楊秀蓮，林燕青，王良桂

（南京林業(yè)大學 風景園林學院，南京210037）

海州常山（Clerodendrum trichotomum Thumb）為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬（Clerodendrum L．）小喬木或灌木［1］，是既可觀花，又可冬季觀果的優(yōu)良花木［2］。海州常山具有多種抗逆性，如較強的抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿能力，可用于城市鹽堿地及礦區(qū)綠化美化、廢棄地恢復等，是一種很有應用潛力的植物樹種［1］。此外，海州常山的莖葉均含有一些重要的藥用成分［3］，又是一種極具經(jīng)濟價值的野生植物，具有較大開發(fā)潛力。

花粉是植物重要的種質(zhì)材料，其活力直接影響到植物遺傳、育種、進化、生殖等的效率［4－6］。花粉的低溫貯藏對人工授粉和雜交育種，以及解決花期不遇現(xiàn)象有重要的意義，花粉的生活力及低溫貯藏過程中其生理生化反應特征的研究是育種過程的基礎(chǔ)性工作。目前，對果樹、藥用植物、農(nóng)作物、園林植物花粉低溫保存的研究已經(jīng)逐步展開，并取得一定的成果，如日本在取得桃花粉及美國山核桃花粉保存10年仍具有活力，葡萄品種花粉保存5年活力仍然保持不變的顯著成果［6］。唐菖蒲花粉于－80 ℃超低溫保存下可保持1年的生活力［7－8］等。不同品種的海州常山花期差異較大，其雜交育種普遍存在花期不遇現(xiàn)象，但目前還沒有海州常山花粉相關(guān)的研究報道。因此，本試驗研究了貯藏方式、貯藏溫度及時間對海州常山花粉低溫貯藏效果的影響，測定并記錄了4℃及－80℃低溫貯藏過程中海州常山花粉生理生化特征變化，旨在為海州常山新品種培育、花粉庫建立及其雜交育種中花期不遇問題的解決提供參考。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

試驗用花粉材料來自江蘇鹽城海州常山基地，采集時間為2014年8月中下旬。選擇晴朗的天氣，使用鐵鑷子采集盛花期且生長健壯植株的花藥，收集于聚乙烯離心管中，迅速帶回室內(nèi)，鋪于硫酸紙上陰干1～2d后帶回南京林業(yè)大學生理生化實驗室，于25 ℃下干燥9h，將花粉以散粉和花藥的形式分別收集于聚乙烯離心管中并貼標簽，分別貯藏于4℃、－18 ℃、－80 ℃恒溫箱中?；氐靥幹袊鴸|部沿海，江蘇省中北部，長江三角洲北翼，年平均氣溫為13．7～14．5℃，極端最高氣溫為37．2℃，一年當中以7～9月份為最高，12、1、2月份為最低，年降水總量為785．2～1 309．5mm，無霜期長，土壤肥沃。

1．2 試驗處理

將采集的花粉樣品先進行干燥，再進行不同溫度預凍、解凍，以及不同貯藏方式、溫度處理，最后測試萌發(fā)率。本試驗中，花粉萌發(fā)條件及干燥條件（25℃下干燥9h）為海州常山花粉前期萌發(fā)試驗所測得的最佳條件。

1．2．1 干燥脫水花粉預凍處理 將花粉干燥（25℃下干燥9h）后，分別進行4種方式的預凍處理：4℃預冷12h后投入－80 ℃；－18 ℃預冷12h后投入－80 ℃；4 ℃預冷12h，再經(jīng)－18 ℃預冷12h后投入－80 ℃；直接投入－80 ℃。每處理3次重復，處理結(jié)束后測定花粉的萌發(fā)率。

1．2．2 低溫貯藏花粉解凍處理 以－18 ℃及－80 ℃下貯藏的花粉為試驗材料，分別進行4種解凍 試驗［7］：37 ℃水 浴 快 速 解 凍、4 ℃緩 慢 解 凍、流 動自來水（約17 ℃）解凍、25 ℃室溫自然解凍，3次重復，處理結(jié)束后測定花粉萌發(fā)率。

1．2．3 不同貯藏方式、時間及溫度處理 將干燥后（25 ℃下干燥9h）的實驗材料分別采取花藥貯藏及散粉貯藏兩種方式，分別置于室溫（25 ℃，CK）、4℃、－18 ℃、－80 ℃環(huán)境下貯藏，然后分別于3、5、7、11、15、30、60、90d后將取出的花粉進行低溫解凍（37 ℃水浴解凍）。試驗3次重復，最后測定花粉的萌發(fā)率。

1．3 測定指標和方法

1．3．1 花粉萌發(fā)率 用移液槍分裝0．1 mL 液體培養(yǎng)基（150 mg／L 氯化鈣＋150g／L 蔗糖＋200 mg／L硼酸）于每個雙孔凹玻片孔內(nèi)，使用牙簽將待試花粉均勻點入培養(yǎng)液中，使其充分混合，將凹玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫（25 ℃）有光條件下培養(yǎng)8h。在40×電鏡下觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，每處理統(tǒng)計3個視野，每個視野花粉粒數(shù)不少于50粒，每試驗3次重復，花粉萌發(fā)以花粉管長度大于花粉粒直徑為標準。

花粉萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)的花粉粒數(shù)／花粉粒總數(shù)×100%

1．3．2 低溫貯藏花粉的生理生化指標 由于可采集的花粉量有限，本試驗選取4 ℃、－84 ℃低溫下保存的花粉進行了花粉生理生化指標的測定，－18℃低溫下保存的花粉生理生化特征變化仍有待于進一步研究。將采集的新鮮花粉于－4 ℃和－80 ℃兩個溫度進行貯藏，分別測定貯藏0、15、30、60、90d后花粉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性以及丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白含量相關(guān)生理生化指標的變化。測定方法參考李合生［9］的實驗方法，采用氮藍四唑光還原法測定SOD 活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD 活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA 含量，采用蒽酮法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍G250法測定可溶性蛋白質(zhì)含量［7－8］，每個指標測定3次重復。

1．4 數(shù)據(jù)處理

對試驗所測定、記錄的數(shù)據(jù)，運用SPSS19．0軟件進行方差分析和多重比較，采用非參數(shù)檢驗方法進行正態(tài)分布檢驗，并驗證方差是否具有齊性，若數(shù)據(jù)方差具有齊性即采用Duncan方差分析法進行處理，若數(shù)據(jù)方差不具有齊性則采用Dun nets’sT3非參數(shù)檢驗法進行方差分析［10］，使用Excel軟件繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 貯藏方式、時間及溫度對海州常山花粉生活力的影響

如表1所示，就散粉低溫貯藏方式而言，室溫貯藏（CK）花粉的萌發(fā)率在11d 后接近0；在4 ℃、－18 ℃和－80 ℃低溫條件下，花粉萌發(fā)率在貯藏5～90d 后 分 別 比 貯 藏3d 下 降 了 約6．86%～94．64%、12．55%～91．87%、6．96%～81．02%，并且在貯藏7d或者11d后下降即達到顯著水平，但其在貯藏90d時仍分別有1．58%、2．09%和5．94%的萌發(fā)率。同時，與以上散粉低溫貯藏相比，以花藥方式貯藏的花粉萌發(fā)率更高。其中，室溫貯藏（CK）花粉的萌發(fā)率在15d后接近0；在4 ℃、－18 ℃和－80 ℃低溫條件下，花粉萌發(fā)率在貯藏5～90d后分別比貯藏3d下降了約1．49%～88．23%、8．23%～84．53%、1．37%～75．12%，并分別在貯藏7、11和15d后下降即達到顯著水平，但其在貯藏90d時仍分別有2．85%、4．23%和7．99%的萌發(fā)率。可見，花藥貯藏與散粉貯藏效果無顯著差異；海州常山花粉活力隨著貯藏時間的延長而逐漸降低，且下降率逐漸升高；－80 ℃低溫比－18 ℃及4 ℃低溫能更有效地延緩花粉活力的喪失，且海州常山花粉適宜在－80 ℃進行長期低溫貯藏。

2．2 預凍和解凍方式對海州常山花粉生活力影響

預凍處理旨在減輕低溫對花粉細胞原生質(zhì)的損害，植物種類不同，預凍的效果也會有較大差異［11］。如圖1所示，4種不同預凍處理方式對海州常山花粉萌發(fā)率的提高效果差異并不顯著，即程序性預凍對海州常山花粉的活力無顯著影響。相對而言，4 ℃預冷12h后投入－80 ℃處理（Ⅰ）下的花粉萌發(fā)率較高（24．82%），表明經(jīng)過4 ℃預冷12h后，花粉細胞進行了保護性脫水，從而避免了低溫貯藏過程中結(jié)冰造成的傷害［21］。可見，海州常山花粉于－80 ℃低溫貯藏時較宜采用4 ℃預冷12h的預凍方式。

表1 不同貯藏條件花粉萌發(fā)率Table 1 The pollen germination in the different conditions storage／%

同時，花粉的解凍方式對其活力也有重要影響，而植物的種類及花粉的含水量決定花粉解凍方式的選擇［11］。圖2顯示，－80 ℃低溫貯藏條件下，37 ℃水浴快速解凍（Ⅰ）后的花粉萌發(fā)率最高，并極顯著高于25℃室溫自然解凍（Ⅳ）后的花粉萌發(fā)率，其余解凍方式處理間無顯著性差異；在－18 ℃低溫貯藏條件下，4種解凍方式間花粉萌發(fā)率差異均不顯著，但仍以解凍方式Ⅰ最高，方式Ⅳ最低?？梢?，在兩種花粉低溫貯藏條件下，37 ℃水浴解凍效果均相對最佳，室溫解凍效果相對最差，其余兩種解凍效果差異不明顯，即37 ℃水浴解凍能更有效地保持花粉活力，海州常山花粉低溫保存的解凍方式較宜選用37 ℃水浴快速解凍。

圖1 不同預冷方式下花粉萌發(fā)率的變化Ⅰ．4 ℃預冷12h后投入－80 ℃；Ⅱ．－18 ℃預冷12h后投入－80 ℃；Ⅲ．4 ℃預冷12h，再經(jīng)－18 ℃預冷12h后投入－80 ℃；Ⅳ．直接投入－80 ℃Fig．1 The effects of different precooling on pollen germination rateⅠ．Precooling at 4 ℃for 12hthen put into－80 ℃；Ⅱ．Precooling at－18 ℃for 12hthen put into－80 ℃；Ⅲ．Precooling at 4 ℃for 12h，and precooling at－18 ℃for 12hthen put into－80 ℃；Ⅳ．No precooling put into－80 ℃

圖2 不同解凍方式下花粉萌發(fā)率的變化Ⅰ．37 ℃水浴解凍；Ⅱ．4 ℃解凍；Ⅲ．自來水解凍；Ⅳ．室溫解凍Fig．2 The pollen germination rate under different thawing waysⅠ．Thaw at 37 ℃water bath；Ⅱ．Thaw at 4 ℃；Ⅲ．Thaw at tap water；Ⅳ．Thaw at room temperature

2．3 低溫貯藏對海州常山花粉抗逆性生理生化指標的影響

2．3．1 SOD 和POD 活性 SOD 具有特殊的生理活性，對生物體內(nèi)自由基的清除具有極其重要的意義，通過測定SOD 活性水平高低可檢測生物體衰老與死亡狀態(tài)特征［12－13］。如圖3，A 所示，－80 ℃及4℃低溫保存過程中，海州常山花粉SOD 活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。其中，在－80 ℃低溫條件下，貯藏15d后花粉SOD 活性上升幅度較大，與新鮮花粉相比顯著上升了10．89%；之后SOD 活性開始下降，且下降幅度逐漸加??；貯藏90d后花粉SOD 活性相比新鮮花粉顯著下降了44．09%。在4 ℃低溫條件下，貯藏15d后花粉SOD 活性略有上升，其活性相比新鮮花粉僅上升了0．95%；之后SOD 活性下降幅度以緩慢－急劇－緩慢的趨勢波動；貯藏90d后SOD 活性下降了89．91% 。因此，海州常山花粉在低溫保存初期能通過自身協(xié)調(diào)SOD 活性清除體內(nèi)的自由基以適應低溫環(huán)境，但隨著低溫長時間脅迫，花粉受到了一定程度的凍害，SOD 合成受到了抑制，其活性不斷下降；－80 ℃低溫下保存的花粉SOD 活性始終明顯高于4 ℃下低溫保存的花粉。

POD 對各種不良環(huán)境十分敏感，在受低溫刺激時活性發(fā)生改變，可以作為花粉受傷害程度及其抗性大小的指標［14－15］。圖3，B顯示，－80 ℃低溫條件下，海州常山花粉POD 活性呈現(xiàn)急劇上升后又急劇下降趨勢，并于保存30d時達到峰值，此時其活性比新鮮花粉上升了274．39%，但在貯藏90d后其活性比新鮮花粉下降了27．27%。在4 ℃低溫條件下，花粉POD 活性先緩慢上升，并于60d時達到峰值，之后又急劇下降；在保存60d后其活性比新鮮花粉上升了105．72%，貯藏90d后相比新鮮花粉下降了60．61%。可見，海州常山花粉POD 活性在－80 ℃保存條件下始終顯著高于4 ℃下保存，－80℃比4℃能更有效地刺激了花粉POD 活性的提高，更有利于花粉細胞產(chǎn)生脅迫反應。

圖3 低溫保存下花粉SOD和POD活性變化Fig．3 Changes of SOD and POD activities of pollen under low temperature

圖4 低溫保存下花粉可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化Fig．4 Changes of soluble sugar and soluble protein contents of pollen under low temperature

2．3．2 可溶性糖和可溶性蛋白含量 如圖4，A 所示，4℃和－80℃低溫條件下，海州常山花粉可溶性糖含量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，且－80 ℃貯藏花粉始終低于4 ℃花粉含量。其中，在－80 ℃低溫條件下，貯藏30d后花粉可溶性糖含量達到最大值，且比新鮮花粉增加了24．55%。在4 ℃低溫條件下，貯藏15d后花粉可溶性糖含量達到最大值，比新鮮花粉增加了42．17%。這表明花粉在低溫貯藏初期能通過積累可溶性糖含量來提高自身抗寒性，但隨著時間的延續(xù)，持續(xù)低溫對花粉細胞造成了一定程度的傷害，可溶性糖含量逐漸降低，但－80 ℃比4 ℃低溫貯藏花粉的可溶性糖含量更高；－80 ℃低溫可以更有效、更長時間地刺激可溶性糖含量的積累，使花粉細胞對低溫脅迫產(chǎn)生更有效的適應性反應。

可溶性蛋白具有較強的親水性，其在低溫脅迫下能得到不斷積累，從而提高花粉細胞保水性及抗寒性。圖4，B 顯示，－80 ℃低溫條件下，花粉可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，并于貯藏30d后達到最大值，此時其含量比新鮮花粉增加了14．54%，而貯藏90d后的花粉可溶性蛋白含量比新鮮花粉下降了59．11%。4℃低溫條件下，花粉可溶性蛋白含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，貯藏90d后其含量比新鮮花粉下降了68．19%。同時，－80 ℃下貯藏的花粉可溶性蛋白含量在貯藏過程中明顯高于4 ℃下保存的花粉。以上結(jié)果表明，花粉于－80 ℃低溫貯藏初期能通過不斷積累自身可溶性蛋白含量來提高細胞抗寒性，以避免細胞受到不可恢復的傷害，但貯藏30d后可溶性糖含量不斷下降，花粉細胞受到了較嚴重傷害；在4℃低溫貯藏過程中，花粉的可溶性糖含量不斷降低，花粉細胞在4 ℃低溫下受到的傷害逐漸加重且不可逆。

3 討 論

一般來講，低溫貯藏可以有效地降低花粉呼吸強度和酶活性，以延續(xù)花粉的衰老進程，且溫度越低，花 粉 保 存 效 果 越 好［7，16－18］。隨 著 貯 藏 時 間 的 推移，花粉生活力會不斷降低，研究花粉低溫貯藏的相關(guān)技術(shù)及機理特性對花粉種質(zhì)資源保存、雜交育種等具有重要意義。

花粉細胞在低溫狀態(tài)下，其體內(nèi)新陳代謝基本停止［11］，趙嬋璞等［19］研究發(fā)現(xiàn)－80 ℃低溫可使有斑百合花粉保持2年的活力。本試驗中，－80 ℃低溫比室溫（25 ℃）、4 ℃、－18 ℃能更有效刺激花粉細胞對低溫脅迫的應激反應，有效降低花粉呼吸作用，延續(xù)了花粉壽命，總體而言，－80 ℃可實現(xiàn)海州常山花粉較長時間的貯藏。有研究［20］發(fā)現(xiàn)花藥在低溫條件下可有效地降低花粉的失水率，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)海州常山花粉進行低溫貯藏時，選用花藥貯藏效果與散粉貯藏效果差異不顯著，仍有待于進一步研究確定。

本試驗中4種預凍處理效果差異并不顯著，經(jīng)過變溫預凍的花粉貯藏效果均略優(yōu)于直接投入－80 ℃低溫下花粉貯藏效果。趙嬋璞等［19］發(fā)現(xiàn)有斑百合花粉采用液氮預凍再投入－80 ℃中貯藏，且采用35 ℃水浴解凍可有效的提高花粉萌發(fā)率。本試驗中，在－18 ℃低溫貯藏條件下，不同的解凍方式對花粉萌發(fā)率的影響并不顯著；而在－80 ℃低溫貯藏條件下，不同的預凍方式對花粉萌發(fā)率的影響并不顯著，37 ℃水浴快速解凍效果極顯著高于室溫自然解凍的效果，采用37 ℃水浴解凍效果相對較佳，可有效避免次生結(jié)冰對細胞的致死性破壞［21－22］。

低溫貯藏過程中，花粉細胞會發(fā)生一些生理生化反應，參與呼吸作用等生理過程的脂、糖、蛋白質(zhì)等生物大分子與酶活性均會發(fā)生一系列的變化。有學者研究表明，低溫貯藏時切花寒菊小花花粉SOD活性［17］隨著溫度的降低而持續(xù)上升，而福建山櫻花［18，23］、唐菖蒲花粉［8］及卷莢相思［24－25］花粉 的SOD和POD 活性則呈現(xiàn)先升后降的趨勢，可能是由于切花寒菊小花對于低溫脅迫的適應性較強，更適宜于在低溫條件下長期貯藏。本試驗測得海州常山花粉在4 ℃和－80 ℃低溫貯藏過程中，其SOD 和POD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且－80 ℃低溫保存下的花粉SOD和POD活性上升幅度較高，比4 ℃低溫更有利于刺激花粉細胞產(chǎn)生較大幅度的脅迫反應。

另外，海州常山花粉在－80 ℃及4 ℃低溫貯藏過程中，其可溶性糖含量均呈現(xiàn)先增后降的趨勢，貯藏初期可溶性糖含量顯著增加，之后逐漸下降，可見在短期低溫脅迫下海州常山花粉通過可溶性糖含量的積累增加了自身的抗寒能力，維持了自身活力，但持續(xù)低溫對其造成了傷害，影響了海州常山花粉的代 謝活動。福建 山 櫻 花［18，23］及 唐 菖 蒲 花 粉［7－9］的 低溫貯藏研究證實了花粉可溶性糖含量與其抗寒性的正相關(guān)性，本試驗也證實了這一結(jié)論。另外，詹福建等［26］的研究曾表明植物體內(nèi)的可溶性蛋白的增加能夠平衡細胞質(zhì)與液泡間的滲透勢，降低細胞傷害程度，增強其抗寒性。切花寒菊小花［17］、唐菖蒲［7－8］、福建 山 櫻 花［18，23］等 花 粉 在 低 溫 貯 藏 過 程 中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。本試驗中，－80 ℃低溫貯藏的海州常山花粉可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明低溫貯藏過程中其體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)作用較活躍，更好地適應了低溫條件，但隨著低溫脅迫時間的延續(xù)，細胞原生質(zhì)結(jié)冰加劇，對細胞造成了不可逆的傷害，可溶性蛋白質(zhì)含量不斷降低。4 ℃低溫保存條件下，海州常山花粉可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，說明4 ℃低溫脅迫不足以刺激其啟動自身的應激機制，沒有促進一些新蛋白的合成。

綜上所述，海州常山進行雜交育種時，出現(xiàn)花期不遇現(xiàn)象時，可將海州常山的花粉貯藏于－80 ℃低溫下，可在短期內(nèi)（約3個月）保持一定的活力。試驗中海州常山花粉萌發(fā)率總體偏低，貯藏時間較短，可能與花粉品種、材質(zhì)相關(guān)，或是因長距離攜帶使花粉活力降低，還需進一步研究。

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