任麗萍，范慧紅

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

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多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究思路探討

任麗萍，范慧紅Δ

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

本綜述在系統(tǒng)總結(jié)近年來國內(nèi)外有關(guān)指紋圖譜研究文獻(xiàn)和多組分生化藥注射劑質(zhì)控現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室工作積累，探索性地提出了多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜的研究思路，以期進(jìn)一步推動多組分生化藥注射劑特征圖譜相關(guān)研究工作的開展。

多組分生化藥注射劑；指紋圖譜；特征圖譜；研究思路；質(zhì)量控制

多組分生化藥是一類原材料來源于人、動物的組織或者體液，或者通過發(fā)酵而來的非單一成分的藥品。大多數(shù)該類產(chǎn)品的組成成分不完全明確，按照化學(xué)藥品的質(zhì)控方式很難控制其質(zhì)量；并且動物來源、工藝條件的細(xì)小變化均有可能導(dǎo)致物質(zhì)基礎(chǔ)的變化，而這些質(zhì)量上的變化較難通過終產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加以控制，從而可能會引發(fā)不可預(yù)測的不良反應(yīng)。

指紋圖譜分析技術(shù)因其能夠表征中藥的整體特征性，引起了業(yè)內(nèi)研究人員的廣泛重視[1-2]。這一方法已被WHO、美國FDA和中國SFDA等認(rèn)同并用于評價(jià)植物藥或中藥質(zhì)量的批間穩(wěn)定性[3-4]。

多組分生化藥HPLC特征圖譜建立的目的是通過對所得到的能夠體現(xiàn)生化藥整體特性的圖譜識別，提供一種能夠比較全面的控制生化藥質(zhì)量的方法，從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的角度保證生化藥注射劑的穩(wěn)定和可靠。其具體方法是采用指紋圖譜技術(shù)，將生化藥內(nèi)在物質(zhì)特性轉(zhuǎn)化為常規(guī)數(shù)據(jù)信息，用于生化藥鑒別和質(zhì)量評價(jià)。

1 多組分生化藥注射劑質(zhì)控現(xiàn)狀

按國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的藥品注冊管理辦法規(guī)定：天然生化藥物有兩大類：①天然物質(zhì)中提取或通過發(fā)酵提取的有效單體及其制劑，此類生化藥物要按照化學(xué)藥品的注冊辦法審評；②由人、動物的組織或者體液提取的，或者通過發(fā)酵制備的具有生物活性的多組分制品，此類生化藥物要按新生物制品注冊辦法審評。

多組分生化藥的研究應(yīng)該參照已頒布執(zhí)行的《化學(xué)藥品注射劑及多組分生化藥注射劑基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(國食藥監(jiān)注〔2008〕7號)進(jìn)行。技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中明確指出：申報(bào)單位提供的研究資料應(yīng)能證明各批次產(chǎn)品質(zhì)量的均一、穩(wěn)定；還指出：多組分生化藥組成復(fù)雜，為保證產(chǎn)品質(zhì)量的相對均一，應(yīng)研究采用合適的分析方法控制產(chǎn)品的主要成份。例如對于多肽類藥物，可采用指紋圖譜的方法控制各多肽的種類及與主成分的相對含量。

多組分生化藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)整體水平較低，除垂體后葉注射液曾收載于《中國藥典》2005年版二部外[5]，其余品種均未收載于任何國內(nèi)外藥典中。目前上市的多組分生化藥中，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)第九冊和第十六冊中收載的多組分生化藥品種就有十六種之多，見表1。這類品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還未完全統(tǒng)一，以腦蛋白水解物注射液為例，執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)就共有4個，分別屬于新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)、地標(biāo)升國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)等。參照多組分生化藥新的注冊管理辦法要求，這類品種大多存在著標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、有的同品種多個標(biāo)準(zhǔn)間尺度不統(tǒng)一，質(zhì)量差異較大；標(biāo)準(zhǔn)中缺乏專屬性較強(qiáng)的質(zhì)控項(xiàng)目，無法保證產(chǎn)品質(zhì)量的相對均一等問題。

表1 多組分生化藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載情況Tab.1 The quality specification of biochemical injection with multiple components

2 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究的必要性

2.1 開展特征圖譜研究，對多組分生化藥工藝進(jìn)行評價(jià)與研究 多組分生化藥的組成、質(zhì)量與原材料、提取工藝、制備工藝密切相關(guān)，僅靠成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能全面控制此類產(chǎn)品的質(zhì)量，必須要結(jié)合起始原料和工藝過程的控制才能較有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保證質(zhì)量的一致性。因此起始原料的質(zhì)量要求、工藝過程、原液(或原料藥)的質(zhì)量控制均屬于質(zhì)量控制的一部分。

由于多組分生化藥組成的復(fù)雜性，僅靠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中某一種或者某一類組分難以評價(jià)其提取工藝的優(yōu)劣，進(jìn)行特征圖譜研究，不僅可以說明樣品的組分、組成的一致性，闡述提取制備工藝的合理性；還可以對工藝穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以保證不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的重現(xiàn)性；此外，由于多組分生化藥注射劑多含有肽類、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，這類物質(zhì)在溶液或者高濕條件下降解或聚合的速度較干燥條件性更快。進(jìn)行多組分生化藥的特征圖譜研究，可以詳細(xì)了解外界條件如(pH值、溫度、光照等)對生化藥物穩(wěn)定性的影響，選擇適宜的輔料來提高制劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物活性，從而對制劑處方工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 進(jìn)行特征圖譜研究，提高多組分生化藥質(zhì)量控制的專屬性 多組分生化藥物可能包含的組分種類較多，如氨基酸、微量元素、短肽、蛋白質(zhì)、酶及輔酶、多糖、激素、生長因子、脂質(zhì)、核酸及其降解產(chǎn)物等，鑒別項(xiàng)目應(yīng)盡可能對所含組分進(jìn)行特征性鑒別。特征圖譜相似度鑒別是在多組分生化藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，為保證多組分生化藥注射劑在安全、有效、可控的前提下，根據(jù)多組分生化藥注射劑本身的特點(diǎn)新增加的一項(xiàng)專屬性檢驗(yàn)指標(biāo)。

3 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究現(xiàn)狀分析

有2種多組分生化藥注射劑——腦蛋白水解注射液和小牛血去蛋白提取物注射液其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6-7]的鑒別項(xiàng)目中規(guī)定了“供試品溶液的色譜圖應(yīng)與對照溶液的色譜圖基本一致”，通過鑒別多肽等組分，對產(chǎn)品的一致性、均一性進(jìn)行評價(jià)。但因?yàn)楦骷移髽I(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還未完全統(tǒng)一，不同標(biāo)準(zhǔn)中色譜分離條件不同，各企業(yè)所用的對照溶液也不一致，也缺乏量化的判定方法和標(biāo)準(zhǔn)，因此還不具有可操作性。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，近年來以國家評價(jià)性抽驗(yàn)工作公開發(fā)表的論文中[8-10]，一些多組分生化藥如骨肽注射液、胸腺肽注射劑等在采用指紋圖譜評價(jià)藥品質(zhì)量方面進(jìn)行了探索性研究，但因?yàn)檫x取樣品數(shù)量有限、不具有代表性未進(jìn)行色譜分離條件的優(yōu)化,大多未進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證研究,相似度評價(jià)參數(shù)的選擇不同等原因，結(jié)果難以在實(shí)驗(yàn)室間甚至同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)。因此，目前還未見相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中收載特征圖譜相似度評價(jià)方法。

4 建立多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜方法研究思路

基于上述分析，在筆者所在實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究工作的基礎(chǔ)上[11]，借鑒中藥色譜指紋圖譜研究的成果與經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合多組分生化藥注射劑自身質(zhì)量控制的特點(diǎn)，提出多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜的研究思路，見圖1。

圖1 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜方法研究流程圖Fig.1 The flow chart of HPLC specific chromatogram of biochemical injection with multiple components

多組分生化藥特征圖譜建立的內(nèi)容包括：特征圖譜分析方法的建立、特征圖譜方法驗(yàn)證、數(shù)據(jù)處理和分析。多組分生化藥特征圖譜按照測試樣品來源可以分為生化藥的提取物、中間體以及注射劑。其中，提取物、中間體特征圖譜主要是用于生產(chǎn)的內(nèi)部控制、工藝評價(jià)以及質(zhì)量相關(guān)性考察。

4.1 HPLC特征圖譜分析方法的建立 多組分生化藥特征圖譜應(yīng)滿足專屬性、重現(xiàn)性。其首要目的是能體現(xiàn)藥品的整體特征，在滿足表征化學(xué)成分群整體性質(zhì)的前提下，要求有較好的重現(xiàn)性，應(yīng)根據(jù)重現(xiàn)性要求選用合適的分析方法來獲取特征圖譜。特征圖譜分析方法的可操作性系指針對不同用途，選用不同方法來達(dá)到不同的要求。

多組分生化藥注射劑特征圖譜的一般獲取過程：

① 樣品的選擇和供試品溶液的制備：征集樣品的首要前提是具有代表性，應(yīng)是按照國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的現(xiàn)行生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的，最好提供提取液和制劑，必要時(shí)應(yīng)提供中間體和輔料。供試品溶液制備的基本原則是保證其代表性和完整性，其好壞直接影響了整體分析結(jié)果的優(yōu)劣及可信程度。

② 參照峰的選擇：特征圖譜的參照峰主要用于考察特征圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性，并有助于特征圖譜的辨認(rèn)。在多肽類的多組分生化藥的HPLC特征圖譜中，一般可從在紫外吸收波段有響應(yīng)的色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸中篩選。參照峰一般因?yàn)榉迕娣e較大，特征圖譜相似度軟件相似度算法是夾角余弦法，結(jié)果受大峰影響較大，因此，參照峰一般不選作共有峰。以小牛血去蛋白提取物為例，樣品和對照品疊加圖譜的典型圖譜，見圖2。最終選擇色氨酸為參照峰。

圖2 小牛血去蛋白提取物供試品和3種有紫外吸收的氨基酸對照品疊加圖譜(a.色氨酸；b.苯丙氨酸；c. 酪氨酸；d小牛血去蛋白提取液)Fig.2 Overlapped HPLC chromatograms of deproteinized hemoderivative of calf blood solution and three kinds of amino acid reference standard with ultraviolet absorption(a. tryptophan; b. phenylalanine; c. tyrosine; d. deproteinized hemoderivative of calf blood solution)

③ 特征圖譜獲?。禾卣鲌D譜試驗(yàn)條件應(yīng)能滿足特征圖譜的需要，不宜簡單套用含量測定用的試驗(yàn)條件，試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件選擇應(yīng)根據(jù)供試品的特點(diǎn),設(shè)計(jì)合適的試驗(yàn)方案，通過比較實(shí)驗(yàn)，從中選取相對簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的特征圖譜。

以腦蛋白水解物注射液為例，其主要組分為低分子肽和游離氨基酸，因此在該品種的特征圖譜研究中，首先征集了生產(chǎn)工藝基本一致、具有代表性的腦蛋白水解物溶液樣品，設(shè)計(jì)梯度洗脫試驗(yàn)方案，以期對其特征性的多肽組分進(jìn)行完全洗脫。腦蛋白水解物濃溶液不同企業(yè)樣品的疊加圖譜，見圖3。

圖3 不同企業(yè)腦蛋白水解物供試品特征圖譜Fig.3 Specific chromatogram of cerebroprotein hydrolysate from different manufactures

以另一種多組分生化藥小牛血去蛋白提取物注射液為例，其主要組分為氨基酸、低聚肽、核苷、無機(jī)離子等，其活性是多種成分綜合作用的結(jié)果。因此在最終確定的特征鑒別方法中是梯度洗脫的方法，檢測波長采用了214 nm，目的是能夠反映該產(chǎn)品中的特征性組分。小牛血去蛋白提取物不同企業(yè)樣品的疊加圖，見圖4。

4.2 HPLC特征圖譜分析方法的驗(yàn)證 方法驗(yàn)證的目的是為了考察和證明采用的特征圖譜測定方法具有可靠性和可重復(fù)性，符合特征圖譜測定的要求。HPLC特征圖譜實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證所包括的項(xiàng)目有：專屬性、精密度及耐用性等。方法驗(yàn)證的具體內(nèi)容應(yīng)從以下3方面考察：

4.2.1 專屬性：多組分生化藥的特征圖譜一般認(rèn)為分離峰越多越好，在大多數(shù)成分均能有響應(yīng)的情況下，用典型的色譜圖來證明其專屬性。具體方法專屬性可考慮采用峰純度、總峰響應(yīng)值等為考察參數(shù)。同時(shí)需要評價(jià)有關(guān)樣品(提取物、中間體和成品)間的相關(guān)性，并盡可能顯示出樣品中特征響應(yīng)，保證其有較大響應(yīng)，從而減少方法的波動帶來判別誤差。

4.2.2 精密度：精密度是指規(guī)定條件下對均質(zhì)樣品多次取樣進(jìn)行一系列檢測結(jié)果的接近程度。特征圖譜實(shí)驗(yàn)方法的精密度通常以多次測量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差來表達(dá)。具體精密度測量可用重復(fù)性和重現(xiàn)性進(jìn)行考察，重復(fù)性和重現(xiàn)性的具體范圍應(yīng)據(jù)實(shí)際情況確定。

4.2.3 耐用性：特征圖譜耐用性是指不同條件下分析同一樣品所得測試結(jié)果的變化程度。對HPLC特征圖譜，在實(shí)際驗(yàn)證中首先需要考慮實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作人員、實(shí)驗(yàn)儀器及色譜柱對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。特別需要考慮實(shí)驗(yàn)方法本身的參數(shù)波動的影響，如流速、柱溫、流動相組成、分析溶液的穩(wěn)定性等。

4.3 數(shù)據(jù)處理和分析 指紋圖譜相似度分析目前在藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣的是國家藥典會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件系統(tǒng)。采用相似度評價(jià)軟件計(jì)算相似度時(shí)，若峰數(shù)較多，且最大峰面積超過總峰面積的60%，計(jì)算相似度時(shí)應(yīng)考慮去除該色譜峰。對于用于鑒別的特征圖譜，若能夠提供對照提取物對照品，則優(yōu)先考慮采用對照提取物作對照，也可以對照圖譜作為對照。

5 多組分生化藥注射劑HPLC特征圖譜研究的展望

本文根據(jù)指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展和多組分生化藥質(zhì)控現(xiàn)狀，初步探索性地提出了多組分生化藥注射劑特征圖譜的研究思路，以期為該類藥品的質(zhì)量控制提供更多的方法與手段。指紋圖譜技術(shù)雖已提出多年，目前在中藥注射劑的質(zhì)量控制中也有一定的應(yīng)用，但涉及到在多組分生化藥注射劑質(zhì)量控制的應(yīng)用也存在一些值得商榷的問題。在研究過程中，如何識別與藥效相關(guān)的特征峰？如何選擇色譜共有峰能最大程度的反映產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量？如何將多組分生化藥特征圖譜所獲取的化學(xué)成分特征信息與生物活性相關(guān)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)？是否還能開發(fā)更適合多組分生化藥注射劑特征圖譜研究應(yīng)用的軟件？這些都是多組分生化藥特征圖譜研究的難點(diǎn)，還需要在以后的研究中進(jìn)行更深入的研究。

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(編校：王冬梅)

Investigation of research method of HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components

REN Li-ping， FAN Hui-hongΔ

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

The existing literature on fingerprint chromatography at home and abroad and the quality control of biochemical injection with multiple components were reviewed in this article. Combined with the laboratory research, It is proposed that the strategy for HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components in order to provide the basis for effectively promoting the establishment and development of HPLC specific chromatography of biochemical injection with multiple components.

biochemical injection with multiple components; fingerprint chromatography; specific chromatography; research method; quality control

中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金(2011A7)

任麗萍，女，碩士，副主任藥師，研究方向：生化藥品質(zhì)量研究，E-mail：pplucky@126.com；范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥品質(zhì)量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

TQ460.72

A

1005-1678(2015)06-0161-04