李健平，王 卓，徐碧玉，金志強，3＊

（1 海南大學，海口571101；2 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海口571101；3 中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚?，?？?70102）

香蕉在很多發(fā)展中國家中是主食，同時也是重要的經濟來源。在許多農業(yè)發(fā)達的拉丁美洲、非洲和亞洲的國家，香蕉是一種重要出口產品。在世界貿易中，香蕉在重要農作物中排第五位［1］。但全球l－u香蕉產量卻受到病害制約，其中嚴重的就有香蕉枯萎病，它是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporumf．sp．cubense，F(xiàn)oc）引起的［2］。

當植物遭受病原菌侵染時，會激活很多基因，其中就包括病程相關（pathogenesis－related，PR）基因。PR 基因編碼蛋白根據氨基酸序列的相似度，血清學交叉關系和生物學功能分為17個家族［3，4］。其中PR5蛋白，又稱類甜蛋白（TLPs），包含一段類似甜蛋白的保守結構域。TLPs具有抵抗病原菌的作用，通過使真菌細胞膜透化，進行一系列酶反應破壞病原菌細胞壁來達到抵抗病原菌的效果［5，6］。有許多報道稱TLPs能抵抗生物脅迫。在許多轉基因的農作物中表達的TLPs對不同的真菌都具有抗性［7，8］。智 利 草 莓 中2 個TLP 在 對 抗 葡 萄 孢 菌Botrytis cinerea 的侵染中可能起到了作用，而且它們是組織特異性［9］。棉花GbTLP1 轉到煙草后對黃萎病菌（V．dahliae）和 尖孢鐮刀菌（F．oxysporum）有著顯著的抗性［10］。在引起稻瘟病的水稻中，植物 特 異 的 整 體 抗 性（whole plant－specific resistance，WPSR）對稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）起到了抵抗的作用，TLPs可能參與其中，它可能與WPSR 表達有關［11］。除了抵抗生物脅迫外，TLPs還能抵抗非生物脅迫［12］。

本研究以巴西蕉（Musa acuminata subsp．malaccensis）為材料，通過RACE 技術克隆得到香蕉MaTLP1基因，利用生物信息學的方法分析該基因的序列特征，采用實時熒光定量PCR 技術，研究在香蕉枯萎病脅迫下該基因的表達情況，為今后深入研究香蕉類甜蛋白在香蕉抵抗枯萎病過程中的功能及香蕉抗枯萎病育種的分子機理提供一定的依據。

1 材料和方法

1．1 實驗材料及處理

本研究所用實驗材料為感病品種巴西蕉（Musa acuminata L．AAA group，cv．Cavendish）和抗病品種‘農科1 號’。香蕉枯萎病生理4 號小種（Foc TR4）為本實驗室保存。香蕉小苗在Hoagland 溶液（pH 6．0）中生長，生長條件為溫室中25～32℃，光周期為16h光／8h暗。用Foc TR4孢子懸浮液（1．0×106conidia／mL）侵染五葉一心的感病與抗病香蕉苗2h后，分別移栽在花盆中。選Foc TR4侵染0、2、4和6d的香蕉根作為實驗材料，液氮速凍后于－70 ℃冰箱保存待用。每個點取10株苗的根系凍存。0d選取未受Foc TR4侵染的香蕉苗。

1．2 方 法

1．2．1 香蕉根系總RNA 提取 采用Wan等［13］的方法提取總RNA。再用DNaseⅠ（TaKaRa）處理總RNA，除去RNA 中可能含有的DNA 污染，然后再用PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）以0．8 μg 總RNA 為 模 板，以Oligo（dT）16為引物合成第一鏈cDNA。

1．2．2 3′－RACE 克隆 按照RACE 克隆試劑盒（美國BD 公司）說明書，進行3′－RACE 克隆。利用試劑盒合成3′－Ready cDNA，并根據獲得的已知序列設計2條反向嵌套PCR 引物P1和P2（表1），正向引物UMP為試劑盒所帶，用UMP和P1引物對3′－RACE進行第1輪PCR 反應。取1μL 做模板，用UMP和P2引物進行第2輪PCR 反應。

1．2．3 5′－RACE 克 隆 用 試 劑 盒 合 成5′－Ready cDNA，并根據香蕉根轉錄組獲得的已知序列，設計2條反向嵌套PCR 引物P3和P4（表1）。正向引物UMP 為 試 劑 盒 自 帶，用UMP 和P3 引 物 對5′－RACE進行第1輪PCR 反應。取1μL 做模板，用UMP和P4引物進行第2輪PCR 反應。

1．2．4 全長cDNA擴增 將3′－RACE 和5′－RACE擴增獲得的3′端和5′端cDNA 序列在Vector NTI 8．0上進行拼接，獲得全長cDNA 序列，并根據該序列設計全長克隆的兩端引物P5和P6（表1）擴增全長cDNA。PCR 反應體系包含2μL cDNA，5μL 10×PCR buffer，4μL dNTPs（2．5 mmol／L），4μL MgCl2，0．5μL Taq酶，2μL P5，2μL P6，加水至50 μL。PCR 反應程序為94 ℃預變性10min；94 ℃變性40s，57 ℃退火40s，72 ℃延伸2min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10min。

1．2．5 克隆與測序 PCR 產物用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化和回收目的擴增片段。在T4DNA 連接酶作用下，將回收的DNA 片段插入pMD18－T 載體，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌DH5α，取陽性菌落送上海生工公司測序。

表1 香蕉MaTLP1克隆引物Table 1 Cloning primers of banana gene MaTLP1

1．2．6 基因編碼蛋白的生物信息分析 根據MaTLP1的蛋白序列，利用ExPASy ProParam tool軟件對其進行分析。運用NCBI的Conserved Domain Search Service（CD Search）軟件分析其保守區(qū)域。使用NCBI上的Blastx比對尋找與其相似的序列，構建系統(tǒng)進化樹。

1．2．7 MaTLP1組織特異性分析 采用Wan等［15］的方法分別提取根、球莖、假莖、葉、花和果實的RNA，再用不含RNase的DNaseⅠ（TaKaRa）處理各器官的總RNA，除去RNA 中可能含有的DNA污染，然后再用PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）分別以各個器官0．8μg總RNA 為模板，以Oligo（dT）16為引物合成第一鏈cDNA。以cDNA 為模板，用基因特異引物進行基因特異性PCR。基因特異引物為P9（5′－AGCCGTCGTCCTACTCCCA－3′）和P10（5′－CGAAGATTTCTGGCTTGTGGT－3′），采用Actin1作為內參，特異引物為P11（5′－CGAGGCTCAATCAAAGA－3′）和P12（5′－ACCAGCAAGGTCCAAAC－3′）。

1．2．8 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR使用TaRaKa公司的試劑盒，染料為SYBR Green，在吉泰生物科技公司Mx 3005P 熒光定量PCR 儀上進行。以香蕉Actin 1 片段為內參，以前文方法1．2．1 提取出的cDNA 第一鏈為模板。所用的MaTLP1引物為P9（5′－AGCCGTCGTCCTACTCCCA－3′）和P10（5′－CGAAGATTTCTGGCTTGTGGT－3′），Actin1引物P11（5′－CGAGGCTCAAT－CAAAGA－3′）和P12（5′－ACCAGCAAGGTCCAAAC－3′），熒光定量PCR 反應程序為95℃預變性3 min；95℃變性7s，57℃退火10s，72℃延伸30s，循環(huán)40 次。使用Stratagene Mx3000P machine（La Jolla，CA，USA）進行QPCR 反應，每一個樣品設3個重復。擴增檢測完后得到的數(shù)據使用MxProTM QPCR software（Stratagene）進行分析。

2 結果與分析

2．1 MaTLP1基因全長擴增和序列分析

圖1 MaTLP1全長序列PCR 擴增結果M．DL2000；1．MaTLP1Fig．1 PCR results of full length sequence of MaTLP1

圖2 香蕉MaTLP1基因序列及編碼氨基酸序列Fig．2 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of MaTLP1from banana

圖3 MaTLP1的氨基酸序列與其他TLP氨基酸序列比較黑框內為保守結構域，灰色區(qū)域為部分TLP共有氨基酸殘基，黑色區(qū)域為全部TLP共有氨基酸殘基；FvTLP．野草莓（XP＿004291353．1）；NnTLP．荷花（XP＿010271556．1）；PdTLP．海棗（XP＿008781004．1）；ZmTLP．玉米（AFW86928．1）；SiTLP．粟（XP＿004985028．1）；SbTLP．高粱（XP＿002438563．1）；PvTLP．菜豆（XP＿007160648．1）；OsTLP．水稻（NP＿001049533．1）Fig．3 Amino acid sequence alignment of MaTLP1with TLP homologs in plants Black frame shows conserved domain．Grey area shows shared amino acid residues of partial TLPs．Black area shows shared animo acid residues of all TLPs；FvTLP．Fragaria vesca（XP＿004291353．1）；NnTLP．Nelumbo nucifera（XP＿010271556．1）；PdTLP．Phoenix dactylifera（XP＿008781004．1）；ZmTLP．Zea mays（AFW86928．1）；SiTLP．Setaria italica（XP＿004985028．1）；SbTLP．Sorghum bicolor（XP＿002438563．1）；PvTLP．Phaseolus vulgaris（XP＿007160648．1）；OsTLP．Oryza sativa（NP＿001049533．1）．

圖4 MaTLP1與其他植物TLP的遺傳進化樹節(jié)點上的數(shù)值表示bootstrap重復1 000次的置信度Fig．4 Phylogenetic tree of MaTLP1and other TLPs Values at nodes show the confidence level of bootstrap replication 1 000

以香蕉EST 文庫中獲得的序列設計特異引物（表1）分別進行3′－RACE和5′－RACE，對得到的序列進行拼接，獲得MaTLP1全長序列（圖1）。序列分析表明該基因全長1 019bp（圖2），包含942bp完 整 開 放 閱 讀 框，編 碼3 1 3個 氨 基 酸，分 子 量 是32 073．5Da，理論等電點4．38。用NCBI CD Search工具發(fā)現(xiàn)它的保守區(qū)域包含230個氨基酸殘基，屬于植物和動物同源的抗真菌類甜蛋白亞家族（antifungal thaumatin－like proteins：plant and animal homologs），此保守結構域是該亞家族的特有特征（圖3）。用DNAMAN軟件進行序列比對發(fā)現(xiàn)與其他TLP氨基酸序列相似度僅達56．10%（圖3）。

2．2 MaTLP1氨基酸序列的進化分析

為研究MaTLP1氨基酸序列的進化情況，使用Mega3．1軟 件 的Neighbor－Joining將23 條 不 同 物種的TLP氨基酸序列繪制成遺傳進化樹。結果（圖4）顯示，進化樹大致分為兩個分支，上支是雙子葉植物，下支是單子葉植物。在進化關系上，香蕉MaTLP1與海棗PdTLP 最近，與其他單子葉植物玉米ZmTLP、高粱SbTLP、粟SiTLP 和稻OsTLP親緣關系較近，與雙子葉植物毛果楊PtTLP、葡萄VvTLP、野草莓FvTLP等親緣關系較遠。

2．3 MaTLP1的組織特異性表達

圖5 半定量RT－PCR 檢測MaTLP1在香蕉不同部位中的表達情況1．根；2．球莖；3．假莖；4．葉；5．花；6．果實Fig．5 Semi－quantitative RT－PCR analysis of the expression MaTLP1in banana tissue 1．Root；2．Rhizome；3．Pseudostem；4．Leaf；5．Flower；6．Fruit

圖6 感病品種與抗病品種接種枯萎病菌后MaTLP1的表達情況Fig．6 Expression of MaTLP1in susceptible cultivar and resistant cultivar

為了確定MaTLP1在香蕉中的表達模式，在不同組織中進行了半定量RT－PCR。MaTLP1在根、球莖、假莖、葉、花和果實中均有表達（圖5），但主要集中在根、球莖和假莖中表達，葉中表達略低，花和果實中只有微量表達。

2．4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR 結果表明，MaTLP1 在接種枯萎病菌的巴西蕉（感病品種）中表達趨勢先降低后升高再降低，總體變化不大（圖6）。在‘農科1號’（抗病品種）中表達趨勢先升高后降低，表達量總體增大，在4d達到最大，表達量與對照相比高24倍（圖6）。

3 討 論

TLPs在參與植物抵抗真菌的過程中發(fā)揮著重要 的 作 用［14］。TLP 蛋 白 對 不 同 的 真 菌 具 有 抗性［15－17］。在很多高等植物中，TLP基因在病原菌脅迫下上調表達［18］。中國甘藍中的20個TLP 基因在接種死體營養(yǎng)型細菌后的qRT－PCR 中有2 個TLP基因被抑制了，表明這2個TLP 基因可能參與了抗菌過程［19］。在轉基因水稻中過表達水稻的1個TLP基因表現(xiàn)出對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抗性［20］；轉入了1個TLP 基因的煙草對煙草赤星病菌（Alternaria alternate）表現(xiàn)出抗性［21］。在轉基因擬南芥中過表達PdPR5－1表現(xiàn)出對甘藍鏈格 孢 菌（Alternaria brassicicola）的 抗 性［22］。這些結果都表明TLP 在植物抵抗許多病原菌過程中起到了重要作用。

本實驗克隆得到的MaTLP1含有TLP特有的保守結構域，在系統(tǒng)進化樹上，與其他單子葉植物的TLP蛋白聚為一支，在進化關系上與海棗最近，與雙子葉植物親緣關系較遠，這些結果都與Angelique等研究結果一致［23］，表明克隆獲得的MaTLP1確實是香蕉的TLP 基因。Foc TR4是一種侵染根的病原菌，組織特異性表達結果表明，MaTLP1集中在根莖中表達，可能與香蕉在被侵染部位抵抗病原菌有關。熒光定量分析結果發(fā)現(xiàn)在接種Foc TR4 的抗Foc TR4品種中，MaTLP1表達量明顯增高，最高達對照的25倍，表明MaTLP1在Foc TR4脅迫下激活。而在同樣處理下的感病品種中，接菌2d后它的表達量下調，雖然在接菌4d后的表達量上調，但相比抗病品種上調較小，這說明在感病品種中接Foc TR4后MaTLP1的表達量發(fā)生了變化，但變化幅度相較抗病品種并不明顯。以上結果說明MaTLP1參與香蕉抵抗Foc TR4的過程，但是調控方式和作用機制還不清楚，需要進一步的試驗來探討。

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