患者。所有患者按隨機數(shù)字表法分為腎上腺皮質激素組和對照組，每組15例。2組患者在年齡、性別、病史、病程以及工作等方面差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)過倫理委員會批準并獲得患者知情同意。

1.2 材料 人胚腎293(HEK293)細胞株(購自上海研謹生物科技有限公司)，總RNA、質粒pEGFP-N1(購自軍事科學院)，甲潑尼龍片(批號H20100730，購自Pfizer Italia s.r.l)，吐溫-20、PBS、DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶(購自Gibico公司);限制性內切酶NheI連接酶，DNA marker DL 2000均(購自TaKaRa公司); Trizol，LipofectamineTM2000，Alex568標記的山羊抗人IgG均(購自Invitrogen公司);兔源抗AQP4多克隆抗體，羅丹明標記的山羊抗兔IgG(購自Millipore公司)，多聚賴氨酸(購自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司)；牛血清白蛋白(購自上海遠慕生物科技有限公司)；多聚甲醛(購自上海撫生實業(yè)有限公司)，6孔板、瓊脂糖、質粒提取試劑盒(Sant Cruz)，熒光顯微鏡XSP-63X(購自奧林巴斯，日本)；紫外凝膠成像儀(購自Vilber Lourmat 公司，法國)；紫外分光光度儀(購自ShimadzuUV-2201型，日本)；電泳儀(購自北京東方儀器廠)；流式細胞儀(購自德國Thermo電器公司)。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：2組患者均予以維生素C、硫唑嘌呤等口服常規(guī)治療，腎上腺皮質激素組患者在常規(guī)治療的基礎上給予腎上腺皮質激素治療，500～1000 mg/d，靜脈滴注，連用3～5 d，后用大劑量潑尼松口服1 mg/d，早晨1次頓服，持續(xù)4～6周，之后緩慢減量，縮至5 mg/周，直至減完?；颊弋斕斐槿?5 mL 靜脈血，經(jīng)超速離心，取上層血清置凍存管中于-80 ℃冰箱貯存。

1.3.2 穩(wěn)定表達水通道蛋白-4的HEK293細胞株的建立：參考趙忙所[9]等建立的方法，本次試驗操作如下：采用RT-PCR將總RNA擴增為AQP4的cDNA，以此為模板擴增AQP4基因。①獲取AQP4基因：AQP4亞型a擴增的上游引物為：5’-CCTAGCTAGCGATGAGTGACAGACCCACAGC-3’，內含NheI酶切位點;下游引物為： 5’-TCCGCTCGAGTACTGAAGACAATACCT-CTCC-3’，內含NheI酶切位點；②鑒定并構建重組質粒：AQP4亞型a和質粒pEGFP-N1分別以限制性內切酶NheⅠ和XhoⅠ37 ℃雙酶切過夜， T4連接酶16 ℃連接4～5 h，連接產物轉化到感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，終濃度為5 mg/L的硫酸卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)過夜，提抽質粒，PCR、雙酶切鑒定，陽性克隆送檢測序鑒定；③進行細胞轉染和抗生素篩選；將重組質粒轉染到HEK293細胞中，同時以空質粒pEGFP-N1為對照。終濃度為800 mg/L的G418篩選穩(wěn)定表達株，時間為14d，以后400 mg/L維持；④聯(lián)合流式細胞儀篩選穩(wěn)定表達株：為了提高穩(wěn)定轉染率，應用流式細胞儀分選，激發(fā)光波長為488 nm；⑤用間接免疫熒光法測定AQP4的表達：將生長至50%～70%HEK293細胞置于多聚賴氨酸處理玻片時，多聚甲醛固定，封閉，抗體反應，熒光顯微鏡下觀察；⑥定位AQP4-GFP融合蛋白的細胞：于488 nm激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞株AQP4-GFP融合蛋白是否具有膜定位效應；⑦檢測脊髓炎患者血清中AQP4抗體的順序進行相關細胞株的建立。期間應注意在篩選穩(wěn)定表達株時，激光波長為488 nm，而在熒光下測定AQP4的表達時，其激光的波長則以420～490 nm(藍光)和535～550 nm(綠光)為佳，以達到促進細胞的轉染和提高鑒定準確性的目的。

1.3.3 NMO-IgG的檢測：采用質量濃度為0.1 g/L的多聚賴氨酸浸泡事先準備好的蓋玻片，浸泡時間為(30±5)min，蓋玻片的規(guī)格為23 mm×23 mm，熱風吹干，在6孔細胞培養(yǎng)板內放置蓋玻片。迅速在培養(yǎng)板中放置上述方法建立的穩(wěn)定表達AQP4的HEK 293細胞株(1×105個/mL)，接著進行一般模式的培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基)，當細胞與培養(yǎng)板接觸面積達55%～75%時，則去除其中的DMEM培養(yǎng)液，期間應注意避免感染，然后用含有40 g/L多聚甲醛的PBS固定液進行細胞的固定，固定時間為15 min，溫度為室溫，PBS洗滌液進行3次洗滌；牛血清白蛋白的PBS封閉液在室溫下孵育上述已固定好的細胞，孵育時間為2 h。

將患者血清用牛血清白蛋白的PBS封閉液進行等倍稀釋，然后在室溫下緩慢加入到上述固定的細胞中，2 h后重復上述步驟，每份樣品重復2次；將體積分數(shù)為0.01%的表面活性劑吐溫-20與PBS洗滌液進行混勻，然后對上述稀釋好的細胞進行等量的3次洗滌，接著再用含30 g/L牛血清白蛋白的磷酸緩沖溶液稀釋Alex568標記的山羊抗人IgG(1:4000)，培養(yǎng)時間為1 h，溫度為室溫；用上述配制好的PBS洗滌液再次進行3次洗滌；完成后在10 min之內將其進行熒光檢測，依據(jù)國際標準[7]轉染重組質粒的細胞，抗原抗體反應后熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光為藍光(420～490 nm)時，細胞表面呈綠色熒光;激發(fā)光為綠光(535～550 nm)時，細胞表面呈現(xiàn)為紅色熒光，2者于細胞膜的位置重合良好，重合后呈黃色，陽性細胞強綠光，陰性為不著色的或者呈紅色。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析，樣本率的比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AQP4綠色熒光蛋白融合蛋白的細胞定位 在激發(fā)光波長為488 nm條件下，轉染空質粒pEGFP-N1的HEK293細胞內GFP充滿整個細胞，無明顯的局部定位;轉染重組質粒的HEK293細胞綠色熒光明顯定位于細胞膜區(qū)域，并且表達量比較高。見圖1。

圖1 AQP4-GFP融合蛋白的細胞定位(×600)Fig.1 Cellular localization of AQP4-GFP fusion protein(×600)

2.2 血清NMO-IgG檢測 患者血清NMO-IgG免疫熒光檢測陽性、陰性結果見圖2。30例視神經(jīng)脊髓炎患者血清NMO-IgG陽性19例(63.3%)，血清抗體滴度檢測范圍為1:115～1:6355。血清NMO-IgG檢測的靈敏度和特異性分別為45.5%和100%，腎上腺皮質激素組NMO-IgG的陽性率為86.7%(13/15)，對照組NMO-IgG的陽性率為40.0%(6/15)。腎上腺皮質激素組視神經(jīng)脊髓炎患者血清NMO-IgG陽性率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.03，P<0.05)，見表1。

圖2 患者血清NMO-IgG免疫熒光定性檢測結果(×400)Fig.2 Results of serum NMO-IgG measured by immunofluorescence qualitative(×400)

組別NMO-IgG陽性例數(shù)NMO-IgG陰性例數(shù)陽性率(%)對照組6940.0腎上腺皮質激素組13286.7

3 討論

伴隨實驗技術的發(fā)展，NMO中NMO-IgG的致病作用逐漸被研究人員所熟知，為臨床提供了NMO鑒別和診斷的依據(jù)。體外研究表明，人星形膠質細胞能夠與NMO-IgG特異性結合并引起水通道蛋白-4可逆性內陷[10-11]。且在人體的胃部和腎臟中多有發(fā)現(xiàn)，但在NMO患者的腎臟和胃部中未曾發(fā)現(xiàn)。此外，在水通道蛋白-4的定位研究中報道其高密度分布在患者的大腦皮層、隔核和小腦顆粒細胞層等處[12-13]。Lennon等[4]報道了在大鼠實驗中，采用間接免疫熒光法檢測NMO患者體內存在特異性的NMO-IgG，且其靈敏度和特異性分別為73%和91%。

患者的臨床表現(xiàn)、NMO-IgG和核磁共振檢查為視神經(jīng)脊髓炎的主要鑒別診斷途徑，Matsuoka等[14]在參考了Lennon法的前提下對其相對特異性和靈敏度進行了計算，結果分別為100%和83.3%，此結果表明以AQP4為底物進行檢測，此方法簡單、有效、可靠。并且，此次結果與Jarius[15]、Papeix[16]、Shimizu[17]、Warabi等[18]的研究結果相一致。

近些年研究表明，NMO-IgG可以在患者體內血清中檢出且復發(fā)時其滴度升高[19]。在本次研究中，NMO患者的IgG滴度低于國外文獻中報道的1:12800[20]，分析其原因，可能為在本次研究所選用的熒光顯微鏡的靈敏度(45.5%)顯著低于其他文獻中的激光共聚焦顯微鏡，故而其所檢測出來的滴度會明顯偏低。且Weinstock-Guttma等[7]研究報道了患者體內的IgG陽性與患者的疾病活動能力呈正相關的趨勢，當患者處于抑制劑治療時其體內的IgG呈陰性，其他時期為陽性。此外，腎上腺皮質激素可以和細胞漿糖皮質激素受體特異性結合從而發(fā)揮其抗炎作用。且在其發(fā)生抗炎作用的同時其作用途徑存在著復雜的聯(lián)系，如其在不同的細胞系、作用時相或是不同程度的刺激下的作用強度亦不完全相同，關于腎上腺皮質激素的抗炎作用會成為其未來研究的重要靶點用于臨床研究。

綜上所述，隨著科學技術的不斷改進和醫(yī)療設備的不斷完善，AQP4在臨床檢測的意義不斷加深，它不但可以作為疾病活動能力的檢測指標，也可以作為其治療效果的評定標準，而NMO-IgG的發(fā)現(xiàn)更為此提供了規(guī)范化的檢測標準，使得本課題組對AQP4了解和掌握加深了一個層次，為今后的臨床研究奠定了基礎，提供了指導性建議。

[1] Whiting KP,Restall CJ,Brain PF.Steroid hormone-induced effects on membrane fluidity and their potential roles in non-genomic mechanisms[J].Life sciences,2000,67(7):743-757.

[2] Croxtall JD,Choudhury Q,Flower RJ.Glucocorticoids act within minutes to inhibit recruitment of signalling factors to activated EGF receptors through a receptor-dependent,transcription-independent mechanism[J]. Br J Pharmacol,2000,130(2):289-298.

[3] 崔志新，陳偉杰.小劑量糖皮質激素對嚴重感染性休克患者乳酸清除率及預后的影響[J].實用醫(yī)學雜志，2012，28(18)：3055-3057.

[4] Lennon VA,Wingerchuk DM,Kryzer TJ,et al.A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis[J].Lancet,2004,364(9451):2106-2112.

[5] Lennon VA,Kryzer TJ,Pittock SJ,et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel[J].J Exp Med,2005,202(4):473-477.

[6] Ghezzi A,Bergamaschi R,Martinelli V,et al.Clinical characteristics,course and prognosis of relapsing Devic’s neuromyelitis optica[J].J Neurol,2004,251(1):47-52.

[7] Weinstock-Guttman B,Miller C,Yeh E,et al.Neuromyelitis optica immunoglobulins as a marker of disease activity and response to therapy in patients with neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2008,14(8):1061-1067.

[8] Wingerchuk DM,Hogancamp WF,O’brien PC,et al.The clinical course of neuromyelitis optica (Devic’s syndrome)[J].Neurology,1999,53(5):1107-1114.

[9] 趙忙所，孫朝暉，耿同超.穩(wěn)定表達水通道蛋白-4 HEK293細胞株的建立及應用[J].細胞與分子免疫學雜志，2010，26(1)：68-70.

[10] Hinson SR,Roemer SF,Lucchinetti CF,et al.Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2[J].J Exp Med,2008,205(11):2473-2481.

[11] Vincent T,Saikali P,Cayrol R,et al.Functional consequences of neuromyelitis optica-IgG astrocyte interactions on blood-brain barrier permeability and granulocyte recruitment[J].J Immunol,2008,181(8):5730-5737.

[12] Costa C,Tortosa R,Domènech A,et al.Mapping of aggrecan,hyaluronic acid,heparan sulphate proteoglycans and aquaporin 4 in the central nervous system of the mouse[J]. J Chem Neuroanat,2007,33(3):111-123.

[13] Weinshenker BG,Wingerchuk DM,Vukusic S,et al.Neuromyelitis optica IgG predicts relapse after longitudinally extensive transverse myelitis[J].Ann Neurol,2006,59(3):566-569.

[14] Matsuoka T,Matsushita T,Kawano Y,et al.Heterogeneity of aquaporin-4 autoimmunity and spinal cord lesions in multiple sclerosis in Japanese[J].Brain,2007,130(Pt 5):1206-1223.

[15] Jarius S,Probst C,Borowski K,et al.Standardized method for the detection of antibodies to aquaporin-4 based on a highly sensitive immunofluorescence assay employing recombinant target antigen[J].J Neurol Sci,2010,291(1):52-56.

[16] Papeix C,Vidal JS,Deseze J,et al.Immunosuppressive therapy is more effective than interferon in neuromyelitis optica[J].Mult Scler,2007,13(2):256-259.

[17] Shimizu Y,Yokoyama K,Misu T,et al.Development of extensive brain lesions following interferon beta therapy in relapsing neuromyelitis optica and longitudinally extensive myelitis[J].J Neurol,2008,255(2):305-307.[18] Warabi Y,Matsumoto Y,Hayashi H.Interferon beta-1b exacerbates multiple sclerosis with severe optic nerve and spinal cord demyelination[J].J Neurol Sci,2007,252(1):560-561.

[19] Jarius S,Aboul-Enein F,Waters P,et al.Antibody to aquaporin-4 in the long-term course of neuromyelitis optica[J].Brain,2008,131(11):3072-3080.

[20] Saini H, Rifkin R, Gorelik M, et al. Passively transferred human NMO-IgG exacerbates demyelination in mouse experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. BMC Neurology, 2013, 13(10): 104.

(編校：王儼儼)

Effect of adrenocortical hormone on detection of NMO-IgG in neuromyelitisoptica patients

GAO Wen-yong

(Department of Neurology, Hankou Hospital of Wuhan, Wuhan 430010, China)

ObjectiveTo evaluate the effect of adrenocortical hormone on detection of NMO-IgG in neuromyelitis optica (NMO) patients. Methods30 cases with NMO collected in the hospital according to the figures were randomly divided into adrenocorticotropic hormone group and control group, 15 cases in each group. adrenocorticotropic hormone group were given glucocorticoid therapy on the basis of conventional therapy. The control group were treated with conventional therapy, and The serum NMO-IgG levels were detected by indirect immunofluorescence taking stable expression of human origin aquaporin -4 (AQP4) in human embryonic kidney 293 (HEK293) cell line as substrate. Results19 cases (63.3%) serum NMO-IgG positive patients in 30 cases with spinal cord inflammation, serum antibody titers from 1:115 to 1:6355. The positive rate of serum NMO-IgG in adrenocorticotropic hormone group was 86.7%, which was higher than 40.0% in control group (χ2=7.03，P<0.05). ConclusionThe adrenocortical hormone could help the detection of NMO-IgG antibody and increase the efficiency of clinical diagnosis.

adrenocortical hormone; neuromyelitis optica; NMO-IgG; aquaporin-4

高文勇，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管病及脊髓疾病診治，E-mail: gwyhp07@163.com。

R972

A

1005-1678(2015)06-0130-04