任麗萍，范慧紅

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

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多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究思路探討

任麗萍，范慧紅Δ

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

本綜述在系統(tǒng)總結近年來國內外有關指紋圖譜研究文獻和多組分生化藥注射劑質控現狀的基礎上，結合實驗室工作積累，探索性地提出了多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜的研究思路，以期進一步推動多組分生化藥注射劑特征圖譜相關研究工作的開展。

多組分生化藥注射劑；指紋圖譜；特征圖譜；研究思路；質量控制

多組分生化藥是一類原材料來源于人、動物的組織或者體液，或者通過發(fā)酵而來的非單一成分的藥品。大多數該類產品的組成成分不完全明確，按照化學藥品的質控方式很難控制其質量；并且動物來源、工藝條件的細小變化均有可能導致物質基礎的變化，而這些質量上的變化較難通過終產品的質量標準加以控制，從而可能會引發(fā)不可預測的不良反應。

指紋圖譜分析技術因其能夠表征中藥的整體特征性，引起了業(yè)內研究人員的廣泛重視[1-2]。這一方法已被WHO、美國FDA和中國SFDA等認同并用于評價植物藥或中藥質量的批間穩(wěn)定性[3-4]。

多組分生化藥HPLC特征圖譜建立的目的是通過對所得到的能夠體現生化藥整體特性的圖譜識別，提供一種能夠比較全面的控制生化藥質量的方法，從化學物質基礎的角度保證生化藥注射劑的穩(wěn)定和可靠。其具體方法是采用指紋圖譜技術，將生化藥內在物質特性轉化為常規(guī)數據信息，用于生化藥鑒別和質量評價。

1 多組分生化藥注射劑質控現狀

按國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的藥品注冊管理辦法規(guī)定：天然生化藥物有兩大類：①天然物質中提取或通過發(fā)酵提取的有效單體及其制劑，此類生化藥物要按照化學藥品的注冊辦法審評；②由人、動物的組織或者體液提取的，或者通過發(fā)酵制備的具有生物活性的多組分制品，此類生化藥物要按新生物制品注冊辦法審評。

多組分生化藥的研究應該參照已頒布執(zhí)行的《化學藥品注射劑及多組分生化藥注射劑基本技術標準(試行)》(國食藥監(jiān)注〔2008〕7號)進行。技術標準中明確指出：申報單位提供的研究資料應能證明各批次產品質量的均一、穩(wěn)定；還指出：多組分生化藥組成復雜，為保證產品質量的相對均一，應研究采用合適的分析方法控制產品的主要成份。例如對于多肽類藥物，可采用指紋圖譜的方法控制各多肽的種類及與主成分的相對含量。

多組分生化藥注射劑的質量標準整體水平較低，除垂體后葉注射液曾收載于《中國藥典》2005年版二部外[5]，其余品種均未收載于任何國內外藥典中。目前上市的多組分生化藥中，據不完全統(tǒng)計，僅在國家藥品標準第九冊和第十六冊中收載的多組分生化藥品種就有十六種之多，見表1。這類品種的質量標準還未完全統(tǒng)一，以腦蛋白水解物注射液為例，執(zhí)行的質量標準就共有4個，分別屬于新藥轉正標準、地標升國標標準等。參照多組分生化藥新的注冊管理辦法要求，這類品種大多存在著標準不統(tǒng)一、有的同品種多個標準間尺度不統(tǒng)一，質量差異較大；標準中缺乏專屬性較強的質控項目，無法保證產品質量的相對均一等問題。

表1 多組分生化藥注射劑質量標準收載情況Tab.1 The quality specification of biochemical injection with multiple components

2 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究的必要性

2.1 開展特征圖譜研究，對多組分生化藥工藝進行評價與研究 多組分生化藥的組成、質量與原材料、提取工藝、制備工藝密切相關，僅靠成品的質量標準不能全面控制此類產品的質量，必須要結合起始原料和工藝過程的控制才能較有效地控制產品的質量，保證質量的一致性。因此起始原料的質量要求、工藝過程、原液(或原料藥)的質量控制均屬于質量控制的一部分。

由于多組分生化藥組成的復雜性，僅靠質量標準中某一種或者某一類組分難以評價其提取工藝的優(yōu)劣，進行特征圖譜研究，不僅可以說明樣品的組分、組成的一致性，闡述提取制備工藝的合理性；還可以對工藝穩(wěn)定性進行研究，以保證不同批次產品質量的重現性；此外，由于多組分生化藥注射劑多含有肽類、蛋白質、多糖等物質，這類物質在溶液或者高濕條件下降解或聚合的速度較干燥條件性更快。進行多組分生化藥的特征圖譜研究，可以詳細了解外界條件如(pH值、溫度、光照等)對生化藥物穩(wěn)定性的影響，選擇適宜的輔料來提高制劑的物理化學穩(wěn)定性和生物活性，從而對制劑處方工藝進行優(yōu)化。

2.2 進行特征圖譜研究，提高多組分生化藥質量控制的專屬性 多組分生化藥物可能包含的組分種類較多，如氨基酸、微量元素、短肽、蛋白質、酶及輔酶、多糖、激素、生長因子、脂質、核酸及其降解產物等，鑒別項目應盡可能對所含組分進行特征性鑒別。特征圖譜相似度鑒別是在多組分生化藥注射劑的質量標準的基礎上，為保證多組分生化藥注射劑在安全、有效、可控的前提下，根據多組分生化藥注射劑本身的特點新增加的一項專屬性檢驗指標。

3 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究現狀分析

有2種多組分生化藥注射劑——腦蛋白水解注射液和小牛血去蛋白提取物注射液其質量標準[6-7]的鑒別項目中規(guī)定了“供試品溶液的色譜圖應與對照溶液的色譜圖基本一致”，通過鑒別多肽等組分，對產品的一致性、均一性進行評價。但因為各家企業(yè)質量標準還未完全統(tǒng)一，不同標準中色譜分離條件不同，各企業(yè)所用的對照溶液也不一致，也缺乏量化的判定方法和標準，因此還不具有可操作性。

查閱相關文獻和質量標準，近年來以國家評價性抽驗工作公開發(fā)表的論文中[8-10]，一些多組分生化藥如骨肽注射液、胸腺肽注射劑等在采用指紋圖譜評價藥品質量方面進行了探索性研究，但因為選取樣品數量有限、不具有代表性未進行色譜分離條件的優(yōu)化,大多未進行方法學驗證研究,相似度評價參數的選擇不同等原因，結果難以在實驗室間甚至同一實驗室內重現。因此，目前還未見相關產品質量標準中收載特征圖譜相似度評價方法。

4 建立多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜方法研究思路

基于上述分析，在筆者所在實驗室相關研究工作的基礎上[11]，借鑒中藥色譜指紋圖譜研究的成果與經驗，結合多組分生化藥注射劑自身質量控制的特點，提出多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜的研究思路，見圖1。

圖1 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜方法研究流程圖Fig.1 The flow chart of HPLC specific chromatogram of biochemical injection with multiple components

多組分生化藥特征圖譜建立的內容包括：特征圖譜分析方法的建立、特征圖譜方法驗證、數據處理和分析。多組分生化藥特征圖譜按照測試樣品來源可以分為生化藥的提取物、中間體以及注射劑。其中，提取物、中間體特征圖譜主要是用于生產的內部控制、工藝評價以及質量相關性考察。

4.1 HPLC特征圖譜分析方法的建立 多組分生化藥特征圖譜應滿足專屬性、重現性。其首要目的是能體現藥品的整體特征，在滿足表征化學成分群整體性質的前提下，要求有較好的重現性，應根據重現性要求選用合適的分析方法來獲取特征圖譜。特征圖譜分析方法的可操作性系指針對不同用途，選用不同方法來達到不同的要求。

多組分生化藥注射劑特征圖譜的一般獲取過程：

① 樣品的選擇和供試品溶液的制備：征集樣品的首要前提是具有代表性，應是按照國家藥監(jiān)局批準的現行生產工藝生產的，最好提供提取液和制劑，必要時應提供中間體和輔料。供試品溶液制備的基本原則是保證其代表性和完整性，其好壞直接影響了整體分析結果的優(yōu)劣及可信程度。

② 參照峰的選擇：特征圖譜的參照峰主要用于考察特征圖譜的穩(wěn)定程度和重現性，并有助于特征圖譜的辨認。在多肽類的多組分生化藥的HPLC特征圖譜中，一般可從在紫外吸收波段有響應的色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸中篩選。參照峰一般因為峰面積較大，特征圖譜相似度軟件相似度算法是夾角余弦法，結果受大峰影響較大，因此，參照峰一般不選作共有峰。以小牛血去蛋白提取物為例，樣品和對照品疊加圖譜的典型圖譜，見圖2。最終選擇色氨酸為參照峰。

圖2 小牛血去蛋白提取物供試品和3種有紫外吸收的氨基酸對照品疊加圖譜(a.色氨酸；b.苯丙氨酸；c. 酪氨酸；d小牛血去蛋白提取液)Fig.2 Overlapped HPLC chromatograms of deproteinized hemoderivative of calf blood solution and three kinds of amino acid reference standard with ultraviolet absorption(a. tryptophan; b. phenylalanine; c. tyrosine; d. deproteinized hemoderivative of calf blood solution)

③ 特征圖譜獲?。禾卣鲌D譜試驗條件應能滿足特征圖譜的需要，不宜簡單套用含量測定用的試驗條件，試驗方法和試驗條件選擇應根據供試品的特點,設計合適的試驗方案，通過比較實驗，從中選取相對簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的特征圖譜。

以腦蛋白水解物注射液為例，其主要組分為低分子肽和游離氨基酸，因此在該品種的特征圖譜研究中，首先征集了生產工藝基本一致、具有代表性的腦蛋白水解物溶液樣品，設計梯度洗脫試驗方案，以期對其特征性的多肽組分進行完全洗脫。腦蛋白水解物濃溶液不同企業(yè)樣品的疊加圖譜，見圖3。

圖3 不同企業(yè)腦蛋白水解物供試品特征圖譜Fig.3 Specific chromatogram of cerebroprotein hydrolysate from different manufactures

以另一種多組分生化藥小牛血去蛋白提取物注射液為例，其主要組分為氨基酸、低聚肽、核苷、無機離子等，其活性是多種成分綜合作用的結果。因此在最終確定的特征鑒別方法中是梯度洗脫的方法，檢測波長采用了214 nm，目的是能夠反映該產品中的特征性組分。小牛血去蛋白提取物不同企業(yè)樣品的疊加圖，見圖4。

4.2 HPLC特征圖譜分析方法的驗證 方法驗證的目的是為了考察和證明采用的特征圖譜測定方法具有可靠性和可重復性，符合特征圖譜測定的要求。HPLC特征圖譜實驗方法驗證所包括的項目有：專屬性、精密度及耐用性等。方法驗證的具體內容應從以下3方面考察：

4.2.1 專屬性：多組分生化藥的特征圖譜一般認為分離峰越多越好，在大多數成分均能有響應的情況下，用典型的色譜圖來證明其專屬性。具體方法專屬性可考慮采用峰純度、總峰響應值等為考察參數。同時需要評價有關樣品(提取物、中間體和成品)間的相關性，并盡可能顯示出樣品中特征響應，保證其有較大響應，從而減少方法的波動帶來判別誤差。

4.2.2 精密度：精密度是指規(guī)定條件下對均質樣品多次取樣進行一系列檢測結果的接近程度。特征圖譜實驗方法的精密度通常以多次測量結果標準偏差來表達。具體精密度測量可用重復性和重現性進行考察，重復性和重現性的具體范圍應據實際情況確定。

4.2.3 耐用性：特征圖譜耐用性是指不同條件下分析同一樣品所得測試結果的變化程度。對HPLC特征圖譜，在實際驗證中首先需要考慮實驗環(huán)境、操作人員、實驗儀器及色譜柱對實驗結果的影響。特別需要考慮實驗方法本身的參數波動的影響，如流速、柱溫、流動相組成、分析溶液的穩(wěn)定性等。

4.3 數據處理和分析 指紋圖譜相似度分析目前在藥品檢驗中應用較廣的是國家藥典會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)。采用相似度評價軟件計算相似度時，若峰數較多，且最大峰面積超過總峰面積的60%，計算相似度時應考慮去除該色譜峰。對于用于鑒別的特征圖譜，若能夠提供對照提取物對照品，則優(yōu)先考慮采用對照提取物作對照，也可以對照圖譜作為對照。

5 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究的展望

本文根據指紋圖譜技術進展和多組分生化藥質控現狀，初步探索性地提出了多組分生化藥注射劑特征圖譜的研究思路，以期為該類藥品的質量控制提供更多的方法與手段。指紋圖譜技術雖已提出多年，目前在中藥注射劑的質量控制中也有一定的應用，但涉及到在多組分生化藥注射劑質量控制的應用也存在一些值得商榷的問題。在研究過程中，如何識別與藥效相關的特征峰？如何選擇色譜共有峰能最大程度的反映產品的內在質量？如何將多組分生化藥特征圖譜所獲取的化學成分特征信息與生物活性相關信息進行關聯？是否還能開發(fā)更適合多組分生化藥注射劑特征圖譜研究應用的軟件？這些都是多組分生化藥特征圖譜研究的難點，還需要在以后的研究中進行更深入的研究。

[1] Cheng YY, Chen MJ, Tong WD.An approach to comparative analysis of chromatographic fingerprints for assuring the quality of botanical drugs [J].J Chem Inf Comput Sci,2003,43(3):1068-1076.

[2] Cheng YY, Chen MJ, Welsh WJ.Fractal fingerprinting of chromatographic profiles based on wavelet analysis and its application to characterize the quality grade of medicinal herbs [J].J Chem Inf Comput Sci,2003,43(6):1959-1965.

[3] WHO.General guidelines for methodologies on research and evaluation of traditional medicine [M].Geneva：World Health Organization,2002.

[4] FDA.Guidance for industry botanical drug products[M].Center for Drug Evaluation and Research(CDER),2000.

[5] 中國藥典2005年版二部[S].2005.

[6] 國家藥典委員會.國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準第九冊[S].2003.

[7] 國家藥典委員會.國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準第十六冊[S].2003.

[8] 王常禹，岳云飛，?；萘?，等.骨肽注射液質量分析及研究[J].藥物分析雜志，2010，30(11)：2197-2200.

[9] 梁蔚陽，鄧鋒，蔣玉輝，等.腦蛋白水解物注射液質量分析[J].藥物分析雜志，2011，31(1)：190-194.

[10] 李勇，廖海明，梁成罡，等.胸腺肽注射劑反相HPLC特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2011，31(2)：288-292.

[11] 任麗萍，尼珍，范慧紅.腦蛋白水解物及其注射劑的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中國藥學雜志，2014，49(20)：1850-1853.

(編校：王冬梅)

Investigation of research method of HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components

REN Li-ping， FAN Hui-hongΔ

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

The existing literature on fingerprint chromatography at home and abroad and the quality control of biochemical injection with multiple components were reviewed in this article. Combined with the laboratory research, It is proposed that the strategy for HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components in order to provide the basis for effectively promoting the establishment and development of HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components.

biochemical injection with multiple components; fingerprint chromatography; specific chromatography; research method; quality control

中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金(2011A7)

任麗萍，女，碩士，副主任藥師，研究方向：生化藥品質量研究，E-mail：pplucky@126.com；范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥品質量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

TQ460.72

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1005-1678(2015)06-0161-04