李 珂，馬 良，杜鵬飛，王 強(qiáng)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，成都611130）

玉米小斑病是玉米的常見病害，喜溫暖潮濕的環(huán)境，在世界各個玉米產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。該病是由玉蜀黍平臍孺胞引起的真菌性病害［1］，病原菌以菌絲或分生孢子在病株殘體外越冬，菌絲發(fā)育溫度范圍在10～35℃，適溫為28～30 ℃，pH 2．6～10．0，最適pH 8．7［2］。玉米小斑病主要發(fā)生在葉部，葉片被害后，葉片組織光合機(jī)能受影響，一般造成15%～20%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時可達(dá)50%以上［3］。植保素為植物受到病原菌侵染后產(chǎn)生的具有物種特異性的次生代謝產(chǎn)物，具有廣譜抑菌活性，積極參與植物的生物防御響應(yīng)。2011年，玉米中發(fā)現(xiàn)了兩類植保素Zealexin［4］和Kauralexin［5］，分別為倍半萜和二萜化合物，具有對禾谷鐮刀菌、黃曲霉菌、炭疽菌和小孢根霉的抑菌活性，也能被這些病原菌侵染誘導(dǎo)積累。這兩類萜類植保素分別由母體倍半萜（β－macrocarpene）和二萜（異）貝殼杉烯［ent－（iso）kaurene］經(jīng)過氧化修飾而來，其代謝關(guān)鍵基因?yàn)門PS6、TPS11和An2，分別編碼萜類合成酶催 化β－macrocarpene和（異）貝 殼 杉 烯 的 產(chǎn) 生［6－7］。已有研究表明，這些代謝關(guān)鍵基因同樣能夠被病原菌侵染所誘導(dǎo)表達(dá)，和玉米萜類植保素的誘導(dǎo)積累呈正相關(guān)性［4－5］，可以作為指紋基因分析這兩類植保素的積累情況。植物對生物脅迫的響應(yīng)往往依賴植物激素的參與和調(diào)控，外源施加茉莉酸和乙烯能夠協(xié)同誘導(dǎo)Zealexin和Kauralexin的產(chǎn)生［4－5］，推測這兩類植保素的生物合成受茉莉酸和乙烯的調(diào)控。有報道表明茉莉酸甲酯能夠誘導(dǎo)水稻、葡萄、高粱等多種植物中植保素的積累［8］，顯示茉莉酸介導(dǎo)的植保素代謝機(jī)制廣泛存在于高等植物中。

雖然現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Zealexin 和Kauralexin 能夠被多種病原菌誘導(dǎo)所積累，參與生物脅迫防御響應(yīng)［4－5］，但在玉米小斑病防御響應(yīng)中的角色并不清楚，茉莉酸是否參與其中、這兩類植保素是否與各個自交系的不同抗病性有關(guān)也亟待深入研究。本研究通過分析不同抗性自交系被小斑病病原菌侵染后Zealexin、Kauralexin和茉莉酸生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，為闡明萜類植保素參與小斑病防御響應(yīng)的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為抗性育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

根據(jù)以往研究［9］，本研究使用對小斑病具有不同抗性的3個玉米自交系Mo17（較抗）、‘鄭58’（中抗）、‘吉419’（感）作為研究材料。各取10粒飽滿種子，經(jīng)氯化汞（1%）表面消毒，在培養(yǎng)箱發(fā)芽后播種于裝有高溫滅菌土壤的培養(yǎng)缽中，每個自交系種植10盆，每盆1株，放于溫室中培養(yǎng)生長。玉米小斑病病原菌用PDA 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌落鋪滿平板，用無菌水將病原菌分生孢子洗下，用0．1%吐溫－20無菌水配成濃度為每毫升105個孢子的懸浮液。當(dāng)玉米生長到21～28d時，采用噴霧接種法將孢子懸浮液噴于植株表面，噴霧后將玉米苗套袋保濕。玉米接種小斑病病原菌后的0、6、12、24、36和48h，以0h為對照，取對照組和處理組玉米相同部位葉片0．5～1．0g，液氮研磨成粉末于－80℃保存，取材過程中觀察有無病斑產(chǎn)生并記錄。玉米自交系葉片總RNA 采用Trizol方法提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，用Nanodrop2000測定濃度。

1．2 An2基因表達(dá)的RT－PCR分析

質(zhì)量檢測合格的RNA 使用寶生物的M－MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Ef1α作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Ef1α（GenBank 登 錄 號NM－001112465）和An2（Gen－Bank登錄號NM－001111787）的基因序列，在Primer 3上設(shè)計(jì)特異性引物用于半定量RT－PCR 分析（表1）。其擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5min，95 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30個循環(huán)。內(nèi)參基因和目的基因分別進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Gelred染色照相。

1．3 TPS6、TPS11、An2 和AOC 基因表達(dá)的qRTPCR 分析

為了定量分析玉米萜類植保素代謝關(guān)鍵基因表達(dá)情況，使用Primer 3在線軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，確保每對引物Tm 值相同，在60 ℃左右，引物G＋C 含量在40%～60%，避免自我互補(bǔ)和3′端重復(fù)的G 或C，擴(kuò)增片段大小在80～120 bp。以接種小斑病病原菌不同時間后材料的cDNA作為模板，以Ef1a 作為內(nèi)參基因，使用Bio－Rad公司的SsoFast Eva Green Supermix 試劑在Bio－Rad CFX96 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，55℃退火15s，72 ℃延伸20s，40個循環(huán)，每個樣品均設(shè)3個重復(fù)，采用 儀 器 自 帶 的Bio－Rad CFX Manager 軟 件 按2－ΔCt法處理數(shù)據(jù)，使用Origin 9 作圖。Ef1a 引物同時用于半定量和定量PCR。

表1 RT－PCR和qRT－PCR分析引物Table 1 The primers for RT－PCR and qRT－PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2．1 小斑病病原菌誘導(dǎo)An2基因表達(dá)的RT－PCR分析

不同抗性玉米葉片中An2基因表達(dá)的半定量RT－PCR 結(jié)果（圖1）顯示，接種后48h內(nèi)，An2基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯增加趨勢，其中Mo17和‘吉419’的An2表達(dá)呈先增后降再增加的趨勢。接種0～6h內(nèi)，‘鄭58’葉片中未檢測到An2的積累，接種24h時An2有明顯積累。接種后48h，Mo17、‘鄭58’和‘吉419’的An2表達(dá)量達(dá)到高峰。半定量RT－PCR分析顯示玉米萜類植保素代謝能夠響應(yīng)小斑病病原菌的侵染，不同抗性品種中An2 均能被誘導(dǎo)表達(dá)，推動Kauralexin的誘導(dǎo)積累以參與對小斑病病原菌的防御。

2．2 小斑病病原菌誘導(dǎo)TPS6、TPS11、An2基因表達(dá)的qRT－PCR分析

圖1 小斑病病原菌脅迫下3種不同抗性玉米自交系中An2基因表達(dá)的RT－PCR分析Fig．1 RT－PCR analysis of An2gene expression in three maize inbred lines in response to C．heterostrophus infection

上述的實(shí)驗(yàn)證明玉米萜類植保素代謝能夠響應(yīng)小斑病病原菌的侵染，為了準(zhǔn)確分析各個自交系在小斑病病原菌侵染下萜類植保素的防御響應(yīng)和代謝差異，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR 檢測Zealexin 和Kauralexin生物合成的關(guān)鍵基因TPS6、TPS11、An2的表達(dá)模式。結(jié)果（圖2）顯示，Mo17中TPS6、TPS11基因基本不被誘導(dǎo)表達(dá)，甚至TPS11 基因表達(dá)還有少許下調(diào)?！?8’中TPS6基因表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在小斑病病原菌侵染12 h后，TPS6、TPS11 基因表現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢，在24h時2 個基因表達(dá)量達(dá)到最大?！?19’中TPS6、TPS11 基因表達(dá)量在侵染12h 后逐漸增加，但要慢于‘鄭58’，在48h后才達(dá)到最大。相對于TPS6、TPS11，‘吉419’中An2基因誘導(dǎo)表達(dá)趨勢明顯，在侵染24h 后就達(dá)到最大，這與半定量RT－PCR 結(jié)果有一定差異，表明后者結(jié)果的不確定性，需定量PCR 進(jìn)行準(zhǔn)確分析。Mo17的An2基因在侵染后的早期就被誘導(dǎo)表達(dá)，表明其具有對病原菌侵染的快速響應(yīng)機(jī)制。‘鄭58’中An2基因盡管被誘導(dǎo)表達(dá)，但上升幅度不顯著?？偟膩碚f，對于TPS6、TPS11，‘鄭58’基 因 誘 導(dǎo) 表 達(dá) 快 于‘吉419’，而Mo17中TPS6、TPS11誘導(dǎo)不明顯，但其本底表達(dá)高于其余2個自交系。而對于An2，Mo17中基因誘導(dǎo)表達(dá)明顯快于另外2個自交系。

圖2 玉米小斑病病原菌侵染下3種玉米自交系中TPS6（A）、TPS11（B）、An2（C）和AOC（D）基因表達(dá)定量分析Fig．2 qRT－PCR analysis of gene expression of TPS6（A），TPS11（B），An2（C）and AOC（D）in three maize inbred lines in response to C．heterostrophus infection

2．3 茉莉酸代謝關(guān)鍵基因AOC 的qRT－PCR分析

茉莉酸廣泛參與植物的脅迫響應(yīng)，其生物合成關(guān)鍵基因AOC 的表達(dá)情況能夠反映出植物體內(nèi)茉莉酸代謝情況及其對植物代謝的調(diào)控，結(jié)合植保素代謝基因的防御響應(yīng)表達(dá)模式，能推測出茉莉酸和植保素代謝在生物脅迫防御中的關(guān)系。結(jié)果（圖2，D）顯示，接種小斑病病原菌后，Mo17中AOC 基因表達(dá)表現(xiàn)為先增加后減少再增加的趨勢，在12h表達(dá)量最大；‘鄭58’中AOC 基因表達(dá)量在6 和24h上調(diào)，12h基因表達(dá)量最低；‘吉419’中AOC 基因表達(dá)有下調(diào)的趨勢，在12h基因表達(dá)量最低。隨著侵染時間延長，‘吉419’中AOC 基因表達(dá)量在24h明顯增加，差異顯著，在48h達(dá)到最高。

3 討 論

植物與環(huán)境長期相互作用下自身會形成一套精密的防御網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，比如誘導(dǎo)合成植保素、茉莉酸等小分子化合物參與生物或非生物脅迫應(yīng)答。分析合成萜類植保素和防御激素茉莉酸關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，對于研究不同抗性自交系／品種的次生代謝產(chǎn)物對玉米小斑病防御響應(yīng)有重要意義。以往的研究已經(jīng)確定玉米萜類植保素代謝關(guān)鍵基因的誘導(dǎo)表達(dá)和植保素的誘導(dǎo)積累具有正相關(guān)性［4－5］。相對于測定植保素含量的復(fù)雜提取步驟和昂貴的GC－MS 分析，用PCR 技術(shù)分析植保素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而確定植保素的代謝情況更加便捷實(shí)惠。本研究中，采用半定量和定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)不同抗性自交系對小斑病病原菌侵染表現(xiàn)出不同的防御響應(yīng)機(jī)制。Mo17在病原菌侵染過程中，TPS6、TPS11基因誘導(dǎo)表達(dá)不顯著，而An2 基因表達(dá)迅速增加，AOC 基因表達(dá)在接種0～12h 內(nèi)明顯上調(diào)。‘鄭58’在接種小斑病病原菌后，TPS6、TPS11基因表達(dá)為先增加后減少的趨勢，在24h 積累量達(dá)到高峰。An2 基因表達(dá)逐漸增加但差異不顯著。而AOC 基因表達(dá)量在接種6h 后顯著增加。當(dāng)‘吉419’受到病原菌侵染時，TPS6、TPS11基因表達(dá)量逐漸增加，但要慢于‘鄭58’，而An2基因盡管在侵染24h時表達(dá)量達(dá)到最大，但響應(yīng)時間明顯遲于另外2個抗性自交系。

抗病與感病株系的一個主要差異在于能否快速激發(fā)自身的防御機(jī)制及時地限制病原體的入侵?？共≈晗禃焖偌せ畲蠓秶姆烙憫?yīng)，阻止病原體進(jìn)一步入侵。但是，感病株系只表現(xiàn)出微弱的響應(yīng)并且不能限制病原體的入侵和生長，結(jié)果可能會導(dǎo)致植物嚴(yán)重的損傷和大量的細(xì)胞死亡［10］。在病原菌侵染下，植物可以通過合成植保素等次級代謝產(chǎn)物來增強(qiáng)自身防御。本研究中，Mo17和‘鄭58’受到病原菌侵染6h就能快速激活植保素和茉莉酸代謝關(guān)鍵基因，積極參與防御響應(yīng)，抵御小斑病的侵染。相反，‘吉419’在接種小斑病病原菌后，TPS6、TPS11、An2基因都是在24h才顯著上調(diào)，相對于抗病自交系反應(yīng)遲緩，表現(xiàn)為對小斑病的易感性狀。

Mo17的TPS6、TPS11基因誘導(dǎo)表達(dá)不顯著，推測Zealexin 積累對于小斑菌侵染影響較小，但AOC 基因誘導(dǎo)表達(dá)顯著，表明茉莉酸防御機(jī)制較快速啟動，能促進(jìn)包括植保素合成基因在內(nèi)的抗性基因的誘導(dǎo)表達(dá)，快速提高植物的防御能力?！?8’在病原菌侵染過程中，TPS6、TPS11 和An2 基因分別在24和48h達(dá)到最大。而在6h 時，TPS6、TPS11基因基本不表達(dá)，主要是誘導(dǎo)茉莉酸參與外來病原菌的防御響應(yīng)。對于具有較高抗性的Mo17和‘鄭58’，茉莉酸基因誘導(dǎo)表達(dá)早于兩類植保素代謝關(guān)鍵基因，可能促進(jìn)其他防御機(jī)制的啟動［11］。而感病自交系‘吉419’在接種12h后才積極誘導(dǎo)體內(nèi)抗病相關(guān)基因表達(dá)以參與抵抗病原菌侵染，并且在24h茉莉酸和Kauralexin代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量達(dá)到最高，兩者相互作用參與防御應(yīng)答，在侵染48h后Zealexin代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量最高，表明隨著病原菌的侵染，茉莉酸和兩類植保素之間積極地協(xié)同抵御小斑病的侵染。

植物抗病防御響應(yīng)涉及一個龐大而復(fù)雜的系統(tǒng)，植物在與病原菌長期相互作用和共同進(jìn)化過程中，通過各種代謝途徑在體內(nèi)形成多種多樣的抵抗病原菌侵染的代謝物［12］。本研究通過分析不同玉米抗性自交系中兩類植保素和茉莉酸代謝關(guān)鍵基因?qū)τ衩仔“卟〉姆烙鶓?yīng)答，解析了不同品種間抗性的差異，為進(jìn)一步探究植保素和激素在玉米重要病害防御響應(yīng)中的關(guān)系提供依據(jù)，也為萜類植保素在抗性育種中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

［1］ ZHONG CH M（鐘承茂）．The occurrence and integrated control technology of southern leaf blight［J］．Agricultural Extension Service（農(nóng)技服務(wù)），2008，25（2）：83－84（in Chinase）．

［2］ 賴傳雅．農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)［M］．北京：科學(xué)出版社，2003：72．

［3］ ZENG X（曾 興），LI Y（李 蕓），LIN H J（林海建），et al．Differences in different resistant maize inbred lines after inoculation with Rhizoctonia solani expression［J］．Journal of Agricultural Biotechnology（農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報），2011，19（2）：250－257（in Chinase）．

［4］ ALISA H，F(xiàn)ATMA K，MARTHA M，et al．Novel acidic sesquiterpenoids constitute a dominant class of pathogen－induced phytoalexins in maize［J］．Plant Physiology，2011，156（4）：2 082－2 097．

［5］ ERIC A S，F(xiàn)ATMA K，ALISA H，et al．Identity，regulation and activity of inducible diterpenoid phytoalexins in maize［J］．PNAS，2011，108（13）：5 455－5 460．

［6］ KOLLNER T G，SCHNEE C，LI S，et al．Protonation of a neutral（S）－beta－bisabolene intermediate is involved in（S）－beta－macrocarpene formation by the maize sesquiterpene synthases TPS6and TPS11［J］．The Journal of Biological Chemistry，2008，283（30）：20 779－20 788．

［7］ HARRIS L J，SAPARNO A，JOHNSTON A，et al．The maize An2gene is induced by Fusariumattack and encodes an ent－copalyl diphosphate synthase［J］．Plant Molecular Biology，2005，59（6）：881－894．

［8］ AHUJA I，KISSEN R，BONES A M．Phytoalexins in defense against pathogens［J］．Trends in Plant Science，2012，17（2）：73－90．

［9］ 王曉鳴，王會偉．玉米大斑病小斑病及其防治［M］．北京：金盾出版社，2009：119－120．

［10］ 韓志群．硫酸鋅、賽眾28及菌根健對玉米抗性相關(guān)酶和基因表達(dá)水平影響［D］．河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012．［11］ RABBANI M A，MARUYAMA K，ABE H，et al．Monitoring expression profiles of rice genes under cold，drought and high－salinity stresses and abscisic acid application using cDNA microarray and RNA gel－Blot analyses［J］．Plant Physiology，2003，133（4）：1 755－1 767．

［12］ XIA Q ZH（夏啟中），ZHANG M J（張明菊），et al．Basic metabolism of plant disease resistance［J］．Journal of Huanggang Polytechnic（黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報），2004，6（3）：38－41（in Chinase）．