賈文慶，王少平，李紀(jì)元

（1 中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽311400；2 河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

大花紅山茶（Camellia magniflora）為山茶科山茶屬內(nèi)罕見的天然八倍體物種，其花大如牡丹，艷紅亮麗；茶籽榨油，既為高級食用油，又可制成高級化妝品，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值［1－3］。分布在低山地區(qū)而具有較強的抗寒、抗病能力，因而是一種重要的遺傳種質(zhì)資源。紅山茶組（Sect．Camellia）多種植物開花量大，但花徑小，抗性差。因此，開展紅山茶組種類與山茶的種間雜交工作，是培育大花、抗性強觀賞品種最具潛力的途徑之一。

雜交育種是培育園林植物新品種最有效、最常用的手段之一，雜交經(jīng)常遇到花期不遇、遠(yuǎn)距離雜交的實際問題，這就需要采集和保存花粉，花粉生活力是評價貯藏成敗的主要標(biāo)志，離體培養(yǎng)法是檢測花粉萌發(fā)率最準(zhǔn)確的方法之一［4－6］。有關(guān)大花紅山茶花粉生活力及貯藏特性尚未見報道。當(dāng)前，有關(guān)花粉保存的研究多集中在不同貯藏方法（溫度、濕度等）和萌發(fā)率的關(guān)系，趙文飛等［7］、譚健暉［8］、劉艷萍等［9］研究發(fā)現(xiàn)：花粉保存期間，內(nèi)部發(fā)生一系列的生理代謝反應(yīng)，活力逐漸下降，而花粉中的保護(hù)酶類能夠清除氧自由基，延緩衰老，因此，保護(hù)酶活性的高低也是反映花粉活力的重要指標(biāo)。本試驗以大花紅山茶花粉為試驗材料，使用掃描電子顯微鏡觀察了花粉表觀形態(tài)，采用離體培養(yǎng)法研究了花粉的萌發(fā)特性，并探討了不同貯藏方法對花粉萌發(fā)率、SOD、POD 和CAT 活性的影響，旨在找出大花紅山茶花粉生活力測定的快速準(zhǔn)確方法，從花粉的酶活性方面對花粉貯藏期間的生理生化反應(yīng)進(jìn)行探索，以期為開展山茶屬種間雜交育種及親本選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

試驗于2013 年在中國林業(yè)科學(xué)院亞熱帶林業(yè)研究所山茶資源圃進(jìn)行。材料為生長健壯的樹齡為15a的大花紅山茶植株。2013年2月上旬上午10時采集盛花期微開花朵，把花藥剪下放到硫酸紙上，常溫放置24h讓其自然散粉，收集花粉，一部分用于花粉生活力測定，一部分真空干燥6h后轉(zhuǎn)入離心管密封保存，備用。

1．2 花粉形態(tài)掃描電鏡觀測

將真空干燥花粉均勻撒于貼有雙面膠的樣品臺上，放在日立SU－1510掃描電鏡下觀察，記錄極軸（P）值、赤道長度（E）值，觀察描述、記錄花粉的表面紋飾。花粉形態(tài)的描述主要依據(jù)王開發(fā)和王憲曾（1983）的《孢粉學(xué)概論》中的名詞術(shù)語和定義。

1．3 不同培養(yǎng)基對大花紅山茶花粉萌發(fā)的影響

在預(yù)備試驗基礎(chǔ)上，共設(shè)30個固體培養(yǎng)基，基礎(chǔ)成分為：100mg·L－1KNO3＋50mg·L－1Mg－SO4＋300mg·L－1Ca（NO3）2，添加不同濃度的硼酸、蔗糖，濃度梯度見表1，pH 5．8。用毛筆蘸取花粉播于載玻片培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)皿里浸濕的吸水紙上，加蓋。培養(yǎng)條件為（25±1）℃，全光照培養(yǎng)。每處理設(shè)置3重復(fù)，每重復(fù)觀察3個視野，總計觀察花粉數(shù)大于150粒，計算花粉萌發(fā)率［7］。

花粉萌發(fā)率（%）＝花粉管長度大于花粉直徑的花粉數(shù)／觀察花粉數(shù)×100%

1．4 不同貯藏方法對大花紅山茶山茶花粉萌發(fā)、保護(hù)酶活性的影響試驗

將真空干燥的花粉，設(shè)置常溫、4 ℃（低溫）、－20 ℃、－80 ℃（超低溫）4種貯藏溫度，將花粉裝入放有硅膠干燥劑7mL試管中，用棉花封口，每貯藏溫度放置10～15 支。貯藏24、40、72、120、184、264、100、360d后，從4種貯藏條件中各取出1支花粉，用少許采用1．2所得最佳培養(yǎng)基測定萌發(fā)率，其余花粉用于保護(hù)酶活性測驗。

1．5 不同貯藏方法對保護(hù)酶活性的影響試驗

酶液的提?。簻?zhǔn)確稱取1．000g大花紅山茶花粉，放入4 ℃預(yù)冷玻璃研缽中，加入少許PVP、石英砂，然后加入10 mL 0．05 mol·L－1磷酸緩沖液（pH 7．0），勻速研磨30～40S，然后將混合液倒入試管中于10 000r／min冷凍離心機里離心20min。上清液即為酶液。

超氧化物岐化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法（NBT）［10］測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法［11］測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法 進(jìn)行測定。

數(shù)據(jù)用SPSS 11．0進(jìn)行方差分析，采用Excel 2003進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 大花紅山茶表觀形態(tài)

從圖1 可以看出大花紅山茶花粉粒為橢球形（圖1，A～F），大花紅山茶花粉粒平均極軸長為71．05μm，平均赤道軸長約34．83μm，與本組卵果紅山茶大小相似度較高［12］，屬于大型花粉?；位ǚ圯^多，占24．56%，呈船型或不規(guī)則形狀（圖1，A、B）。大花紅山茶花粉粒紋飾為穴狀、小溝狀雕飾紋，網(wǎng)眼為圓形、長條形、三角形及不規(guī)則形。網(wǎng)脊粗大彎曲，粗細(xì)均勻，網(wǎng)眼大，形狀及大小不規(guī)則，網(wǎng)眼平均間距約為1．79μm，分布不均勻（圖1，H、I）?；ǚ鄢嗟烂嬗^長橢圓形，兩端漸寬，極面觀三裂圓形，花粉具3孔溝，溝寬約5μm，溝長快達(dá)到花粉粒兩端，長度平均約70．65μm，溝區(qū)有光滑的溝膜，溝界極區(qū)平均寬約6．53μm。

2．2 不同培養(yǎng)基對大花紅山茶花粉萌發(fā)的影響

表1表明，大花紅山茶在蔗糖、硼酸濃度都為0和單獨添加蔗糖或者硼酸時萌發(fā)率不高，在空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基上萌發(fā)率為16．55%，當(dāng)單獨使用蔗糖時，濃度為150g·L－1萌發(fā)率最高，達(dá)41．88%；單獨使用硼酸時，濃度為20 mg·L－1萌發(fā)率最高，達(dá)29．66%。高濃度的蔗糖和硼酸使花粉萌發(fā)率下降，供試的30種培養(yǎng)基中，硼酸和蔗糖濃度分別為20 mg·L－1、150g·L－1時，花粉萌發(fā)率最高，達(dá)68．10%，顯著高于其它組合，為大花紅山茶最佳花粉萌發(fā)培養(yǎng)基。

圖1 大花紅山茶花粉掃描電鏡觀察Fig．1 Pollen morphology of C．magniflora under SEM

表1 不同培養(yǎng)基對大花紅山茶花粉萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of different media on pollen germination of C．magniflora

2．3 不同貯藏溫度、貯藏時間下花粉萌發(fā)情況

圖2表明，不同貯藏溫度與時間對大花紅山茶花粉活力影響顯著，貯藏后花粉萌發(fā)率差異較大。常溫貯藏的花粉隨貯藏時間的延長花粉萌發(fā)率迅速降低，貯藏120d 后花粉失去生活力，不再萌發(fā)；4℃下貯藏184d時花粉萌發(fā)率降為0。0～120d時，－20 ℃、－80 ℃貯藏條件花粉活力出現(xiàn)較快的下降趨勢；貯藏120～360d，－20 ℃、－80 ℃貯藏條件花粉活力下降速度較慢，至360d時，－80 ℃貯藏的花粉仍保持較高的萌發(fā)率，達(dá)39．40%，－20℃貯藏的花粉萌發(fā)率也達(dá)到21．30%。綜上所述，適宜花粉貯藏的條件為－80 ℃。

2．4 不同貯藏溫度與時間對大花紅山茶花粉保護(hù)酶活性的影響

2．4．1 不同貯藏溫度和時間對大花紅山茶花粉超氧化物歧化酶活性的影響 從表2和圖3可以看出，不同的貯藏時間和貯藏溫度對SOD 活性有顯著影響（P＜0．01）。由圖2 可知，大花紅山茶花粉SOD 活性在常溫、4 ℃貯藏條件下，隨貯藏時間的延長呈先升高再迅速下降趨勢，最高峰分別出現(xiàn)在貯藏后72d和120d，說明花粉常溫、4 ℃貯藏后超氧自由基不斷增加，誘導(dǎo)SOD 的活性增強，隨著時間的延長，SOD 活性隨萌發(fā)率的下降而迅速下降。4℃下貯藏264d花粉萌發(fā)率降為0時的SOD 活性僅為最高峰的4．31%。－20 ℃、－80 ℃貯藏0～184d，超氧化物歧化酶活性呈緩慢下降－緩慢上升－再下降，比較而言，－80 ℃貯藏的大花紅山茶花粉SOD 活性下降幅度曲線明顯較－20 ℃平緩。－20℃、－80 ℃貯藏184～360d，－80 ℃下超氧化物歧化酶活性呈緩慢上升的趨勢，而－20 ℃下則呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢；－80 ℃貯藏360d，SOD 活性為314，達(dá)到原來的1．35倍，說明大花紅山茶花粉仍保持較高的活性。

圖2 不同貯藏方法對花粉萌發(fā)的影響Fig．2 Effects of different storage methods on pollen’s germination

圖3 不同貯藏時間及貯藏溫度對大花紅山茶花粉SOD 活性的影響Fig．3 Effects of different storage times and temperatures on pollen’s SOD activity

表2 不同貯藏溫度與時間對大花紅山茶花粉保護(hù)酶活性的影響Table 2 Effects of different storage time and temperature on pollen’s protective enzymes activity

圖4 不同貯藏時間及貯藏溫度對大花紅山茶花粉POD 活性的影響Fig．4 Effects of different storage times and temperatures on pollen’s POD activity

圖5 不同貯藏時間及貯藏溫度對大花紅山茶花粉CAT 活性的影響Fig．5 Effects of different storage times and temperatures on pollen’s CAT activity

表3 花粉萌發(fā)率與3種保護(hù)酶活性的相關(guān)分析表Table 3 The correlation analysis of pollen’s germinationand activities of three protective enzymes

2．4．2 不同貯藏溫度和時間對大花紅山茶花粉過氧化物酶活性的影響 從表2和圖4可以看出，大花紅山茶花粉經(jīng)過不同低溫和時間處理后，POD活性變化顯著（P＜0．01）。常溫、4 ℃貯藏下，大花紅山茶花粉的過氧化物酶活性隨時間的增長，基本呈現(xiàn)逐步升高后迅速下降的趨勢，常溫保存至72d時，過氧化物酶活性升至112，達(dá)到最高，為原來的2．43倍，之后隨著時間的增長，大花紅山茶花粉自身的保護(hù)能力迅速下降，過氧化物酶合成受到抑制，至貯藏264d，降為0；4 ℃貯藏，大花紅山茶花粉的過氧化物酶活性最高峰出現(xiàn)在120d，之后隨著時間的增長，POD 活性開始迅速降低，到264d時，POD降為11；－20 ℃和－80 ℃貯藏，過氧化物酶活性變化基本一致，呈升高－下降的趨勢，最高峰分別出現(xiàn)在120及184d。此時過氧化物酶活性分別為原來的2．33和2．13倍，之后過氧化物酶活性開始下降。360d時過氧化物酶活性分別降為44和62，為原來的0．96和1．35倍，這表明花粉能夠及時分解自由基，進(jìn)而保護(hù)花粉減少低溫傷害，保持較高的花粉活力。

2．4．3 不同貯藏溫度和時間對大花紅山茶花粉過氧化氫酶活性的影響 如表2和圖5所示，不同貯藏方法對CAT 活性差異顯著，常溫、4 ℃貯藏溫度下，大花紅山茶花粉的CAT 活性隨貯藏時間的延長，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，分別在貯藏264d和360 d降為0。－20 ℃、－80 ℃貯藏溫度下隨貯藏時間的延長，大花紅山茶花粉的CAT 活性呈現(xiàn)升高－下降－再升高的趨勢，總體上－20 ℃貯藏下CAT 高低起伏較大，最高值均出現(xiàn)在40d，最高峰峰值分別為42和38，為原來的1．45倍和1．31倍。

2．5 大花紅山茶花粉萌發(fā)率與過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的關(guān)系

相關(guān)分析顯示，花粉萌發(fā)率與3種保護(hù)酶之間呈正相關(guān)（表3），花粉萌發(fā)率與超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶呈正相關(guān)，與過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)（P＜0．01），說明在大花紅山茶花粉的貯藏過程中，過氧化氫酶活性對花粉萌發(fā)率起著主導(dǎo)作用，即過氧化氫酶活性對花粉萌發(fā)率的影響作用大于超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性。

3 討 論

3．1 大花紅山茶花粉表觀形態(tài)

山茶屬植物由于種類眾多，形態(tài)差異較大，其分類上一直存在許多分歧。利用花粉形態(tài)作為本屬分類的依據(jù)就成為比較可靠的方法之一。本研究中首次使用掃描電鏡對大花紅山茶花粉形態(tài)進(jìn)行觀測，其橢球形的花粉形態(tài)基本符合山茶屬花粉形態(tài)多為球形、長球形和扁球形的一般特征 ，但與倪穗等［12］對紅山茶組其它27個種的花粉形態(tài)研究結(jié)果相比，大花紅山茶的花粉表觀形態(tài)與之差異較大，主要表現(xiàn)在：（1）本種極面觀呈正三角形，溝界極區(qū)較寬，其它種則相對較窄［12］；（2）本種花粉粒紋飾為穴狀、小溝狀雕飾紋，其它種花粉外壁紋飾一般為皺溝狀、皺波狀、皺波狀－顆粒狀和顆粒狀4種類型。（3）大花紅山茶花粉粒平均極軸長為71．05μm，除與卵果紅山茶基本相當(dāng)外，其它種均較小。這些差異表明，大花紅山茶在山茶屬中可能具有較特殊的分類地位和系統(tǒng)演化地位，本種與其它紅山茶組植物花粉外壁紋飾的亞顯微特征不同對其分類地位及演化關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

3．2 不同培養(yǎng)基及不同貯藏方法對花粉萌發(fā)的影響

離體萌發(fā)法結(jié)果準(zhǔn)確、簡單易行，因此應(yīng)用廣泛［4－9］。山茶科植物花粉萌發(fā)所需的蔗糖、硼酸濃度一般分別為100～200 g·L－1，50～100 mg·L－1［12，14］。本試驗結(jié)果顯示，大花紅山茶花粉萌發(fā)最適蔗糖、硼酸濃度分別為150g·L－1、20 mg·L－1，與多數(shù)山茶科植物花粉萌發(fā)所需蔗糖濃度范圍相一致，但僅需要較低濃度的硼酸。

適宜的貯藏方法可以確保雜交育種獲得較多群體數(shù)量的后代。低溫貯藏可降低花粉的生理功能，適宜較長時間保持花粉生活力［4－7］。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)過不同貯藏處理的花粉發(fā)芽率較初始發(fā)芽率均有不同程度的降低，常溫、4 ℃貯藏的花粉發(fā)芽率下降明顯，常溫保存的花粉120d后完全喪失生活力。4 ℃條件下的花粉生活力在貯藏前40d時萌發(fā)率下降緩慢，而后隨著貯藏時間的增加而迅速下降，貯藏264d時，花粉完全喪失生活力。說明4℃條件只適合花粉短期貯藏。在－80 ℃貯藏條件下，花粉貯藏前期生活力保持相對平衡狀態(tài)，貯藏24d時達(dá)到最高值，之后出現(xiàn)下降的趨勢，貯藏360d的花粉萌發(fā)率仍達(dá)39．40%。這表明大花紅山茶花粉在超低溫貯藏條件下能保持較高的生活力。不同山茶花種間花期相差很大，有夏季開花的杜鵑紅山茶，秋季開花的油茶，貯藏大花紅山茶花粉作為父本，對于種間雜交、解決花期不遇、培育新品種具有重要的意義。

3．3 花粉萌發(fā)率與3種保護(hù)酶活性

適宜的貯藏方法可使花粉生活力和保護(hù)酶活性保持較高的水平［7－9］，本試驗表明：－20 ℃、－80 ℃下貯藏花粉，貯藏360d后，花粉萌發(fā)率為21．30%，39．40%，分別達(dá)到原來的31．27%和57．86%，3種保護(hù)酶活性基本在原來的62．93%以上，說明貯藏360d后花粉生命力旺盛，對活性氧的清除能力強，仍能通過自身協(xié)調(diào)作用來抑制花粉衰老和失活。

研究花粉在低溫脅迫條件下的生理生化變化，有助于了解低溫脅迫對花粉傷害的機制，同時也可為今后花粉貯藏方法的選擇提供理論依據(jù)。逆境條件下，植物通常可以提高保護(hù)酶活性，清除過多的活性氧，維持代謝平衡，保持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，從而避免或減少傷害［15－17］。降低貯藏期間花粉含水量以及貯藏溫度有利于降低貯藏時的生理活動，減少營養(yǎng)消耗，但隨著貯藏時間的增長，自由基增多，出現(xiàn)膜脂過氧化作用，花粉為了避免或減少傷害，啟動3種保護(hù)酶進(jìn)行保護(hù)，清除活性氧自由基，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定。但隨貯藏時間的延長，花粉細(xì)胞水分脅迫加重，自由基出現(xiàn)累積，花粉細(xì)胞衰老出現(xiàn)氧化脅迫，大花紅山茶花粉的3種保護(hù)酶酶活性不足以消除因脅迫而造成的傷害，致使花粉生活力逐漸下降，最后死亡［7－9］。本試驗發(fā)現(xiàn)：花粉萌發(fā)率下降最快時期（常溫下24～72d，4 ℃貯藏40～120d，－20 ℃、80 ℃下40～184d），CAT、POD、SOD 酶活性迅速增高，先后出現(xiàn)高峰值，之后又逐漸下降，其中－20 ℃、80℃下CAT 的活性隨著貯藏時間的進(jìn)一步延長，又出現(xiàn)升高的趨勢。這表明在花粉貯藏過程中，萌發(fā)率下降最快期間，3種保護(hù)酶活性迅速增高，出現(xiàn)最高峰值，活性增強，協(xié)同作用以抵抗脅迫，在此前后花粉萌發(fā)率出現(xiàn)大幅度下降，推測3種保護(hù)酶活性畢竟是有限的，當(dāng)其活性不足以消除因脅迫而造成的傷害，花粉也會逐漸死亡，表現(xiàn)出花粉生活力迅速下降［7－9］。

花粉生活力在貯藏過程中逐漸降低，花粉細(xì)胞內(nèi)部的生理代謝活動與加速和抑制其衰老、失活的諸多因子緊密相關(guān)，花粉萌發(fā)率是花粉內(nèi)部保護(hù)機制效果的外在表現(xiàn)［7－9］。本試驗顯示：常溫下隨著貯藏時間的延長，SOD 首先啟動，POD 隨后啟動，而后3種保護(hù)酶活性隨著花粉萌發(fā)率的快速下降而迅速下降，這表明常溫下SOD 較為敏感，常溫不適合花粉的長期保存。4 ℃、－20 ℃下，POD 高峰值首先出現(xiàn)，但單一的SOD 的抗氧化能力有限，隨著脅迫的加劇，SOD 啟動，在120d出現(xiàn)最高值，之后迅速下降，這段時間也是花粉活力迅速下降的時期，這表明，4 ℃下POD 敏感，適合花粉1～6 個月的保存；－80 ℃下CAT 高峰值首先出現(xiàn)，貯藏360d的花粉萌發(fā)率仍達(dá)39．40%。這表明CAT 為零下低溫敏感性保護(hù)酶，－80 ℃適合大花紅山茶花粉的長 期保存。

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