紀(jì)前前，郭尚敬

(聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252000)

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小分子抑制劑LDYS-14007對JAK1-STAT3信號通路的影響研究

紀(jì)前前，郭尚敬Δ

(聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252000)

目的 研究LDYS-14007對JAK1-STAT3信號通路的影響。方法 分別用10 μmol 、1 nmol 的LDYS-14007和10 μmol 的Tofacitinib處理MDA-MB-231細(xì)胞。用Western blot法檢測JAK1和STAT3的蛋白表達(dá)以及磷酸化狀況。結(jié)果 吸光度A與蛋白質(zhì)濃度C呈線性相關(guān), 線性方程為A=0.0075C+0.0029，r= 0.9976，線性范圍為1.08～5.08 mg/mL；隨著LDYS-14007濃度的增加，Phospho-JAK1，Phospho-STAT3的量逐漸減少。結(jié)論 LDYS-14007可通過降低JAK1和STAT3的磷酸化水平抑制JAK1-STAT3信號通路。LDYS-14007可能在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)的治療中起重要作用。

LDYS-14007；JAK-STAT信號通路；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

Janus激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus-activated kinase signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條與炎癥細(xì)胞因子、腫瘤密切相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路[1]。Janus激酶(Janus-activated kinase，JAK)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶。有4個家族成員，分別是JAK1、JAK2、TYK2和JAK3。前3者廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，而JAK3僅存在于骨髓和淋巴系統(tǒng)[1]。許多細(xì)胞因子與受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化而激活，募集或連接胞內(nèi)JAK酪氨酸蛋白激酶，JAK激酶被募集到受體后形成同源或異源二聚體，從而激活下游信號通路[2]。研究表明[3]，不同的細(xì)胞因子受體募集不同的JAK激酶，具有βc亞基的受體主要募集JAK2并形成同源二聚體；具有g(shù)p130亞基的受體和II型細(xì)胞因子受體可以募集JAK1、JAK2和TYK2并形成異源二聚體；而JAK3只被具有γc亞基的受體募集并激活，通常與JAK1形成二聚體。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)是一種以持續(xù)性滑膜炎和多關(guān)節(jié)進(jìn)行性骨破壞為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。主要表現(xiàn)為進(jìn)行性侵蝕性關(guān)節(jié)炎及晨僵，部分患者可出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、皮下結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)腫大等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。人群發(fā)病率為0.5%～1.0%[4]。目前用于治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥、改善病情抗風(fēng)濕藥和糖皮質(zhì)激素。臨床一、二線用藥的主導(dǎo)是改善病情抗風(fēng)濕藥甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)和生物類改善病情抗風(fēng)濕藥依那西普(etanercept，Enbrel)以及2者的聯(lián)用[5]。RA患者免疫紊亂主要由腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors-α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等細(xì)胞因子介導(dǎo)[6]。細(xì)胞因子與受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化而激活，募集或連接胞內(nèi)JAK酪氨酸蛋白激酶，JAK激酶被募集到受體后形成同源或異源二聚體，從而激活下游信號通路[2]。其中JAK1，STAT3分子與RA的發(fā)生密切相關(guān)。因此，JAK1-STAT3信號通路成為治療RA的潛在靶點(diǎn)[5]。

近期，本研究篩選發(fā)現(xiàn)一種新的吡咯并嘧啶類可阻斷上述細(xì)胞因子的級聯(lián)放大作用，從而改善RA患者受損關(guān)節(jié)癥狀—JAK1 抑制劑LDYS-14007，本文旨在探討LDYS-14007的分子作用機(jī)理，研究其在RA治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 MDA-MB-231細(xì)胞(購自美國模式菌種收藏所，ATCC)。

1.2 藥品與試劑 LDYS-14007由本實驗室篩選所得；Tofacitinib(購自Axon Biochemicals，CPS115, Postbus, Netherlands)；一抗anti-JAK1，anti-Phospho-JAK1，anti-STAT3(購自 Cell Signaling Technology，批號分別為#3332、#3331-s、#9139-s)；anti-Phospho-STAT3(購自epitomics，批號為#2236-1)。Tris-base、甘氨酸、SDS、麗春紅S、BSA、胰蛋白酶、Anti-β-actin、兔源的二抗(購自北京鼎國科技技術(shù)有限公司)；ECL(購自Pierce Inc，USA)；IL-6(購自 Sigma 公司)；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液，PBS(購自Gibco公司)；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)；全自動酶標(biāo)儀(Biotek，USA)；超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，中國)；電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，JAPAN)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 參照劉文哲等[7]介紹的方法復(fù)蘇MDA-MB-231細(xì)胞，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。放在37 ℃、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞，至細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿，即可傳代。在無菌操作臺中，用吸管吸去舊培養(yǎng)液，加入3 mL PBS液洗2～3次，小心吸取PBS液，換用新的無菌吸管吸取胰蛋白酶液2 mL進(jìn)行消化，在37 ℃培養(yǎng)箱靜置約2 min，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其脫離形成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，取實驗所需細(xì)胞數(shù)分皿，并置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。每3～4天傳代一次，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.5 LDYS-14007或Tofacitinib作用于MDA-MB-231時的蛋白提取與濃度測定 MDA-MB-231細(xì)胞接種于 24 孔板。待貼壁后，用10 μmol的Tofacitinib，以及1 nmol,10 μmoL的LDYS-14007分別處理1h，加3 μL IL-6處理10 min。PBS洗1次，然后用2×SDS Loading Buffer(1M Tris-HCL 6.25 mL，SDS 2 g，溴酚藍(lán)5 mg，甘油10 mL，β-巰基乙醇5 mL，加水定容至50 mL)裂解，收集于Eppendorf管中，煮沸10 min。采用全自動酶標(biāo)儀對細(xì)胞裂解提取物進(jìn)行總蛋白濃度測定, 作出蛋白濃度-吸光度工作曲線, 然后分別檢測每份提取物在 490 nm波長下的吸光度A值, 繼而得出每份細(xì)胞裂解提取物的總蛋白濃度。實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測JAK1和STAT3的蛋白表達(dá)以及磷酸化 等量的樣品用 SDS-PAGE 膠(其中濃縮膠為 5%，分離膠為 8%)，在 Tris-甘氨酸電泳緩沖液(每升含 Tris-base 3.2 g, 甘氨酸 18.8 g, SDS 1 g)中90～120 V電泳，待目的條帶跑至膠的 1/2～2/3處停止電泳。用半干法將蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，其中1 L轉(zhuǎn)移緩沖液含甘氨酸2.9 g(39 mM),Tris-base 5.8 g(48 mM)，SDS 0.37 g，以及20%甲醇。轉(zhuǎn)膜電流8 mA/cm2, 轉(zhuǎn)膜時間約40 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用麗春紅S染色液染色 5～10 min。根據(jù)染色結(jié)果確定蛋白轉(zhuǎn)移情況和蛋白條帶在硝酸纖維素濾膜上的相對位置。然后用含5%BSA的TBST溶液[20 mM Tris-HCl(pH 7.2～7.4)，150 mM NaCl， 0.1 %Tween-20]在脫色搖床上室溫封閉1 h，然后加入特異性一抗(1:3000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST 室溫洗滌3次， 每次5 min。 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:5000稀釋)， 置于搖床上室溫孵育 1 h。TBST溶液洗滌2次，每次 5 min。最后加適量 ECL發(fā)光劑，用X膠片曝光、顯影、定影、拍照。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)定量工作曲線 吸光度(A)與蛋白質(zhì)濃度(C)呈線性相關(guān), 線性方程為A=0.0075C+0.0029,r=0.9976,線性范圍為1.08～5.08 mg/mL。該測定方法較為可靠。見圖1。

圖1 蛋白定量曲線Fig.1 The protein quantitative curve

2.2 LDYS-14007抑制MDA-MB-231細(xì)胞中JAK1 Tyr1022的磷酸化 用濃度為1 nmol、10 μmol的LDYS-14007以及濃度為10 μmol的Tofacitinib分別處理細(xì)胞，隨著LDYS-14007濃度的增加，Phospho-JAK1的量逐漸減少，表明LDYS-14007可以抑制JAK1的磷酸化，進(jìn)而抑制JAK-STAT信號通路的激活。見圖2。

圖2 LDYS-14007對MDA-MB-231細(xì)胞Phospho-JAK1表達(dá)的影響(n=3)A：Phospho-JAK1的Western blot圖；B：Phospho-JAK1/β-actin的蛋白灰度比圖*P<0.05，與IL-6組相比Fig.2 Effect of LDYS-14007 on Phospho-JAK1 expression in MDA-MB-231 cell(n=3)A:Western blot of Phospho-JAK1;B: Protein gray ratio of Phospho-JAK1/β-actin*P<0.05，compared with IL-6 group

2.3 LDYS-14007抑制MDA-MB-231細(xì)胞中STAT3 Tyr705的磷酸化 用濃度為1 nmol、10 μmol的LDYS-14007以及濃度為10 μmol的Tofacitinib分別處理細(xì)胞，隨著LDYS-14007濃度的增加，Phospho-STAT3的量逐漸減少，表明LDYS-14007可以抑制STAT3的磷酸化，進(jìn)而抑制JAK-STAT信號通路的激活。見圖3。

圖3 LDYS-14007對MDA-MB-231細(xì)胞Phospho-STAT3表達(dá)的影響(n=3)A：Phospho-JAK1的Western blot圖；B: Phospho-STAT3/β-actin的蛋白灰度比圖*P<0.05,與IL-6組相比Fig.3 Effect of LDYS-14007 on Phospho-STAT3 expression in MDA-MB-231 cells(n=3)A:Western blot of Phospho-STAT3;B: Protein gray ratio of Phospho-STAT3/β-actin*P<0.05,compared with IL-6 group

3 討論

目前，國內(nèi)外治療RA的藥物包括非甾體類抗炎藥、鎮(zhèn)痛藥、改善病情抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑、植物藥等[8]。傳統(tǒng)RA的治療模式有金字塔、倒金字塔、上臺階、下臺階等，隨著生物制劑的發(fā)展，RA的治療模式也有了改變。歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會和國際指導(dǎo)委員會都發(fā)表了RA治療指南和原則[9]，應(yīng)用藥物仍然是以改善病情抗風(fēng)濕藥為主，非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素則用于輔助治療。強(qiáng)調(diào)早期使用改善病情抗風(fēng)濕藥、甲氨蝶呤應(yīng)作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的基礎(chǔ)用藥。如最初改善病情抗風(fēng)濕藥方案治療未能達(dá)標(biāo)，當(dāng)存在預(yù)后不良因素時應(yīng)考慮加用生物制劑，且應(yīng)從TNF-α抑制劑開始，并與甲氨蝶呤聯(lián)合使用。目前TNF-α抑制劑與甲氨蝶呤單用或聯(lián)用占一、二線臨床RA用藥的70%～80%[1]。但尚無證據(jù)表明這些藥物的治療能中止RA中軟骨、骨及軟組織的破壞進(jìn)程，且這些藥物需長期服用，毒性大、患者依從性差。

研究表明[10]，選擇特異性阻斷JAK-STAT信號通路是一個切實有效的RA治療途徑。而深入研究JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在RA所致滑膜細(xì)胞增殖、炎性介質(zhì)分泌及關(guān)節(jié)破壞中的作用，有助于深入了解RA的發(fā)病機(jī)制，并為研制出更高效、安全、經(jīng)濟(jì)的RA新藥提供理論依據(jù)。

LDYS-14007是吡咯并嘧啶類小分子抑制劑，可以阻斷JAK-STAT信號通路，抑制炎癥趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而改善RA的病情。與單抗藥物相比，具有分子量小，價格低廉，應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。本實驗室下一步的工作計劃是研究LDYS-14007對炎癥趨化因子基因表達(dá)的影響，以及對模型動物類風(fēng)濕炎癥的改善情況。

[1] Stark GR, Darnell JE Jr.The JAK-STAT pathway at twenty[J].Immunity,2012, 36(4): 503-514.

[2] Kontzias A, Kotlyar A, Laurence A, et al.Jakinibs: a new class of kinase inhibitors in cancer and autoimmune disease[J].Curr Opin Pharmacol,2012,12(4): 464-470.

[3] Laurence A, Pesu M, Silvennoinen O, et al.JAK Kinases in Health and Disease: An Update[J].Open Rheumatol J,2012,6: 232-244.

[4] Scott DL, Wolfe F, Huizinga TW.Rheumatoid arthritis[J].Lancet, 2010,376(9746): 1094-1108.

[5] Smolen JS, Aletaha D, Bijlsma JW, et al.Treating rheumatoid arthritis to target: recommendations of an international task force[J].Ann Rheumatic Dis, 2010,69(4): 631-637.

[6] Moran N.Incyte comes of age with JAK inhibitor approval[J].Nat Biotechnol, 2012,30(1): 3-5.

[7] 劉文哲, 李金瀚, 胡義德, 等.順鉑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的研究[J].中國肺癌雜志，2002，5(4): 254-256.

[8] Hollan I, Dessein PH, Ronda N, et al.Prevention of cardiovascular disease in rheumatoid arthritis[J].Autoimmun Rev, 2015.DOI:10.1016/j.06.004.autrev.2015.

[9] Smolen JS, Landewe R, Breedveld FC, et al.EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2013 update[J].Ann Rheum Dis, 2014,73(3): 492-509.

[10] Migita K, Izumi Y, Torigoshi T, et al.Inhibition of Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signalling pathway in rheumatoid synovial fibroblasts using small molecule compounds[J].Clin Exp Immunol, 2013,174(3): 356-363.

(編校：王冬梅)

Study on the effect of small molecule inhibitors LDYS-14007 on JAK1- STAT3 signaling pathway

JI Qian-qian, GUO Shang-jingΔ

(College of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo study the effect of LDYS-14007 on JAK1-STAT3 signaling pathways.MethodsMDA-MB-231 cells were treated with 10 μmol,1 nmol LDYS-14007, and 10 μmol Tofacitinib,respectively.Western blot assay was used to determine the expression of JAK1,Phospho-JAK1,STAT3 and Phospho-STAT3.ResultsThe absorbance value was linearly related to the concentration of protein C， The linear equation is A=0.0075C+0.0029,r= 0.9976, The linear range of 1.08-5.08 mg/mL, With the increased concentration of LDYS-14007, the amount of Phospho-JAK1, Phospho-STAT3 were all gradually decreased.ConclusionLDYS-14007 leads to the levels of Phospho-JAK1 and Phospho-STAT3 decrease, which inhibits JAK1-STAT3 signaling pathway.LDYS-14007 may play an important role in the treatment of rheumatoid arthritis.

LDYS-14007; JAK1- STAT3 signaling pathways; rheumatoid arthritis

國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃，2012AA02A306)

紀(jì)前前，女，碩士在讀，研究方向：JAK小分子抑制劑，E-mail：929672413@qq.com；郭尚敬，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：基因工程藥物，植物生物反應(yīng)器，E-mail：guoshangjing@163.com。

R9

A

1005-1678(2015)06-0010-03