楊桂燕，賈彩霞，孫宇棟，李 鳴，翟梅枝

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院 核桃研究中心，陜西楊陵712100）

熱激蛋白（HSP）是一類受溫度刺激誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)。自1962年在黑腹果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HSP蛋白以來［1］，在其他各類生物群包括植物也相繼發(fā)現(xiàn)了HSP的存在［2］。例如，紅藻（Cyanidioschyzon merolae）的2個(gè)HSP 蛋白能同時(shí)迅速響應(yīng)熱脅迫，且與對(duì)照比較其表達(dá)大于1 000 倍［3］。搖蚊（Chi－ronomusriparius）HSP27基因在35 ℃能被明顯誘導(dǎo)，但在低溫脅迫下其表達(dá)不明顯，4 ℃時(shí)該基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，但進(jìn)入正常生長(zhǎng)溫度時(shí)，其轉(zhuǎn)錄水平能迅速恢復(fù)并顯著過表達(dá)，表明該基因?qū)Νh(huán)境刺激因素具有敏銳性［4］。在2 ℃脅迫下，胡蘿卜（Daucus carota）DcHSP17．7 在 營(yíng) 養(yǎng) 組 織 中 被 誘導(dǎo)，且該基因作為分子伴侶阻止低溫脅迫導(dǎo)致的蛋白降解，進(jìn)而有利于植株的抗寒［5］。

根據(jù)分子量大小可以將植物HSP 分為小HSPs（sHSPs）、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100等5類［6］。其中sHSPs是分子量分布在15kD～42 kD 的一類HSP 蛋白［7］，包含具有進(jìn)化分歧的N－端、后接一個(gè)保守的約由90個(gè)氨基酸殘基組成的ɑcrystallin結(jié)構(gòu)域（ACD）以及一個(gè)較短的C－端［8－9］。sHSPs的主要功能涉及植株的生長(zhǎng)、防御、非生物脅迫響應(yīng)等多個(gè)方面［10］。例如，從麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）發(fā) 育 種 子 中 克 隆 獲 得 的JcHSP－1 和JcHSP－2基因，在植物細(xì)胞保護(hù)和種子成熟發(fā)育中起重要作用［11］；過表達(dá)擬南芥HSP23基因能增強(qiáng)植株的耐鹽能力［12］；檉柳sHSP 基因能響應(yīng)NaCl、高溫、低溫等不同脅迫誘導(dǎo)［13］，且ThHSP18．3 能改善轉(zhuǎn)基因酵母的多重抗逆能力［14］。

核桃（Juglans regia）屬多年生落葉果木，是中國(guó)經(jīng)濟(jì)林中分布廣泛的樹種之一，資源豐富。由于全球氣候變化，核桃的生長(zhǎng)發(fā)育、結(jié)實(shí)坐果等多方面也受到不同程度的影響。特別是中國(guó)西北部，頻繁的倒春寒現(xiàn)象嚴(yán)重制約了核桃的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。因此研究核桃的溫度脅迫響應(yīng)功能及機(jī)理將為預(yù)防或調(diào)節(jié)核桃遭受倒春寒、冷凍害等脅迫提供一定的理論依據(jù)。本研究從核桃中克隆獲得JrsHSP17．3基因，分析了核桃JrsHSP17．3基因在不同溫度脅迫下的組織表達(dá)模式，以及它對(duì)高溫和低溫脅迫的響應(yīng)特征，為研究核桃抗寒耐高溫相關(guān)基因的功能及抗逆機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 植物材料處理

核桃品種‘香玲’種子采自西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃研究中心核桃采穗圃。將種子播種于泥炭土∶珍珠巖＝2∶1（V／V）的混合土壤中，培養(yǎng)條件為溫度（22±2）℃，光照14h／黑暗10h，相對(duì)濕度70%～75%。于溫室大棚中培育2個(gè)月，使用光照培養(yǎng)箱進(jìn)行溫度處理。溫度處理分別設(shè)36、40、44、48、52℃等高溫，16、12、10、8和6 ℃等低溫，處理時(shí)間分別為1 和2h。正常生長(zhǎng)條件下的植株未進(jìn)行處理（0h）設(shè)為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1．2 方法

1．2．1 JrsHSP17．3 基 因 克 隆 與 序 列 分 析 以“heat shock protein”為關(guān)鍵詞在‘香玲’核桃葉片轉(zhuǎn)錄組中查找相關(guān)基因，結(jié)果共獲得10 余條sHSP基因。經(jīng)Blast比對(duì)，根據(jù)注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 條為sHSP17．3 基因，命名為JrsHSP17．3。用ORF finder確定JrsHSP17．3基因開放讀碼框（ORF），再根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)引物JrsHSP17．3－YZ－F（5′－ATGGATCTCAGAATCATGGGT－3′）和JrsHSP17．3－YZ－R（5′－TTATGCAATCTTAACCTCAATT－3′），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后，與pMD－18－T 載體16 ℃下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，并在氨芐青霉素存在下篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR 確認(rèn)，對(duì)能夠產(chǎn)生目的片段的克隆進(jìn)行測(cè)序。利用Expasy ProtParam（http：／／web．expasy．org／protparam／）對(duì) 確 認(rèn) 的JrsHSP17．3 基 因 進(jìn) 行 分析；利 用BLASTP（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast）進(jìn)行序列同源搜索；利用Clustal 3．0 和MEGA 軟件對(duì)不同物種的sHSP17蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析。

1．2．2 JrsHSP17．3 基 因 組 織 表 達(dá) 分 析 使 用CTAB法［15］提取各樣品總RNA，經(jīng)DNA 酶消化后用PrimeScriptTMRT reagent Kit（CWBIO，北京，中國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將獲得的cDNA 稀釋10 倍后作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT－PCR）模板。qRT－PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）進(jìn) 行，qRT－PCR 引 物 為JrsHSP17．3－F（5′－ATGGATCTCAGAATCATG－3′）和JrsHSP17．3－R（5′－CTACCTGGACCTTGATGTC－3′）。選 取 核桃18SrRNA（HE574850）基因［16］作為內(nèi)參基因，內(nèi)參 基 因 引 物 為18S－rRNA－F（5′－GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT－3′）和18S－rRNA－R（5′－TCGCATTTCGCTACGTTCTT－3′）。反 應(yīng) 程 序 為：94℃預(yù)變性30s；94 ℃變性12s，60 ℃退火45s，72℃延伸45s，45個(gè)循環(huán)；81 ℃讀板1s，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2－△△Ct法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析［17］。

2 結(jié)果與分析

2．1 JrsHSP17．3 基因全長(zhǎng)cDNA 的獲得及序列分析

通過分析核桃轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)其中存在10 余條sHSP 蛋 白，經(jīng)Blast 分 析 發(fā) 現(xiàn) 其 中1 條 為sHSP17．3（命名為JrsHSP17．3），根據(jù)序列設(shè)計(jì)起始和末端引物（JrsHSP17．3－YZ－F／R）進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，確認(rèn)其ORF長(zhǎng)474bp，編碼的蛋白含157個(gè)氨基酸，分子量為17．64kD，理論等電點(diǎn)為5．35（圖1）。Blast分析發(fā)現(xiàn)該基因具有ɑ－crystallin（ACD）保守域，表明該蛋白為sHSP蛋白。

利用Blastp搜索同源蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)來自不同植物的sHSP17 蛋白相似性較高，大于70%，JrsHSP17．3 與 葡 萄VvsHSP17．3 和 毛 果 楊PtsHSP17．7同源關(guān)系較近（圖2）。

2．2 高溫脅迫下JrsHSP17．3的表達(dá)

圖1 核桃JrsHSP17．3基因ORF全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸Fig．1 The full length of JrsHSP17．3ORF and deduced amino acid sequence

提取不同高溫處理下核桃根、莖、葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行qRT－PCR 分析。結(jié)果顯示，高溫脅迫下JrsHSP17．3 基因在根、莖、葉中均有不同程度表達(dá)，且主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)（圖3）。在4 4℃環(huán)境脅迫1h，JrsHSP17．3在根中的表達(dá)量最大，為對(duì)照的107．63 倍；在36 ℃時(shí)的表達(dá)被抑制，為對(duì)照的11．03%，52 ℃時(shí)為對(duì)照的4．50 倍。JrsHSP17．3基因在莖中的變化趨勢(shì)與根中相似，36℃時(shí)被抑制表達(dá)，表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的34．87%，44℃時(shí)最高，為對(duì)照的54．95倍；葉中的表達(dá)趨勢(shì)與根莖中的表達(dá)差異較大，36 ℃為上調(diào)表達(dá)，而40 ℃時(shí)被抑制，為對(duì)照的30．99%，48 ℃時(shí)被誘導(dǎo)最明顯，為對(duì)照的77．71倍（圖3，A）。

圖2 核桃JrsHSP17．3蛋白的進(jìn)化樹分析進(jìn)化樹中蛋白名稱后括號(hào)內(nèi)為蛋白GenBank登錄號(hào)；分支上數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣符合聚類的百分?jǐn)?shù)。PtsHSP17．7．毛果楊；VvsHSP17．3．葡萄；CpsHSP17．7．番木瓜；MdsHSP17．3．蘋果；JcsHSP17．5．麻風(fēng)樹；RcsHSP17．5．薔薇雜交品種；TcsHSP17．6．可可；VfsHSP17．9．蠶豆；MssHSP17．6．苜蓿；SlsHSP17．6．番茄；NtsHSP17．3．煙草Fig．2 The phyogenetic tree analysis of JrsHSP17．3protein The symbol behind the protein in the brackets were GeneBank numbers．The numbers on the branches mean the percentages of times the species are grouped together in the bootstrap analysis for 1 000replicates．PtsHSP17．7．Populus trichocarpa；VvsHSP17．3．Vitis vinifera；CpsHSP17．7．Carica papaya；MdsHSP17．3．Malus domestica；JcsHSP17．5．Jatropha curcas；RcsHSP17．5．Rosa hybrid cultivar；TcsHSP17．6．Theobroma cacao；VfsHSP17．9．Vicia faba；MssHSP17．6．Medicago sativa；SlsHSP17．6．Solanum lycopersicum；NtsHSP17．3．Nicotiana tomentosiformis

圖3 高溫脅迫1h（A）和2h（B）核桃JrsHSP17．3基因的表達(dá)Fig．3 Expression of JrHSP17．3exposed to high temperatures for 1h（A）and 2h（B）

圖4 低溫脅迫1h（A）和2h（B）核桃JrsHSP17．3基因的表達(dá)Fig．4 Expression of JrHSP17．3exposed to low temperatures for 1h（A）and 2h（B）

2h脅迫下，根的變化略區(qū)別于莖和葉，根中JrsHSP17．3的轉(zhuǎn)錄水平在48 ℃時(shí)達(dá)最大值，為對(duì)照的25．46倍；52 ℃略低，為對(duì)照的13．45倍。莖和葉中的表達(dá)均在52 ℃最大，分別為對(duì)照的41．07和104．69倍（圖3，B）。

2．3 低溫脅迫下JrsHSP17．3的表達(dá)

低溫脅迫后，JrsHSP17．3 基因在不同組織和不同時(shí)間表現(xiàn)出差異，但主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。脅迫1h，根在10 ℃被抑制，為對(duì)照的33．68%，其他低溫處理下被上調(diào)為對(duì)照的6．28～79．89倍；莖中均為誘導(dǎo)表達(dá)，12℃最高，為對(duì)照的142．02倍，6℃也被誘導(dǎo)較高水平，為對(duì)照63．12倍，10 ℃最低，為對(duì)照的2．39倍；葉中也均為上調(diào)表達(dá)，在12 ℃最高，為對(duì)照的93．70倍，6 ℃最低，僅為對(duì)照的1．67倍（圖4，A）。脅迫2h，根中的表達(dá)均為上調(diào)表達(dá)，相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)，被上調(diào)了2．97～55．33倍；莖中的表達(dá)量相對(duì)小，如在10 ℃脅迫下最高，表達(dá)為對(duì)照的25．46倍，在16 ℃被抑制；葉中的表達(dá)比根和莖都不明顯，在8 ℃、6 ℃為抑制表達(dá)，12 ℃最高，也只有對(duì)照的13．45倍（圖4，B）。

3 討 論

通過分析‘香玲’核桃轉(zhuǎn)錄組和PCR 驗(yàn)證獲得

JrsHSP17．3基因，它含有sHSP蛋白ACD保守域，屬于sHSPs成員；BlastP分析發(fā)現(xiàn)JrsHSP17．3屬于sHSP17．3類蛋白，在進(jìn)化關(guān)系上與毛果楊PtsHSP17．7蛋白、葡萄VvsHSP17．3蛋白、蘋果MdsHSP17．3蛋白、木瓜CpsHSP17．7蛋白較近，而與蠶豆VfsHSP17．9蛋白、薔薇雜交品種RcsHSP17．5 蛋白、煙草NtsHSP17．3蛋白、番茄SlsHSP17．6蛋白較遠(yuǎn)，表明JrsHSP17．3蛋白在功能特性上可能與毛果楊、葡萄、蘋果、木瓜等的sHSP17蛋白相似。

有研究表明sHSPs蛋白是植株響應(yīng)溫度變化、進(jìn)行溫度脅迫保護(hù)調(diào)節(jié)的重要分子伴侶，也是調(diào)控其他非生物脅迫響應(yīng)的重要因子［12，18］。對(duì)擬南芥、水稻等模式植物中有關(guān)HSP 基因的研究較多［19］，木本植物中的研究相對(duì)較少。Yang等［13］研究檉柳（Tamarix hispida）9個(gè)sHSP 基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，這些sHSP 基因在溫度脅迫下主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其為檉柳響應(yīng)溫度脅迫調(diào)控的重要因子。核桃是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，分布廣泛，深受廣大人們喜愛，保證核桃的經(jīng)濟(jì)效益尤為重要。目前，隨著全球氣候變化，核桃的生產(chǎn)受到一定的限制，核桃的抗逆機(jī)制特別是抗寒耐高溫調(diào)控機(jī)理相關(guān)研究亟待進(jìn)行。

本研究對(duì)核桃JrsHSP17．3 基因在不同溫度脅迫不同時(shí)間時(shí)不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同溫度相同時(shí)間處理下，根、莖、葉中的表達(dá)差異較大。如36 ℃脅迫1h根中的表達(dá)分別為莖和葉的31．64%和6．56%；8 ℃脅迫1h，莖中的表達(dá)分別為根和葉的3．20倍和7．26倍。相同組織不同溫度處理相同時(shí)間下的表達(dá)也具有差異，如，根在36 ℃～52 ℃處理2h 時(shí)其表達(dá)值為對(duì)照的0．35～25．46倍，6 ℃～16 ℃脅迫2h時(shí)為對(duì)照的2．97～55．33倍。同一組織在同一溫度脅迫不同時(shí)間下的表達(dá)也有較大差異，如44 ℃脅迫1h根中的表達(dá)是2h時(shí)的11．18倍，4 ℃脅迫1h葉中的表達(dá)是2h的18．90倍。表明JrsHSP17．3基因響應(yīng)溫度脅迫具有組織表達(dá)特異性和時(shí)序表達(dá)特異性，體現(xiàn)了sHSP 的表達(dá)與脅迫溫度和時(shí)間的關(guān)系，與C．Howarth等［20］的結(jié)論一致。不同植物HSP蛋白的表達(dá)具有差異，如檉柳在4 ℃脅迫2h 時(shí)9 個(gè)sHSP 基因的表 達(dá) 差 異 較 大［13］，JrsHSP17．3基 因在脅迫1h后表現(xiàn)為明顯的上調(diào)表達(dá)，而有些植物的sHSP 基因則在脅迫15 min 后即可被顯著誘導(dǎo) 。表明來自不同植物的同一家族基因的表達(dá)，受相同溫度誘導(dǎo)的響應(yīng)時(shí)間具有差異性，由此可推知，相同基因在不同植物中，對(duì)相同脅迫的調(diào)控方式及調(diào)節(jié)能力可能有一定的差異性。本研究較系統(tǒng)地分析了核桃JrsHSP17．3 基因在不同溫度不同時(shí)間脅迫下的表達(dá)水平，表明JrsHSP17．3基因與溫度脅迫調(diào)控具有一定的關(guān)系，為繼續(xù)研究sHSP 逆境應(yīng)答功能、核桃抗逆機(jī)理打下了基礎(chǔ)。

［1］ EHRNSPERGER M，GRABER S，GAESTEL M，et al．Binding of non－native protein to HSP25during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation［J］．Embo Journal，1997，16（2）：221－229．

［2］ VIERLING E．The roles of heat shock proteins in plants［J］．Annual Review of Plant Biology，1991，42（1）：579－620．

［3］ KOBAYASHI Y，HARADA N，NISHIMURA Y，et al．Algae sense exact temperatures：small heat shock proteins are expressed at the survival threshold temperature in Cyanidioschyzon merolae and Chlamydomonas reinhardtii［J］．Genome Biology and Evolution，2014，6（10）：2 731－2 740．

［4］ MART NEZ－PAZ P，MORALES M，MART N R，et al．Characterization of the small heat shock protein HSP27gene in Chironomus riparius（Diptera）and its expression profile in response to temperature changes and xenobiotic exposures［J］．Cell Stress and Chaperones，2014，19（4）：529－540．

［5］ SONG N H，AHN Y J．DcHsp17．7，a small heat shock protein from carrot，is upregulated under cold stress and enhances cold tolerance by functioning as a molecular chaperone［J］．Hortscience，2010，45（3）：469－474．

［6］ HU X L，LI Y H，LI C H，et al．Characterization of small heat shock proteins associated with maize tolerance to combined drought and heat stress［J］．Journal of Plant Growth Regulation，2010，29（4）：455－464．

［7］ LEE G J，ROSEMAN A M，SAIBIL H R，et al．A small heat shock protein stably binds heat－denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding－competent state［J］．The Embo Journal，1997，16（3）：659－671．

［8］ DE J，CASPERS G J，LEUNISSEN A M，et al．Genealogy of theα－crystallin－small heat－shock protein superfamily［J］．International Journal of Biological Macromolecules，1998，22（3－4）：151－162．

［9］ DE J，LEUNISSEN J，VOORTER C，et al．Evolution of the alpha－crystallin／small heat－shock protein family［J］．Molecular Biology and Evolution，1993，10（1）：103－126．

［10］ SUN W，VAN M，VERBRUGGEN N．Small heat shock proteins and stress tolerance in plants［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2002，1 577（1）：1－9．

［11］ OMAR S A，F(xiàn)U Q T，CHEN M S，et al，Identification and expression analysis of two small heat shock protein cDNAs from developing seeds of biodiesel feedstock plant Jatropha curcas［J］．Plant Science，2011，181（6）：632－637．

［12］ LEE K W，CHA J Y，KIM K H，et al．Overexpression of alfalfa mitochondrial HSP23in prokaryotic and eukaryotic model systems confers enhanced tolerance to salinity and arsenic stress［J］．Biotechnology Letters，2012，34（1）：167－174．

［13］ YANG G，WANG Y，ZHANG K，et al．Expression analysis of nine small heat shock protein genes fromTamarix hispidain response to different abiotic stresses and abscisic acid treatment［J］．Molecular Biology Reports，2014，41：1 279－1 289．

［14］ GAO C，JIANG B，WANG Y，et al．Overexpression of a heat shock protein（ThHSP18．3）fromTamarix hispidaconfers stress tolerance to yeast［J］．Molecular Biology Reports，2012，39（4）：4 889－4 897．

［15］ YUCHENG W，CHUANPING Y，JING J．The main points and principles of isolating total RNA from ligneous plant tissues［J］．Journal of Northeast Forestry University，2002，30（2）：1－4．

［16］ XU F，DENG G．，CHENG S Y，et al．Molecular cloning，characterization and expression of the phenylalanine ammonia－lyase gene from Juglans regia［J］．Molecules（Basel，Switzerland），2012，17（7）：7 810－7 823．

［17］ YANG G，WANG Y，XIA D，et al．Overexpression of a GSTgene（ThGSTZ1）fromTamarix hispidaimproves drought and salinity tolerance by enhancing the ability to scavenge reactive oxygen species［J］．Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，117（1）：99－112．

［18］ SCHMIDT R，SCHIPPERS J H M，WELKER A，et al．Transcription factor OsHsfC1bregulates salt tolerance and development in Oryza sativassp．japonica［J］．Aob Plants，2012：pls011．

［19］ CHO E，HONG C．Over－expression of tobacco NtHSP70－1contributes to drought－stress tolerance in plants［J］．Plant Cell Reports，2006，25（4）：349－358．

［20］ HOWARTH C．Molecular responses of plants to an increased incidence of heat shock［J］．Plant，Cell ＆Environment，1991，14（8）：831－841．

［21］ ZOU J，LIU A，CHEN X，et al．Expression analysis of nine rice heat shock protein genes under abiotic stresses and ABA treatment［J］．Journal of Plant Physiology，2009，166（8）：851－861．