程 剛，蘭海燕

（新疆大學生命科學與技術(shù)學院新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046）

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是C4光合途徑中重要的光合調(diào)控酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的β－羧化并以四碳酸形式固定CO2，充當CO2泵 的 作 用［1－3］。PEPC 存 在 于 所 有 植 物、綠 藻、光合細菌、古細菌及非光合細菌中，主要參與C4及景天酸光合代謝途徑［4－5］。PEPC 在植物中主要以C4型、C3型、CAM 型 以 及 細 菌 型4 種 同 工 酶 形 式存 在［6－7］。除 了調(diào)控光 合 作 用，PEPC 還 參 與 三 羧 酸循環(huán)（TCA）中各種生物合成及氮同化過程所消耗的中間產(chǎn)物的回補反應，在植物、藻類及細菌中起到重要的非光合協(xié)調(diào)作用［8－10］。除此之外，PEPC在植物應對逆境脅迫中也發(fā)揮重要作用，如非生物脅迫中的鹽［11］、干旱［12］、低溫［13］、臭氧脅迫［14］等均能誘導PEPC 基因上調(diào)表達，參與植物抗逆反應。特別是通過轉(zhuǎn)基因方法將C4植物PEPC 基因?qū)隒3經(jīng)濟作物中，以提高其光合速率及脅迫耐受性，從而增加作物產(chǎn)量和適應性的研究已被廣泛報道。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)玉米PPDK 和PEPC 基因的擬南芥和水稻較對照具有更高的光合速率［15－16］，干旱脅迫下，過表達PEPC 水稻較對照具有更高光耐受性［17］。在生物脅迫中，一些植物病毒能夠誘導PEPC 基因的高表達，間接幫助植物抵御病毒侵害［18］。

近年來發(fā)現(xiàn)的幾種單細胞C4植物光合碳同化模式［19］，為人類進一步認識光合碳同化途徑及其進化關(guān)系提供了新證據(jù)。異子蓬（Suaeda aralocaspica）作為藜科異子蓬屬一年生鹽生植物，在中國僅分布于新疆，生長于重度鹽化荒漠，整個生活史均具極強的抗逆性［20］。異子蓬特有的單細胞C4光合途徑，能夠在單個葉肉細胞內(nèi)經(jīng)極性區(qū)隔化分布的兩種異型葉綠體進行高效光合作用［21］。因此，探索單細胞C4植物異子蓬中PEPC 的相關(guān)功能對揭示該物種高光效機制及逆境脅迫響應機制具有重要意義。前期研究中發(fā)現(xiàn)異子蓬中至少有2 種植物型PEPC（根據(jù)文獻命名為PEPC－1型和PEPC－2型），目前 獲 得 了PEPC－1 型PEPC 基 因 的cDNA 全長［22］。本 研 究 通 過 原 核 表 達 異 子 蓬PEPC－1 型PEPC 基因，分析了PEPC 在原核表達系統(tǒng)中的酶學特性，并檢測了PEPC 重組菌在非生物脅迫下的耐受性能。本研究為后續(xù)深入分析PEPC的功能及利用其改良作物光合特性和抗逆性提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

異子蓬（Suaeda aralocaspica）種植于新疆大學新疆生物資源基因工程重點實驗室陽臺。本研究所用的菌株、質(zhì)粒和PCR 擴增用引物序列見表1。

1．2 方 法

1．2．1 cDNA 全長序列的克隆 取發(fā)育2 個月的異子蓬幼苗嫩葉0．15g，于液氮中磨碎至均勻粉末狀，用RNAprep Pure植物總RNA 提取試劑盒（天根）提取異子蓬總RNA，置－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取 上 述 總RNA 1 μg，用 M－MLV 試 劑 盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，以此作為模板，根據(jù)已報道異子蓬PEPC 基因的部分序列（DQ538353），以及近源種中相似性較高的PEPC保守編碼序列（DQ538352、AY950667）設(shè)計簡并引物（表1），獲得部分序列（缺失5′端）。PCR 反應程序為94 ℃預變性5min；94 ℃變性30s，58．8 ℃復性30s，72 ℃延伸3min，30個循環(huán)后，72℃延伸7 min。隨后，利用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，TaKaRa）及引物GSP1和NGSP1擴增獲得PEPC 基因5′端序列。獲得的PEPC 全長cDNA 由上海Sangon公司測序。

1．2．2 PEPC生物信息學分析 用http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov程序進行序列比對，并用Clustal X 進 行 多 序 列 比 對 分 析［23］。用http：／／web．expasy．org／translate／在線軟件進行蛋白翻譯分析；利 用Protparam（http：／／web．expasy．org／protparam／）對蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)進行預測；Motif Scan（http：／／myhits．isb－sib．ch／cgi－bin／motif＿scan）對蛋白質(zhì)功能位點進行預測分析；http：／／cello．life．nctu．edu．tw 在線軟件進行亞細胞定位預測；SignalP4．0（http：／／cbs．dtu．dk／services／SignalP／）預測蛋白質(zhì)信號肽序列；http：／／expasy．org／tools／protscale．html分析蛋白親疏水性；Predict－Protein（https：／／www．predictprotein．org）及Swiss－Model（http：／／swissmodel．expasy．org／）預測蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)。

表1 菌株、質(zhì)粒和PCR 擴增所用引物Table 1 Strains，plasmids and PCR amplification primers used in this study

1．2．3 基因誘導表達及免疫印跡分析 將E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 重 組 菌 和E．coli Transetta：：pGEX－4T－1對照菌，接種于含100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、220r／min 培 養(yǎng) 至OD6000．4～0．6，加 入0．8 mmol／L IPTG 誘導4h。離心收集5mL 菌液，用PBS（pH 7．4）緩沖液洗滌菌體2次，加入1mL PBS緩沖液，超聲波破碎菌體（功率200 W，超聲3s，間隔10s，重復10次），隨后4 ℃、12 000g離心10min，取上清及1 mL PBS 緩沖液重懸沉淀進行SDS－PAGE檢測。SDS－PAGE結(jié)束后，90V 歷時50 min將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。先用1∶10 000 稀釋GST Tag鼠源單克隆抗體與膜反應2h，再用1∶10 000羊抗小鼠IgG 二抗孵育2h，洗膜后加入DAB顯色液室溫避光孵育5～10 min，至出現(xiàn)目的條帶后終止顯色反應，觀察結(jié)果。

1．2．4 重組菌表達蛋白的酶活分析 用索萊寶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶試劑盒（北京）和朗頓植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海），檢測E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 重組菌的PEPC 酶活性和蛋白含量，以空載菌株E．coli Transetta：：pGEX－4T－1 作 為 對 照。樣 品 前 處理步驟為：離心收集10mL 菌液，用PBS（pH 7．4）緩沖液洗滌菌體2 次，加入1 mL 提取液（含100 mmol／L PMSF的PBS 緩 沖 液），超 聲 波 破 碎 菌 體（功率200 W，超聲3s，間隔10s，共5min），隨后4℃、8 000g離心10min，取上清，置冰上待測。按照Deng等［24］的方法，在340nm 處檢測樣品吸光度，通過監(jiān)測NADH 的減少量來評價PEPC 酶活，每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）評價菌體中PEPC的含量變化水平。

1．2．5 重組菌的生長和脅迫耐受性測定 重組菌生長情況測定按照Narayan等的方法［25］，并做適當修改。菌體在0．8mmol／L IPTG 誘導表達4h，調(diào)節(jié)重組菌E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 和對照 菌 株E．coli Transetta：：pGEX－4T－1 的 初 始OD 值相等，按1%（v／v）的接種量2 次 轉(zhuǎn)接至含100μg／mL氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，每隔2 h取樣，在600nm 處測定菌液OD 值。

重組菌E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC和對照菌株E．coli Transetta：：pGEX－4T－1的非生物脅迫耐受性檢測按照Singh等方法［5］，并做適當修改。將0．8mmol／L IPTG 誘導表達4h后的重組菌和對照菌株調(diào)節(jié)OD 值一致，按1%（v／v）的接種量，接種在添加有200 ～800 mmol／L NaCl、5%～20%PEG 6 000、50～400μmol／L甲基紫精以及pH 3．0～11．0的LB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃、220r／min振蕩培養(yǎng)。溫度脅迫實驗是將誘導后培養(yǎng)物添加到LB（pH 7．0），于25℃～52℃，220r／min振蕩培養(yǎng)。所有非生物脅迫實驗每2h取樣1次，在600 nm 處 檢 測 菌 液OD 值。

1．3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖采用GraphPad Prism 5．01軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2．1 PEPC 基因克隆及原核表達

以異子蓬總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，通過5′－RACE和同源克隆技術(shù)，對目的片段進行擴增，得到3 000bp左右條帶（圖1，A），與預期片段大小一致。

測序結(jié)果表明，PEPC 基因cDNA 全長為2 901 bp。在線蛋白翻譯分析（http：／／web．expasy．org／translate／）發(fā)現(xiàn)，該序列具有完整讀碼框，可進行后續(xù)蛋白表達。后將PEPC 基因重組子轉(zhuǎn)化E．coli Transetta（DE3），得到重組菌E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC（圖1，B）。

圖1 異子蓬PEPC 基因cDNA 擴增（A）及重組原核表達載體pGEX－4T－1－PEPC 雙酶切鑒定（B）M1．DL 5 000；M2．DL 15 000；A．1．PEPC 基因PCR 擴增產(chǎn)物；B．1．EcoRⅠ和NotⅠ消化的pGEX－4T－1；2．EcoRⅠ和NotⅠ消化的pGEX－4T－1－PEPC 重組質(zhì)粒。Fig．1 PCR results of PEPCcDNA of S．a(chǎn)ralocaspica（A）and restriction digestion of pGEX－4T－1－PEPCvector（B）M1．DL 5 000；M2．DL 15 000；A．1．PEPCgene fragment by PCR；B．1．pGEX－4T－1digested by EcoRⅠand NotⅠ；2．Recombinant plasmid pGEX－4T－1－PEPCdigested by EcoRⅠand NotⅠ．

2．2 異子蓬PEPC生物信息學分析

本研究通過生物信息學平臺系統(tǒng)分析了異子蓬PEPC的蛋白信息。ProtParam 分析發(fā)現(xiàn)，異子蓬PEPC 基因編碼966 個氨基酸，理論分子量為110．2kD，等電點為6．10。該蛋白質(zhì)的主要氨基酸構(gòu)成為Leu（12．2%）、Glu（8．5%）、Arg（7．3%）、Ala（6．8%）、Asp（6．1%），推測的分子式為C4903H7801N1361O1450S37。理論不穩(wěn)定系數(shù)為38．65，屬于穩(wěn)定型蛋白。親水性及疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白多肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸且均勻分布，因此推測異子蓬PEPC屬于親水蛋白。

前人研究發(fā)現(xiàn)，植物中C4型PEPC 的C 末端第774位或附近的1 個氨基酸殘基為保守絲氨酸（Ser），而C3型PEPC 的 相 應 位 置 則 為 丙 氨 酸（Ala）［21－22］。本研究克隆的異子蓬PEPC 在C 末端第775位氨基酸是丙氨酸（圖2），推測可能屬于C3型PEPC，并將其命名為PEPC－1型PEPC。

異子蓬PEPC 蛋白功能位點與功能域預測發(fā)現(xiàn)，163～966位氨基酸之間存在一個典型PEPC 結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列分析表明，異子蓬PEPC 含有植物型PEPC所有基本模體、保守殘基、催化位點及磷酸化和泛素化位點［26］（圖2）。其中，位于N 端的11SIDAQLR17模體，在C4、CAM 及部分C3植物中參與調(diào)控植物酶活性的晝夜變化，該模體中的絲氨酸殘基為專一磷酸化位點［27］。位于C 端的963QNTG966模 體 決 定 了PEPC 最 大 催 化 活 性［28］。640GRGGTVGRGG649模體中R647殘基直接參與該酶的羧化反應［29］。根據(jù)PROSITE 數(shù)據(jù)庫分析，異子蓬PEPC氨基酸序列含有2 個大的PEPC 活性位點，分別位于169～180 氨基酸位點（PS00781，Vl－TAHPTQsiRR）和 592 ～604 氨 基 酸 位 點（PS00393，VMIGYSDSgKDAG）之間。

PEPC亞細胞定位和結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，異子蓬PEPC位于線粒體基質(zhì)空間、線粒體內(nèi)膜、線粒體間隙和葉綠體類囊體膜的可能性系數(shù)分別為0．527、0．255、0．255 和0．280。PEPC 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白不含信號肽，屬于非分泌型蛋白。

利用PredictProtein程序預測異子蓬PEPC 二級結(jié)構(gòu)（圖3）分析發(fā)現(xiàn)，α－螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈含量分別為65．73%、30．43%和3．83%，α－螺旋和無規(guī)則卷曲大量分布，而延伸鏈稀疏地散布在其中。利用Swiss－Model程序提供的同源建模法，對異子蓬PEPC蛋白質(zhì)進行同源建模，獲得的三級結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖2 異子蓬PEPC氨基酸序列的分析方框標示酶催化反應中重要的結(jié)構(gòu)域；灰色背景標示保守殘基；黑色背景標示功能位點；下劃線標示模體Fig．2 Analysis of amino acid sequence of PEPC fromS．a(chǎn)ralocaspica Boxes indicate the important catalytic domains；Gray and black indicate the conserved residues and functional sites，respectively；Underline sequences mean motifs

圖3 異子蓬PEPC三級結(jié)構(gòu)預測Fig．3 The predicted tertiary structure of PEPC protein

2．3 異子蓬PEPC蛋白誘導表達及免疫印跡分析

SDS－PAGE結(jié)果顯示，重組菌E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 樣品在130kD 處有差異表達條帶（PEPC 110kD＋GST 26kD），表明構(gòu)建原核表達載體正確（圖4，A）。取超聲處理后菌體上清及沉淀進行蛋白可溶性檢測（圖4，B）。結(jié)果表明目的蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。

Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌和對照菌E．coli Transetta：：pGEX－4T－1 經(jīng)IPTG 誘導后分 別檢測到GST 融合蛋白（130kD）和GST 標簽（26 kD），且重組菌未誘導情況下也檢測到較弱條帶，說明PEPC存在本底表達（圖4，C）。

2．4 重組蛋白的酶活分析

圖4 PEPC重組蛋白的SDS－PAGE及Western blot分析A 和B．SDS－PAGE分析：M1．蛋白質(zhì)分子量對照；1．重組菌誘導前；2．重組菌誘導后；3．重組菌誘導前總蛋白；4．重組菌誘導前上清；5．重組菌誘導前上清；6．重組菌誘導后總蛋白；7．重組菌誘導后沉淀；8．重組菌誘導后上清；C．Western blot分析：M2．預染蛋白質(zhì)分子量對照；9．對照菌誘導后；10．重組菌誘導后。箭頭所示為PEPC重組蛋白條帶。Fig．4 Analysis of the recombinant PEPC protein by SDS－PAGE and Western blot A and B．SDS－PAGE analysis of recombinant PEPC protein．M1．Protein molecular weight marker；1．Un－induced recombinant E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC；2．Induced recombinant E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC；3．Total crude extract of un－induced recombinant strains；4．Insoluble fraction of un－induced recombinant strains；5．Soluble fraction of un－induced recombinant strains；6．Total crude extract of induced recombinant strains；7．Insoluble fraction of induced recombinant strains；8．Soluble fraction of induced recombinant strains；C．Western blot analysis of recombinant PEPC protein．M2．Prestained protein molecular weight marker；9．Induced control E．coli Transetta：：pGEX－4T－1；10．Induced recombinant E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC．The arrow indicates the target recombinant PEPC protein．

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和分光光度法，對E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 重 組 菌PEPC蛋白含量及活性進行了測定。結(jié)果表明，重組 菌經(jīng)0．8mmol／L IPTG誘導4h，PEPC含量達0．19ng／mL，分別是非誘導組和對照組的2．01和29．69倍（圖5）。PEPC活性為176．13U／mg，分別是非誘導組和對照組的2．35和5．38倍。該結(jié)果表明通過IPTG 誘導，重組菌表達了目的蛋白PEPC且具有活性。非誘導重組菌中PEPC 基因有少量泄漏表達，因此與對照菌相比檢測到一定的PEPC含量及活性。

2．5 重組菌脅迫耐受性測定

為 了 驗 證PEPC 重 組 菌E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 在不同非生物脅迫下的耐受性，本研究檢測了200～800mmol／L NaCl、5%～20%PEG6000、25 ℃～52 ℃、50～400μmol／L甲基紫精和pH 3．0～11．0等不同條件下的菌體生長（圖6，A～E）。結(jié)果顯示，在400mmol／L NaCl處理12h時，重組菌液OD600值是對照的1．58 倍。在10%PEG 6 000、25 ℃、75μmol／L 甲基紫精和pH 9．0脅迫下，重組菌分別是對照的1．25、2．73、1．92和1．82倍。并且，隨著脅迫增強，重組菌的生長呈現(xiàn)優(yōu)于對照菌的趨勢。以上結(jié)果表明，過量表達PEPC能夠賦予宿主菌更好的耐受非生物脅迫的能力。

圖5 異子蓬PEPC蛋白含量和活性測定1．對照菌非誘導；2．重組菌非誘導；3．重組菌誘導后；圖中數(shù)據(jù)為平均值±SD（n＝3）；下同。Fig．5 The protein content and enzyme activity of PEPC fromS．a(chǎn)ralocaspica 1．Un－induced control E．coli Transetta：：pGEX－4T－1；2．Un－induced recombinant E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC；3．Induced recombinant E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC；Bar represents mean±SD of three replicates；The same as below．

本研究進一步探討了400 mmol／L NaCl、10%PEG 6 000、25 ℃、75μmol／L 甲基紫精、pH 9．0等單一非生物脅迫條件下菌體生長情況（圖7，B～F）。結(jié)果顯示，在正常條件下（37℃、pH 7．0），重組菌和對照菌生長沒有差異，10h 后基本達到平穩(wěn)期（圖7，A）。在脅迫條件下，除10%PEG 6 000以外，12 h兩者菌體生長量均有顯著差異，并且對照菌的生長受到明顯脅迫抑制。以上結(jié)果表明，PEPC 基因的表達促進了菌體在非生物脅迫下的生長。

圖6 非生物脅迫下的菌體生長檢測Fig．6 Strains growth under various abiotic stresses

3 討 論

圖7 E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC 重組菌在不同非生物脅迫下的生長檢測Fig．7 Growth of the recombinant E．coli Transetta：：pGEX－4T－1－PEPC under different abiotic stresses

盡管PEPC 基因在C3或具花環(huán)結(jié)構(gòu)的C4植物中已被廣泛研究，但在單細胞C4植物中的研究鮮見報道。本研究克隆了單細胞C4植物異子蓬PEPC 基 因cDNA全 長 序 列，包 含2 9 0 1bp個 核 苷酸，編碼966個氨基酸，序列中含有多個PEPC已知模體、保守殘基、酶催化位點、磷酸化和泛素化位點及兩個大的PEPC 活性位點［22］。氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，異子蓬PEPC 序列與甜菜（Beta vulgaris）、五色莧（Alternanthera ficoidea）及蓮子草（Alternanthera sessilis）的同源性最高，均達90%以上［22］。通過生物信息學方法對異子蓬PEPC 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能位點等預測分析發(fā)現(xiàn)，異子蓬PEPC同其他種屬植物型PEPC類似［30－31］。該蛋白主要分布于線粒體基質(zhì)，屬于無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽的非分泌蛋白。對其三級空間結(jié)構(gòu)分析顯示，異子蓬PEPC主要以α－螺旋為主，其酶催化反應結(jié)構(gòu)域位于蛋白中心位置，符合酶活性中心局限于大分子一定區(qū)域的規(guī)律［32］。

經(jīng)免疫印跡檢測原核表達的130 kD 重組GST－PEPC蛋白主要以包涵體形式存在，在菌體裂解后上清及未誘導情況下也有少量表達。本實驗克隆的異子蓬PEPC 屬PEPC－1型，其體外重組酶活性檢測顯示，底物PEP能夠在PEPC及蘋果酸脫氫酶催化下，通過消耗NADH 最終生成蘋果酸，該結(jié)果與Park等研究結(jié)果一致 。眾所周知，PEPC作為重要的光合關(guān)鍵酶在植物中被廣泛研究。C4型PEPC在C4光合途徑中催化PEP 結(jié)合大氣中CO2形成四碳酸，后經(jīng)脫羧作用釋放CO2，并將其供給C3循 環(huán) 使 用，起 到 了CO2濃 縮 作 用［5，9，22］。C3型（和／或根型）PEPC 在C3及C4植物中則可能在三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)的回補反應中行使重要功能，包括草酰乙酸（OAA）、蘋果酸等［5］。

已有大量報道集中在PEPC 抗逆功能的研究。在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達C4植物PEPC，能不同程度地增強植物抵御和適應外界脅迫的能力。除了增強植物耐旱［34－35］、耐鹽［11］、耐高 溫［17］等能力 外，Beguma等［36］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PEPC 基因水稻具有耐受重金屬毒害的能力。此外，在E．coli中過量表達PEPC基因有利于細胞抵御逆境脅迫［5，33］。本研究也發(fā)現(xiàn)原核表達的PEPC蛋白在NaCl、PEG 6 000、甲基紫精（MV）、pH 3．0～11．0 的脅迫下能促進菌體生長，由此推測PEPC 在非生物脅迫下參與了E．coli耐受非生物脅迫的脅迫生理過程，該結(jié)果與Singh等研究結(jié)果相符［5］。推測PEPC參與脅迫應答可能存在兩種機制，一是PEPC能夠催化PEP生成OAA 和／或隨后的蘋果酸，OAA 在TCA 循環(huán)中起重要的回補反應［37－38］；二是菌體內(nèi)積累大量的蘋果酸能夠作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)幫助抵御脅迫產(chǎn)生的細胞損傷［39－40］。因此，PEPC作為一種重要的酶，能夠促進菌體積極應對逆境脅迫。這進一步佐證了PEPC抗逆性能研究在生物逆境生理研究領(lǐng)域的重要性。

本研究原核表達了異子蓬PEPC－1 型PEPC基因，該基因的異源表達提高了E．coli耐受非生物逆境脅迫的能力。因此，本研究將為PEPC 逆境生理和逆境生物的工程改造提供了信息。

［1］ UHRIG R G，O＇LEARY B，SPANG H E，et al．Coimmunopurification of phosphorylated bacterial－and plant－type phosphoenolpyruvate carboxylases with the plastidial pyruvate dehydrogenase complex from developing castor oil seeds［J］．Plant Physiology，2008，146（3）：1 346－1 357．

［2］ IZUI K，MATSUMURA H，F(xiàn)URUMOTO T，KAI Y．Phosphoenolpyruvate carboxylase：a new era of structural biology［J］．Annual Review of Plant Biology，2004，55：69－84．

［3］ NIMMO H．Control of the phosphorylation of phosphoenolpyruvate carboxylase in higher plants［J］．Archives of Biochemistry and Biophysics，2003，414（2）：189－196．

［4］ MASUMOTO C，MIYAZAWA S，OHKAWA H，et al．Phosphoenolpyruvate carboxylase intrinsically located in the chloroplast of rice plays a crucial role in ammonium assimilation［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（11）：5 226－5 231．

［5］ SINGH J，REDDY G M，AGARWAL A，et al．Molecular and structural analysis of C4－specific PEPC isoform from Pennisetum glaucum plays a role in stress adaptation［J］．Gene，2012，500（2）：224－231．

［6］ TING I P，BURK J H．Aspects of carbon metabolism in Welwitschia［J］．Plant Science Letters，1983，32（3）：279－285．

［7］ GENNIDAKIS S，RAO S，GREENHAM K，et al．Bacterial－and plant－type phosphoenolpyruvate carboxylase polypeptides interact in the hetero－oligomeric Class－2PEPC complex of developing castor oil seeds［J］．The Plant Journal，2007，52（5）：839－849．

［8］ CHOLLET R，VIDAL J，O＇LEARY M H．Phosphoenolpyruvate carboxylase：a ubiquitous highly regulated enzyme in plants［J］．Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1996，47：273－298．

［9］ O＇LEARY B，PARK J，PLAXTON W C．The remarkable diversity of plant phosphoenolpyruvate carboxylase（PEPC）：recent insights into the physiological functions and post－translational controls of non－photosynthetic PEPCs［J］．Biochemical Journal，2011，436（1）：15－34．

［10］ VIDAL J，CHOLLET R．Regulatory phosphorylation of C4PEP carboxylase［J］．Trends Plant Science，1997，2（6）：230－237．

［11］ SANCHEZ R，F(xiàn)LORES A，CEJUDO F J．Arabidopsis phosphoenolpyruvate carboxylase genes encode immunologically unrelated polypeptides and are differentially expressed in response to drought and salt stress［J］．Planta，2006，223（5）：901－909．

［12］ CARMO－SILVA A E，BERNARDES DA SILVA A，KEYS A J，et al．The activities of PEP carboxylase and the C4acid decarboxylases are little changed by drought stress in three C4grasses of different subtypes［J］．Photosynthesis Research，2008，97（3）：223－233．

［13］ GONZALEZ M C，SANCHEZ R，CEJUDO F J．Abiotic stresses affecting water balance induce phosphoenolpyruvate carboxylase expression in roots of wheat seedlings［J］．Planta，2003，216（6）：985－992．

［14］ DIZENGREMEL P，LE THIEC D，HASENFRATZ－SAUDER M P，et al．Metabolic－dependent changes in plant cell redox power after ozone exposure［J］．Plant Biology，2009，11（1）：35－42．

［15］ WANG Y M，XU W G，HU L，et al．Expression of maize gene encoding C4－Pyruvate Orthophosphate Dikinase（PPDK）and C4－Phos－phoenolpyruvate CarboxylasePEPCin transgenic ArabidopsisJ．Plant Molecular Biology Reporter2012301 367－1 374．

［16］ BANDYOPADHYAY A，DATTA K，ZHANG J，et al．Enhanced photosynthesis rate in genetically engineered indica rice expressing pepc gene cloned from maize［J］．Plant Science．2007，172（6）：1 204－1 209．

［17］ DING Z S，ZHOU B Y，SUN X F，et al．High light tolerance is enhanced by overexpressed PEPC in rice under drought stress［J］．Acta Agronomica Sinica，2012，38（2）：285－292．

［18］ MüLLER K，DOUBNEROVàV，SYNKOVàH，et al．Regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase in PVY（NTN）－infected tobacco plants［J］．Biological Chemistry，2009，390（3）：245－251．

［19］ VOZNESENSKAYA E V，F(xiàn)RANCESCHI V R，KIIRATS O，et al．Kranz anatomy is not essential for terrestrial C4plant photosynthesis［J］．Nature，2001，414：543－546．

［20］ EDWARDS G E，F(xiàn)RANCESCHI V R，VOZNESENSKAYA E V．Single－cell C4photosynthesis versus the dual－cell（Kranz）paradigm［J］．Annual Review of Plant Biology，2004，55：173－196．

［21］ LARA M V，CHUONG S D，AKHANI H，et al．Species having C4single－cell－type photosynthesis in the chenopodiaceae family evolved a photosynthetic phosphoenolpyruvate carboxylase like that of kranz－type C4species［J］．Plant Physiology，2006，142（2）：673－684．

［22］ ROSNOW J J，EDWARDS G E，ROALSON EH．Positive selection of Kranz and non－Kranz C4phosphoenolpyruvate carboxylase amino acids in Suaedoideae（Chenopodiaceae）［J］．Journal of Experimental Botany，2014，65（13）：3595－3607．

［23］ THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNI F，et al．The Clustal X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］．Nucleic Acids Research，1997，24（4）：876－488．

［24］ DENG X，CAI J，LI Y，et al．Expression and knockdown of the PEPC1gene affect carbon flux in the biosynthesis of triacylglycerols by the green algaChlamydomonas reinhardtii［J］．Biotechnology Letters，2014，36（11）：2 199－2 208．

［25］ NARAYAN O P，KUMARI N，RAI L C．Heterologous expression of Anabaena PCC 7120 all 3940（a Dps family gene）protects Escherichia coli from nutrient limitation and abiotic stresses［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，394（1）：163－169．

［26］ RUIZ－BALLESTA I，F(xiàn)ERIA A B，NI H，et al．In vivo monoubiquitination of anaplerotic phosphoenolpyruvate carboxylase occurs at Lys624in germinating sorghum seeds［J］．Journal of Experimental Botany，2014，65（2）：443－451．

［27］ LEPINIEC L，VIDALA J，CHOLLETB R，et al．Phosphoenolpyruvate carboxylase：structure，regulation and evolution［J］．Plant Science，1994，99（2）：111－124．

［28］ DONG L，PATIL S，CONDON S A，et al．The conserved C－terminal tetrapeptide of sorghum C4phosphoenolpyruvate carboxylase is indispensable for maximal catalytic activity，but not for homotetramer formation［J］．Archives of Biochemistry and Biophysics，1999，371（1）：124－128．

［29］ MATSUMURA H，XIE Y，SHIRAKATA S，et al．Crystal structures of C4form maize and quaternary complex of E．coli phosphoenolpyruvate carboxylases［J］．Structure，2002，10（12）：1 721－1 730．

［30］ ZHANG G F（張桂芳），ZHAO M（趙 明），DING Z S（丁在松），et al．Cloning and characterization of phosphoenolpyruvate carboxylase gene fromEchinochloa crusgalli［J］．Acta Agronomica Sinica（作物學報），2005，31（10）：1 365－1 369（in Chinese）．

［31］ CHEN M N（陳明娜），YANG Q L（楊慶利），YU SH L（禹山林），et al．Cloning and analysis of phosphoenolpyruvate carboxylase gene fromSuaeda glauca［J］．Marine Sciences（海洋科學），2009，33（6）：67－72（in Chinese）．

［32］ 王鏡巖．生物化學［M］．北京：高等教育出版杜，2002：384－385．

［33］ PARK S，PACK S P，LEE J．Expression of codon－optimized phosphoenolpyruvate carboxylase gene from Glaciecola sp．HTCC2999in Escherichia coli and its application for C4chemical production［J］．Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，167（7）：1 845－1 853．

［34］ DU X H（杜西河），XU W G（許為鋼），HU L（胡 琳），et al．Response of maize C4－type PEPCand PPDKtransgenic Arabidopsis plants to drought－stress［J］．Molecular Plant Breeding（分子植物育種），2013，11（4）：477－484（in Chinese）．

［35］ ZHOU B Y，DING Z S，ZHAO M．Alleviation of drought stress inhibition on photosynthesis by overexpression of pepc gene in rice［J］．Acta Agronomica Sinica，2011，37（1）：112－118．

［36］ BEGUMA H H，OSAKIA M，WATANABEA T，et al．Mechanisms of aluminum tolerance in phosphoenolpyruvate carboxylase transgenic rice［J］．Journal of Plant Nutrition，2009，3（1）：84－96．

［37］ PLAXTON W C，PODESTA F E．The functional organization and control of plant respiration［J］．PlantS ciences，2006，25（2）：159－198．

［38］ MILLARD C S，CHAO Y P，LIAO J C，eta l．Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli［J］．Applied and Environmental Microbiology，1996，62（5）：1 808－1 810．

［39］ RZEPKA A，RUT G，KRUPA J．Effect of abiotic stress factors on fluctuations in contents of malate and citrate and on malic enzyme activity in moss gametophores［J］．Photosynthetica，2009，47（1）：141－145．

［40］ BROADBENT J R，LARSEN R L，DEIBEL V，et al．Physiological and transcriptional response of Lactobacillus casei ATCC 334to acid stress［J］．Journal of Bacteriology，2010，192（9）：2 445－2 458．