曹 慧，王東方，王漢海，鄒巖梅，束懷瑞＊

（1 濰坊學院 山東高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊261061；2 國家蘋果工程技術研究中心，山東泰安271018）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是生物體內通過酶促和非酶促途徑產生的一種生物活性分子［1－2］，廣泛存在于植物組織中［3］。NO 也可作為重要的信號分子，它能使非生物脅迫條件下的植物生長發(fā)育免受活性氧（reactive oxygen species，ROS）的傷害，且其效應與植物細胞的生理條件及NO 處理濃度有關［4－5］。有研究表明，外源NO 通過增強鹽脅迫下小麥［6］、黃瓜［7］、辣椒［8］幼苗，及 高 溫、鎘脅迫下姜［9］、水稻幼苗［10］超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，提高非酶促抗氧化物質谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸（ASA）等的含量，從而緩解由于脅迫導致的葉片ROS的累積。全球每年因干旱導致作物減產約高達20%，如何提高作物的抗旱性是植物抗逆研究的重要課題，因此，研究水分脅迫下NO 與植物抗旱性的關系具有重要意義。平邑甜茶為北方蘋果樹的一種常用實生砧木，具有無融合生殖的特點。關于NO 在植物抗逆過程中的作用，目前研究主要集中在農作物、經(jīng)濟作物等植物上［11－13］，而對木本植物的研究鮮有報道，尤其對蘋果屬植物的研究更為少見。因此，本研究選取蘋果屬植物平邑甜茶幼苗為試材，通過水培方法添加不同濃度的一氧化氮供體硝普納（SNP）探討滲透脅迫下（20%PEG－6000）外源NO對氧化損傷的緩解效應，為進一步了解NO提高植物抗逆性的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料培養(yǎng)與處理

選用蘋果砧木平邑甜茶［Malushupehensis（Pamp．）Rehd．］為試驗材料，試驗于2005年2月～2008年12月在濰坊學院省級重點實驗室進行。平邑甜茶種子經(jīng)4℃層積處理，蛭石培養(yǎng)。待幼苗長出4～5片真葉以后，選取生長良好一致的幼苗轉至1／2Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后轉為全Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，每周定期更換1 次營養(yǎng)液。當幼苗長到15～16片葉時，選擇長勢相對一致的幼苗進行試驗處理。NO 供體硝普鈉（sodium nitrop russide，SNP）購買自Sigma公司，先用蒸餾水配制為100mmol·L－1的母液，4℃保存，使用時按試驗所需濃度進行稀釋。

采用20%PEG－6000處理相當于－0．63 MPa，輕度水分脅迫模擬干旱處理［14－15］。試驗設置6個處理分別為：Hoagland營養(yǎng)液（對照，CK）；Hoagland營養(yǎng)液＋20%PEG－6000溶液（Ⅰ）；Hoagland營養(yǎng)液＋20% PEG－6000 溶液＋100μmol·L－1SNP（Ⅱ）；Hoagland 營養(yǎng)液＋20% PEG－6000 溶液＋300μmol·L－1SNP（Ⅲ）；Hoagland營養(yǎng)液＋20%PEG－6000溶液＋500μmol·L－1SNP（Ⅳ）；Hoagland營養(yǎng)液＋20% PEG－6000 溶液＋700μmol·L－1SNP（Ⅴ）。每處理8株，3次重復，隨機排列，為了保證處理濃度的穩(wěn)定性，處理期間每天更換1次處理液。于脅迫處理0、3、6、9、12d分別選取中部9～12葉位成熟葉片進行各項生理指標測定，3 次重復。

1．2 測定指標及方法

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性的測定參照陳貽竹等［16］的方法；過氧化氫酶（CAT）活性的測定參照Cakmak等［17］的方法；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定參照Nakano等［18］的方法；抗壞血酸（ASA）含量參照Arakawa等［19］方法測定；產生速率參照王愛國等［20］的方法測定；H2O2含量參照劉俊等［21］的方法測定；丙二醛（MDA）含量參照李合生［22］的方法進行測定。

1．3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2．1 外源NO 處理對水分脅迫下平邑甜茶幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

由圖1還可知，CAT 活性變化趨勢與POD 相一致。經(jīng)20%PEG 脅迫和不同濃度NO 處理，在處理0～3dPOD、CAT 活性變化幅度較為平緩，與對照之間差異未達到顯著水平。但處理3d后處理Ⅱ和ⅣPOD、CAT 活性分別在處理后第6天和第9天均升至最高值，分別比對照提高了11．6%、15．4%和3．8%、20．1%，之后呈下降趨勢；處理Ⅲ和處理Ⅴ在整個處理期內分別一直呈上升和下降趨勢，到第12天與對照之間的差異均達顯著水平。

以上結果說明不同濃度NO 處理可不同程度提高SOD、POD 和CAT 酶活性，起到酶促防御保護作用，防止水分脅迫對平邑甜茶所造成的傷害，其防御作用為：處理Ⅲ＞處理Ⅳ＞處理Ⅱ＞處理Ⅴ。

2．2 外源NO 處理對水分脅迫下平邑甜茶幼苗APX活性和ASA含量的影響

圖1 外源NO 處理對水分脅迫下平邑甜茶幼苗SOD、POD 和CAT 活性的影響Fig．1 Effects of NO concentrations on SOD，POD and CAT activities in M．hupehensis（Pamp．）Rehd．seedlings under water stress

2．3 外源NO 對水分脅迫下平邑甜茶幼苗活性氧和膜脂過氧化的影響

圖2 外源NO 處理對水分脅迫下平邑甜茶幼苗ASA 含量和APX 活性的影響Fig．2 Effects of NO concentrations on ASA content and APX activity in M．hupehensis（Pamp．）Rehd．seedlings under water stress

圖3 外源NO 處理對水分脅迫下平邑甜茶幼苗產生速率、H2O2 和MDA 含量的影響Fig．3 Effects of NO concentrations on production rate of ，H2O2and MDA contents in M．hupehensis（Pamp．）Rehd．seedlings under water stress

3 討 論

正常生長條件下，細胞內活性氧的產生量很?。?40μmol·s－1）［23］，當植物受到脅迫時，體內會產生大量的活性氧，而植物體內也存在活性氧自由基清除系統(tǒng)。SOD 是清除生物體內的唯一酶類，SOD 催化發(fā)生歧化反應生成的H2O2則由POD、CAT、APX 和ASA等來清除，APX 與H2O2的親合力較強，經(jīng)過抗壞血酸循環(huán)分解來完成［9］。本研究表明，在20%PEG 脅迫下，平邑甜茶幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX 活性和ASA 含量在脅迫前期均有不同程度的提高，這些酶活性和ASA 含量的提高可能是20% PEG 脅迫前期一種自身適應，是平邑甜茶對逆境脅迫的應激反應，它們協(xié)同作用抵抗了脅迫前期誘導的氧化損傷。

隨著脅迫時間的延長，至脅迫6d后平邑甜茶幼苗H2O2、和MDA 含量明顯增加，均于脅迫后第9天與對照之間的差異達到顯著水平。NO 是近年來備受關注的信號分子，它在植物信號傳導和抗逆過程中發(fā)揮重要作用，且具有濃度效應，低濃度的NO 可作為抗氧化劑對等ROS具有清除作用，并能誘導抗氧化酶基因的表達而具有保護作用［24］。不同濃度的外源SNP 處理（處理Ⅱ～處理Ⅴ）對20% PEG 脅迫下平邑甜茶葉片氧化損傷有不同的效應，300μmol·L－1SNP（處理Ⅲ）處理顯著提高了SOD、POD、CAT、APX 活性和ASA 含量，明顯降低了產生速率、H2O2和MDA 的含量，與對照之間的差異達到顯著水平，從而避免膜脂過氧化，表明300μmol·L－1SNP 能夠顯著緩解20% PEG 脅迫下膜脂過氧化損傷。外加100 μmol·L－1（處理Ⅱ）、500μmol·L－1（處理Ⅳ）的SNP處理雖然可以在一定程度上緩解干旱脅迫的傷害，但緩解程度與對照之間的差異不顯著，且其緩解效果為處理Ⅲ＞處理Ⅳ＞處理Ⅱ，并隨著處理時間的延長緩解作用越來越明顯。外源NO 能夠緩解氧化脅迫的原因可能是由于NO 作為信號分子對含鐵的相關酶類有很高的親和性，可誘導APX 和POD 等的活性上調或基因表達，也可能直接與反應或通過一系列復雜的信號轉導通路提高SOD編碼基因的表達而降低水平［4］。

高濃度的外源NO 處理（700μmol·L－1SNP）下，平邑甜茶幼苗SOD、POD、CAT、APX 活性和ASA 含量在脅迫9d 后大幅降低，膜脂過氧化加劇，表明700μmol·L－1SNP以上處理加速了滲透脅迫對平邑甜茶幼苗誘導的氧化損傷。這可能由于一方面過高濃度的SNP本身就是一種脅迫，另一方面高濃度 NO 與相互作用生成大量的ONOO－，而ONOO－經(jīng)質子化形成具有強氧化性的HOONO，破壞生物大分子的結構和功能［25］。

綜上所述，適宜濃度的外源NO 能夠通過提高平邑甜茶體內SOD、POD、CAT、APX 活性和ASA含量，有效緩解20% PEG 滲透脅迫對其造成的過氧化傷害，并以300μmol·L－1SNP處理緩解效果最佳，而低于100 μmol·L－1SNP和高于700 μmol·L－1SNP均不利于氧化脅迫的緩解，甚至會造成毒害，這與作者前期的相關研究結果一致［26－27］。

［1］HELGA N，JOSEF M．Indications for the occurrence of nitric oxide synthases in fungi and plants and the involvement in photoconidiation ofNeurosporacrassa［J］．PhotochemistryandPhotobiology，1996，64（2）：393－398．

［2］BETHKE P C，BADGER M R，JONESA R L．Apoplastic synthesis of nitric oxide by plant tissues［J］．ThePlantCell，2004，16（2）：332－341．

［3］CHANDOK M R，YTTERBERG A J，VAN WIJK K J，etal．The pathogen－inducible nitric oxide synthase（iNOS）in plants is a variant of the P protein of the glycine decarboxylase complex［J］．Cell，2003，113（4）：469－482．

［4］BELIGNI M V，LAMATTINA L．Is nitric oxide toxic or protective？［J］．TrendsinPlantScience，1999，4（8）：299－300．

［5］BELIGNI M V，LAMATTINA L．Nitric oxide protects against cellular damage produced by methylviologen herbicides in potato plants［J］．NitricOxide，1999，3（3）：199－208．

［6］RUAN H H（阮海華），SHEN W B（沈文飚），LIU K L（劉開力），etal．Effects of exogenous NO donor on glutathione－dependent antioxidative system in wheat seedling leaf under salt stress［J］．ActaAgronomicaSinica（作物學報），2005，31（9）：1 144－1 149（in Chinese）．

［7］FAN H F（樊懷福），GUO SH R（郭世榮），etal．Effects of nitric oxide on the growth and glutathione dependent anti oxidative system in cucumber（CucumissativusL．）seedlings under NaCl stress［J］．ActaEcologicaSinica（生 態(tài)學報），2008，28（6）：2 511－2 517（in Chinese）．

［8］YU J H（郁繼華），YONG SH Y（雍山玉），ZHANG J B（張潔寶），etal．Protective effects of exogenous nitric oxide on oxidative damage in pepper seedlings under NaCl stress［J］．ActaBot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物學報），2007，27（9）：1 801－1 806（in Chinese）．

［9］LI X（李 秀），GONG B（鞏 彪），XU K（徐 坤）．Effects of exogenous nitric oxide on reactive oxygen metabolism in Giger leavers under heat stress［J］．ActaHorticulturaeSinica（園藝學報），2014，41（2）：277－284（in Chinese）．

［10］趙秀峰．一氧化氮對水稻幼苗鎘毒害的緩解效應及生理機制［D］．南京：南京農業(yè)大學，2012．

［11］WANG J（王 建），YU SH X（于世欣），WANG Y J（王逸筠），etal．Effect of exogenous NO on phytochelatins and arginine metabolism in tomato under copper stress［J］．SoilandWaterConservation（水土保持學報），2014，28（4）：317－323（in Chinese）．

［12］YU X J（魚小軍），XU CH L（徐長林），JING Y Y（景媛媛），etal．Effects of exogenous NO germination and seedling growth ofMedicago ruthinicaseeds under NaCl stress［J］．GrasslandandTurf（草原與草坪），2014，34（2）：68－72（in Chinese）．

［13］LIU SH L（劉柿良），PAN Y ZH（潘遠智），YANG R J（楊容孑），etal．Effects of exogenous NO on mineral nutrition absorption，lipid peroxidation and ATPase of plasma membrane inCatharanthusroseustissues under cadmium stress［J］．JournalofPlantNutritionand Fertilizer（植物營養(yǎng)與肥料學報），2014，20（2）：445－458（in Chinese）．

［14］CHEN X H（陳新紅），WANG ZH Q（王志琴），YANG J CH（楊建昌）．Effect of different nitrogen levels and water stress on qualities of rice seedling［J］．AgriculturalResearchintheAridAreas（干旱地區(qū)農業(yè)研究），2007，25（1）：78－93（in Chinese）．

［15］CAO H（曹 慧），LI CH X（李春霞），WANG X W（王孝威），etal．Research of programmed cell death under water stress inMalusrobustaRehd．andMalushupehensis（Pamp．）Rehd［J］．ActaHorticulturaeSinica（園藝學報），2009，36（4）：469－474（in Chinese）．

［16］CHEN Y ZH（陳貽竹），PATTERSON B D（帕特森）．The effect of chilling temperature on the level of superoxide dismutase，catalase and hydrogen peroxide in some plant leaves［J］．ActaPhytophysiologicaSinica（植物生理學報），1988，14（4）：323－328（in Chinese）．

［17］CAKMAK I，MARSCHNER H．Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase，ascorbate peroxidase，and glutathione reductase in bean leaves［J］．PlantPhysiology，1992，98（4）：1 222－1 227．

［18］NAKANO Y，ASADA K．Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplast［J］．PlantandCell Physiology，1981，22：867－880．

［19］ARAKAWA N，TSUTSUM I，SANCEDA N G，etal．A rapid and sensitive method for the determination of ascorbic acid using 4，7－diphenyl－1，10－phenanthroline［J］．AgriculturalandBiologicalChemistry，1981，45（5）：1 289－1 290．

［20］WANG A G（王愛國），LUO G H（羅廣華）．Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants［J］．PlantPhysiologyCommunications（植物生理學通訊），1990，（6）：55－57（in Chinese）．

［21］LIU J（劉 ?。琇üB（呂 波），XU L L（徐朗萊）．An improved method for the determination of hydrogen peroxide in leaves［J］．ProgressinBiochemistryandBiologicalPhysicsResearch（生物化學與生物物理進展），2000，27（5）：548－550（in Chinese）．

［22］李合生．植物生理生化實驗原理與技術［M］．北京：高等教育出版社，2000．

［23］MITTLER R，VANDERAUWERA S，etal．Reactive oxygen gene net work of plants［J］．TrendsinPlantScience，2004，9（10）：388－395．

［24］FRANK S，KAMPFER H，PODDA M，etal．Identification of copper／zinc superoxide dismutase as a nitric oxide－regulated gene in human（HaCaT）keratinocytes：implications for keratinocyte proliferation［J］．BiochemicalJournal，2000，346（3）：719－728．

［25］YAMASAKI H，SAKIHAMA Y，TAKAHASHI S．An alternative pathway for nitric oxide production in plant：new feather of an old enzyme［J］．TrendsinPlantScience，1999，4（4）：128－129．

［26］CAO H（曹 慧），WANG X W（王孝威），etal．Effects of exogenous nitric oxide on the several enzymes of nitrogen metabolism inMalus hupehensis（Pamp．）Rehd．seedlings under water stress［J］．ActaHorticulturaeSinica（園藝學報），2009，36（6）：781－786（in Chinese）．

［27］CAO H（曹 慧），WANG X W（王孝威），etal．Effects of exogenous nitric oxide on chlorophyll fluorescence parameters and photosynthesis rate inMalushupehensisseedlings under water stress［J］．ActaHorticulturaeSinica（園藝學報），2011，38（4）：613－620（in Chinese）．