盧雪梅，汪潔，金小寶，朱家勇Δ

(1. 廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

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肝靶向干擾素對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠JAK-STAT信號(hào)通路基因表達(dá)的影響

盧雪梅1,2，汪潔1,2，金小寶1,2，朱家勇1,2Δ

(1. 廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

目的 研究肝靶向干擾素(interferon-circumsporozoite protein,IFN-CSP)在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗HBV分子機(jī)制。方法 Balb/c-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為3組：Control組(給予生理鹽水)，IFNα2b組(給予普通干擾素IFN α2b 103U/g)，IFN-CSP組(給予IFN-CSP 102U/g)，另設(shè)普通正常Balb/C小鼠組(Normal)。小鼠經(jīng)肌肉注射給藥4周后，抽提肝組織總RNA，Real-time PCR檢測(cè)小鼠肝組織中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 與正常小鼠對(duì)照組和模型組比較，IFN-CSP組和IFN α2b組STAT1,STAT2,IRF-9,OAS1基因表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)，IFN-CSP的誘導(dǎo)效果明顯強(qiáng)于IFN α2b(P<0.05)。結(jié)論 IFN-CSP在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗HBV作用可能與其影響JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因的表達(dá)有關(guān)，為其進(jìn)一步的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

IFN-CSP；HBV轉(zhuǎn)基因小鼠；JAK-STAT信號(hào)通路；Real-time PCR

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 主要在肝細(xì)胞內(nèi)寄生和復(fù)制，導(dǎo)致急慢性乙型肝炎發(fā)生，甚至引起肝硬化和肝癌[1]。干擾素(interferon，IFN)具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重活性，為抗HBV的首選藥物之一[2]。但干擾素在臨床治療中需長(zhǎng)期大劑量給藥，患者不僅生理上痛苦、治療費(fèi)用高，并且常常引發(fā)明顯的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、消化道反應(yīng)、生殖系統(tǒng)損害等，嚴(yán)重制約著干擾素的臨床應(yīng)用[3]。提高干擾素的靶向性可能是較好的策略，利用導(dǎo)向分子選擇性地將干擾素運(yùn)送到肝臟，既能提高藥物的療效、減少用藥量，又可明顯降低不良反應(yīng)[4]。

前期研究中，本課題組利用基因工程術(shù)將源于寄生蟲(chóng)的肝靶向肽分子與干擾素進(jìn)行融合，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備了新型肝靶向干擾素(interferon-circumsporozite protein,IFN-CSP)[5-8]。結(jié)果證實(shí)IFN-CSP可在肝臟得到明顯富集[5]，并具有顯著的體內(nèi)外抗HBV活性[9]，但其在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中抗HBV的分子機(jī)制不明確。本文以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)蛋白酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signaltransducers and activators of transcription，STATs)通路中STAT1、STAT2、interferon regulatory factor 9 (IRF-9)、oligoadenylate synthetase (OAS1) 基因的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討新型肝靶向干擾素IFN-CSP抗HBV作用的分子機(jī)制，為其應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Balb/c-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠18只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，許可證號(hào):SCXK-(軍)。SPF級(jí)Balb/C小鼠6只，6～8周，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0002。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，嚴(yán)格無(wú)菌操作。

1.2 藥物及主要試劑 重組人干擾素IFN α2b為北京凱因科技股份有限公司產(chǎn)品，重組新型肝靶向干擾素(IFN-CSP)由廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備?？俁NA快速抽提試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生化公司，DEPC購(gòu)至上海生工有限公司，SuperScript III First-Strand Synthesis System為Invitrogen公司產(chǎn)品，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、TaKaRa Taq DNA Polymerase、Real-time PCR試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，其他常用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AB2700 PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)AB公司)，Gel 100凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Real-time PCR儀Mini Option(美國(guó)Bio-Rad公司)，SW-CJ-1F型凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5810R (德國(guó)Eppendorf 公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 Balb/c-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只：① Control組(給予生理鹽水)，②IFN α2b組(給予普通干擾素IFN α2b 103U/g)，③ IFN-CSP組(給予肝靶向干擾素IFN-CSP 102U/g)。另取普通正常Balb/C小鼠6只為Normal組。每只小鼠給予50 μL肌肉注射，每天1次，連續(xù)4周，于最后一次給藥后處死動(dòng)物，取肝臟備用。

1.5 引物設(shè)計(jì) 參照Genbank公布的小鼠STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1、Actin基因的核酸序列，分別設(shè)計(jì)用于Real-time PCR的目的基因和內(nèi)參基因的特異性引物 (見(jiàn)表1)。

表1 Real-time PCR引物序列Tab. 1 Primers for Real-time PCR

1.6 總RNA提取和cDNA合成 取上述Normal組、Control組、IFN α2b 組和IFN-CSP組小鼠肝組織，液氮中快速研磨，粉碎后，按照高純度總RNA快速抽提試劑盒(離心柱型)(DP419)的使用說(shuō)明抽提肝組織總RNA。用 UV-4802H紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量吸光值，通過(guò) OD260/280判斷總 RNA 純度，用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性,-80 ℃保存?zhèn)溆?。以提取的RNA為模板，使用SuperScript III First-Strand Synthesis System進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。

1.7 普通PCR檢測(cè) 以上述cDNA為模板，PCR體系如下：5.0 μL cDNA模板，2.0 μL Forward Primer (20 μmol/L)，2.0 μL Reverse Primer (20 μmol/L)， 4.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.5 μL PCR Taq 酶 (5 U/uL)，加3 d H2O至總體積50.0 μL。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，23～28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.8 Real-time PCR檢測(cè)基因表達(dá) 以上述cDNA為模板，按照Real-time PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系如下：5.0 μL cDNA模板，2.0 μL Forward Primer (20 μmol/L)，2.0 μL Reverse Primer(20 μmol/L)，25.0 μL THUNDERBIRD SYBR?Green qPCR Mix，加3 d H2O至總體積50.0 μL。將上步的PCR管放入Real-time PCR儀中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條件為：95 ℃ 預(yù)變性 60 s后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s。對(duì)各組反應(yīng)的溶解曲線進(jìn)行分析，并根據(jù)各基因的Ct值，按照下列公式計(jì)算小鼠肝組織中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因相對(duì)表達(dá)量。F比率=2-[待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)管家基因平均Ct值]-[對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照管家基因平均Ct值]

2 結(jié)果

2.1 普通PCR結(jié)果 常規(guī)PCR反應(yīng)后，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示電泳呈單一條帶，STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1、Actin電泳條帶分別位于200、100、100、 150、150 bp左右，且無(wú)其他雜帶，表明無(wú)非特異性擴(kuò)增(見(jiàn)圖1)。

圖1 常規(guī)PCR檢測(cè)IFN α2b和IFN-CSP對(duì)STAT1, STAT2, IRF-9和OAS1基因表達(dá)影響Fig.1 Effect of IFN α2b and IFN-CSP on the gene expression of STAT1, STAT2, IRF-9 and OAS1 by RT-PCR

2.2 Real-time PCR特異性 采用Real-time PCR方法對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟局部Actin、STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因分別進(jìn)行擴(kuò)增，顯示擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)典型的S型曲線(圖2左圖)，溶解曲線分析顯示只有一個(gè)峰值，沒(méi)有雜峰(圖2右圖)，顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為單一產(chǎn)物，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

圖2 熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線圖(左)及溶解曲線圖(右)Fig.2 Amplification curves(left)and melting curves(right)of Real-time PCR

2.3 IFN-CSP對(duì)STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因的影響 為了進(jìn)一步探尋IFN α2b與IFN-CSP在體內(nèi)抗HBV作用的分子機(jī)制， 采用Real-time PCR方法檢測(cè)肝臟局部JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因表達(dá)。結(jié)果顯示，與Normal組和Control組比較，IFN-CSP組和IFN α2b組各基因表達(dá)均顯著上調(diào)(見(jiàn)表2和圖3)，且IFN-CSP組各基因表達(dá)明顯高于IFN-α2b組，說(shuō)明IFN-CSP的誘導(dǎo)效果明顯強(qiáng)于普通干擾素IFN-α2b(P<0.01)。

圖3 IFN α2b和IFN-CSP對(duì)抗病毒蛋白STAT1, STAT2, IRF-9,OAS1基因表達(dá)的影響**P<0.01, 與對(duì)照組相比;#P<0.05, ##P<0.01,與IFN-CSP相比Fig. 3 Effect of IFN α2b and IFN-CSP on the expression of STAT1, STAT2, IRF-9, OAS1**P<0.001, compared with control group; #P<0.05, ##P<0.001, compared with IFN-CSP

組別RelativemRNAlevelsSTAT1STAT2IRF-9OAS1Normal組0.094±0.0170.076±0.0090.046±0.0140.018±0.006Control組1.838±0.4541.848±0.2853.237±0.0561.106±0.057IFNα2b組6.968±1.229**10.393±1.394**48.195±3.321**34.305±2.057**IFN-CSP組13.201±1.735**##13.126±1.295**#67.097±3.837**##66.106±3.610**##F176.095263.5091031.2791389.850P0.0000.0000.0000.000

**P<0.01, 與對(duì)照組相比，compared with control group;#P<0.05,##P<0.01, 與 IFN-CSP相比，compared with IFN-CSP group

3 討論

小鼠遺傳背景清楚，基因組全序列已完全確定，免疫系統(tǒng)研究深入透徹并且易于飼養(yǎng)，這些特點(diǎn)決定了小鼠是實(shí)驗(yàn)室研究常用且比較理想的動(dòng)物模型。雖然小鼠無(wú)法感染人HBV，但是通過(guò)分子生物學(xué)手段將HBV基因轉(zhuǎn)入小鼠胚胎，可以構(gòu)建HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型，HBV可以在轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟和腎臟中進(jìn)行有效的復(fù)制，并產(chǎn)生HBV病毒顆粒，該病毒顆粒在形態(tài)學(xué)上與人血清HBV顆粒沒(méi)有區(qū)別，因此常作為評(píng)價(jià)細(xì)胞因子以及核苷類似物的抗HBV效果動(dòng)物模型[10-12]。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實(shí)IFN-CSP可顯著降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBsAg、HBV-DNA水平和肝臟中HBcAg的表達(dá)[13]，但其分子機(jī)制不清楚。

JAK-STAT通路是激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等廣泛涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在所有的細(xì)胞中幾乎均有JAK表達(dá)，它可與多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體結(jié)合并選擇性地激活其下游底物STATs，介導(dǎo)這些因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，活化相應(yīng)靶基因，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[14]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR) 技術(shù)以其特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)領(lǐng)域中的重要技術(shù)工具，已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各基因在組織細(xì)胞中的表達(dá)豐度、mRNA的表達(dá)模式、基因的表達(dá)調(diào)控等方面研究[15]。Real-time PCR通過(guò)在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值的分析，對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA法[16]。

本研究利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)給藥后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟JAK-STATs通路中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示IFN α2b和IFN-CSP均能顯著上調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因的表達(dá)(均P<0.01)，同時(shí)IFN-CSP誘導(dǎo)上述各基因的表達(dá)量顯著高于普通干擾素IFN α2b(均P<0.05)，且與前期研究結(jié)果中IFN-CSP抑制病毒學(xué)指標(biāo)相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)肝靶向干擾素的作用效果明顯優(yōu)于普通干擾素，且其抗HBV作用分子機(jī)制可能與影響JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1、STAT2、IRF-9、OAS1基因的表達(dá)有關(guān)。

[1] Xu C ZW, Wang Y, Qiao L. Hepatitis B virus induced hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett, 2014, 345(2):216-222.

[2] Zhang Q, Wang Y, Wei L, et al. Role of ISGF3 in modulating the anti-hepatitis B virus activity of interferon-alpha in vitro[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2008, 23(11):1747-1761.

[3] Sonneveld MJ, Rijckborst V, Cakaloglu Y, et al. Durable hepatitis B surface antigen decline in hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B patients treated with pegylated interferon-alpha2b: relation to response and HBV genotype[J]. Antivir Ther, 2012, 17(1):9-17.

[4] Yang F, Shu YJ, Yang YQ, et al. The pharmacokinetics of recombinant human interferon-alpha-2b poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres in rats[J]. J Microencapsul, 2011, 28(6):483-489.

[5] Lu X, Jin X, Huang Y，et al. Construction of a novel liver-targeting fusion interferon by incorporation of a Plasmodium region I-plus peptide[J]. Bio Med Research, 2014:e261431.

[6] 黃演婷, 盧雪梅, 汪潔,等. 肝靶向干擾素(IFN-CSP)融合基因原核表達(dá)條件的優(yōu)化[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2014,31(2):432-438.

[7] 盧雪梅, 黃演婷, 汪潔,等. 重組肝靶向干擾素工程菌菌種遺傳穩(wěn)定性研究[J].生物學(xué)雜志, 2013,30(3):14-16.

[8] 汪潔, 盧雪梅, 黃演婷,等. 地高辛探針檢測(cè)重組肝靶向干擾素宿主DNA殘留量的研究[J]. 生物技術(shù), 2014,24(5):80-83.

[9] Lu X, Wang J, Jin X, et al. IFN-CSP Inhibiting Hepatitis B Virus in HepG2.2.15 Cells Involves JAK-STAT Signal Pathway[J]. BioMed Research, 2015:e959684.

[10] Cobleigh MA, Wei X, Robek MD. A vesicular stomatitis virus-based therapeutic vaccine generates a functional CD8 T cell response to hepatitis B virus in transgenic mice[J]. J Virol, 2013, 87(5):2969-2973.

[11] Tang Y, Chen X, Zhang Y, et al. Fusion protein of tapasin and hepatitis B core antigen 1827 enhances T helper cell type 1/2 cytokine ratio and antiviral immunity by inhibiting suppressors of cytokine signaling family members 1/3 in hepatitis B virus transgenic mice[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(4):1171-1178.

[12] Morrey JD, Motter NE, Chang S, et al. Breaking B and T cell tolerance using cationic lipid-DNA complexes (CLDC) as a vaccine adjuvant with hepatitis B virus (HBV) surface antigen in transgenic mice expressing HBV[J]. Antiviral Res, 2011, 90(3):227-230.

[13] Lu X, Wang J, Jin X，et al. High-level expression of a novel liver-targeting fusion interferon with preferred Escherichia coli codon preference and its anti-hepatitis B virus activity in vivo[J]. BMC Biotechnol, 2015, DOI: 10.1186/s12896-015-0177-1.

[14] Ayala-Camargo A, Anderson A, Amoyel M, et al. JAK/STAT signaling is required for hinge growth and patterning in the Drosophila wing disc[J]. Dev Biol, 2013, 382(2):413-426.

[15] 許黎黎, 鮑琳琳, 谷松至，等. 埃博拉病毒萊斯頓亞型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2015,31(3):276-281.

[16] 周成江, 周立社, 吳剛，等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007, 23(2):204-207.

(編校：譚玲)

Effect of IFN-CSP on gene of JAK-STAT signaling pathway in HBV transgenic mice

LU Xue-mei1,2, WANG Jie1,2, JIN Xiao-bao1,2, ZHU Jia-yong1,2Δ

(1. Institution of Pharmaceutical Bioactive Substances, School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2.Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo investigate the anti-HBV molecular mechanisms of liver targeting interferon (IFN-CSP) in Balb/c-HBV transgenic mice. MethodsBalb/c-HBV transgenic mice were randomly divided into 3 groups. Control group (treated with physiological saline), IFN α2b group (treated with 103U/g IFN α2b), IFN-CSP group (treated with 102U/g IFN-CSP). Another group of the non-transgenic mice were used as the Normal group. Each mouse was intramuscular injected with 50 μL dose once a day for 4 weeks. Total RNA of mice liver were extracted, and STAT1, STAT2, IRF-9, OAS1 gene expression of JAK-STAT signaling pathway were analyzed by real-time PCR. ResultsIFN α2b and IFN-CSP can significantly up regulate the expression of STAT1, STAT2, IRF-9, OAS1 gene of JAK-STAT signaling pathway (P<0.01). The induce effects of IFN-CSP on STAT1, STAT2, IRF-9, OAS1 were significantly better than that of IFN α2b (P<0.05). ConclusionThe anti-HBV molecular mechanisms of liver targeting interferon (IFN-CSP) in Balb/c-HBV transgenic mice maybe related to regulate the expression of STAT1, STAT2, IRF-9, OAS1 gene of JAK-STAT signaling pathway. These results will lay a basis for the application of recombinant liver-targeting interferon.

IFN-CSP; HBV transgenic mice; JAK-STAT signal pathway; Real-time PCR

國(guó)家科技部新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2013ZX09103003-003)

盧雪梅，女，博士，副研究員，研究方向：藥用生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用研究，E-mail: luxuemei605@163.com；朱家勇，通訊作者，男，博士,教授、博士生導(dǎo)師，研究方向：藥用生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用研究，E-mail: zhujiayong1020@163.com。

Q819

A

1005-1678(2015)06-0013-04