孔凡麗，包海鷹

（吉林農業(yè)大學 中藥材學院，長春130118）

巖高蘭（EmpetrumnigrumL.var.japonicumK.Koch）是巖高蘭科巖高蘭屬植物，在中國分布范圍狹窄，僅產(chǎn)于大興安嶺海拔較高的山頂［1－4］。目前有關巖高蘭藥用方面的研究較少。對其化學成分和藥理活性方面，國內僅有李春燕［5］報道了東北巖高蘭對大鼠酒精性脂肪肝的預防有很好的作用。有關巖高蘭揮發(fā)油成分分析的研究尚未見報道。本研究采用光學顯微鏡、掃描電鏡觀察研究巖高蘭莖、葉表面和斷面及分泌組織特征，采用3種不同的方法提取巖高蘭揮發(fā)性成分，通過GC－MS法分析巖高蘭揮發(fā)性成分，為更好開發(fā)利用該資源提供依據(jù)。

1 實驗材料與儀器及試劑

1.1 實驗材料

巖高蘭采自內蒙古大興安嶺，由吉林農業(yè)大學菌物所包海鷹教授及圖力古爾教授鑒定并提供。

1.2 實驗試劑

石油醚（分析純A.R）、蒸餾水。

1.3 實驗儀器

掃描 電 子 顯 微 鏡（SSX－50 型）、光 學 顯 微 鏡（Nikon）、載玻片、蓋玻片、顯微照相機、粉碎機、手術刀、GC－MS聯(lián)用儀、電子天平、循環(huán)水真空泵SHZ－D（Ⅲ）、旋轉蒸發(fā)器RE－52AA、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH－4型）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DGX－9143BC－1型）。

2 實驗方法

2.1 巖高蘭組織結構顯微觀察

取巖高蘭莖和葉，進行徒手切片、粉末制片，選取合適切片在光學顯微鏡下對該植物表面和斷面特征進行觀察描述［6］。掃描電鏡樣品選取莖橫切面、葉上表面和下表面并用雙面膠帶紙粘于樣品臺上，噴金后于SSX－50 掃描電子顯微鏡下觀察，通過WD－5掃描電鏡聯(lián)機圖像分析系統(tǒng)，在100～20 000倍下數(shù)碼拍照，電腦保存。

2.2 巖高蘭揮發(fā)性成分的3種提取方法

2.2.1 水蒸氣蒸餾法（SD）提取巖高蘭揮發(fā)性成分［7－9］巖高蘭粉碎后，過20目篩，精密稱量100g放入1 000mL圓底燒瓶，加入500mL 蒸餾水及沸石蒸餾6h以上，直至揮發(fā)油提取完全，收集精油得淡黃色液體，并用無水硫酸鈉干燥。

2.2.2 溶劑提取法－水蒸氣蒸餾法（SX－SD）提取巖高蘭揮發(fā)性成分 巖高蘭粉碎后，過20目篩，精密稱量200g放入1 500mL圓底燒瓶，加入適量石油醚回流提取8h，提取3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，再加入蒸餾水及數(shù)十粒沸石進行蒸餾，6h后收集精油并用無水硫酸鈉干燥，得淡黃色油狀物。

2.2.3 溶劑提取法（SX）提取巖高蘭揮發(fā)性成分 將巖高蘭粉碎后，過20 目篩，精密稱量50g 放入500mL圓底燒瓶，加入適量石油醚回流提取8h，提取3次，合并提取液，減壓濃縮得黃綠色浸膏。用此方法分別提取巖高蘭莖、葉兩個部位，減壓濃縮后莖呈橘紅色，葉呈黃綠色浸膏［10］。

2.3 GC－MS條件

2.3.1 氣相色譜條件 DB25彈性石英毛細管柱30m×250μm×0.25μm，初始柱溫50℃，在50℃保持3 min，再以10 ℃／min 升溫至280 ℃，并在280 ℃保持10 min，進樣口溫度260 ℃，載氣為氦氣，載氣流量1.0mL／min，分流比40∶1。

2.3.2 質譜條件 EI離子源，電子能量70eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，四級桿150 ℃，掃描質量范圍20～500，電子倍增電壓1 300V。

3 實驗結果

3.1 巖高蘭莖組織顯微結構特征

3.1.1 巖高蘭莖橫切面顯微結構 莖橫切后經(jīng)水合氯醛透化在光鏡下觀察（圖版Ⅰ，1、2）發(fā)現(xiàn)莖切面呈圓形，表皮細胞為矩形呈無色透明狀，細胞排列緊密，無細胞間隙，彼此緊密嵌合。木栓層為2～3列扁平狀細胞，由木栓形成層和栓內層共同組成，木栓層細胞顏色較深，呈黃棕色，韌皮部由4～5列細胞組成。形成層為2～3列扁平狀細胞構成，形成層環(huán)明顯，木質部可見導管，周圍由木纖維連接，木射線呈放射狀分布，較密集，髓部薄壁細胞呈五邊形或方形，中央有油細胞，較明顯，呈淺黃色。

采用掃描電鏡觀察（圖版Ⅰ，3、4）可以清晰的看見木質部的導管和纖維組織，髓部呈類方形，中間含有油細胞，如圖片中顏色深的部位。

3.1.2 莖粉末 黃褐色，氣味略香，木纖維呈束狀，寬3～5μm，長135～282μm，導管直徑5～24μm，長21～36μm；木栓細胞多呈長方形，長24.42～39.07μm，寬12～24μm，髓部油細胞，直徑為9.73～19.47μm（圖版Ⅰ，5～7）。

3.2 巖高蘭葉組織顯微結構特征

3.2.1 巖高蘭葉片的橫切面結構特征 葉片橫切面的光學顯微鏡觀察結果（圖版Ⅰ，8）顯示為扁圓形，有角質層，角質層外長有頭狀腺毛，頭狀腺毛由1個基細胞、1～3個柄細胞、1～4個頭部細胞組成；葉緣有非腺毛，排列緊密并向內彎卷，無頭部和柄部之分，由單細胞構成，最為明顯的是頭狀腺毛含有揮發(fā)油，非腺毛則沒有。有柵欄組織、海綿組織、氣孔，導管為螺紋導管（圖版Ⅰ，9～14），葉脈較粗為中脈。

3.2.2 葉粉末 粉末黃綠色，有香味，在光學顯微鏡觀察顯示表皮細胞為不規(guī)則形狀，氣孔直徑約17 μm，上表皮頭狀腺毛寬9～12μm，長15～24μm，下表皮頭狀腺毛寬10～14μm，長29～71μm，非腺毛寬4～9μm，長48～109μm。

3.2.3 巖高蘭葉片的上表面結構特征 葉上表面特征在掃面電鏡下觀察（圖版Ⅱ，1～3）發(fā)現(xiàn)有較多頭狀腺毛，由于葉片失去較多水分，并在高電壓下，頭狀腺毛的頭部略不完整，葉片干癟，葉緣反卷縫隙處有較多非腺毛（圖版Ⅱ，4、5）。

3.2.4 巖高蘭葉片的下表面結構特征 葉下表面特征在掃面電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)由于葉緣向內反卷，從而形成兩個管腔（圖版Ⅱ，6、7），管腔內有油狀光澤，分布較多頭狀腺毛，葉下表面的分布密度均大于上表面分布密度（圖版Ⅱ，8、9）。

3.3 巖高蘭出油率的比較

3種不同方法提取揮發(fā)油提取率也不同（表1），100g巖高蘭全株經(jīng)水蒸氣蒸餾提取6h，收集揮發(fā)油，油樣呈淡黃色透明液體，平均得率為0.47%。溶劑提取法－水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，得到淡黃色揮發(fā)油，平均得率約0.35%。溶劑提取法提取8h，提取3次，浸膏為黃綠色油狀物，平均得率為10.5%。溶劑提取法提取莖、葉，浸膏呈橘紅色和黃綠色，得率分別為4.78%、6.1%。

3.4 巖高蘭揮發(fā)油的化學成分分析及其比較

按上述GC－MS實驗條件進樣，得到3種不同方法提取巖高蘭揮發(fā)油的總離子流圖（圖1～3），以及不同提取部位揮發(fā)油的總離子流圖（圖4～5），通過工作站對總離子流圖進行處理，計算機標準譜庫（Nist08）質譜數(shù)據(jù)庫檢索，峰面積歸一化法確定了各個組分的百分含量，分別用3種方法分離出46、29、53個化合物，鑒定出41、25、46種。所鑒定化合物相對含量分別占揮發(fā)油總量的97.894%、95.384%、98.555%，各個組分的化學名稱、百分含量見表2。從巖高蘭莖、葉的揮發(fā)油中分離出了31、38個化合物，鑒定出27、32種，所鑒定化合物相對含量分別占揮發(fā)油總量的99.465%、96.543%，結果見表3。

表1 不同提取工藝的揮發(fā)油得率Table1 The yield of the volatile oils extracted by different technologies（V／W，%）

圖1 水蒸汽蒸餾法揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in steam distillation

圖2 石油醚提取法－水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油總離子流圖Fig.2 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in solvent extraction and steam distillation

圖3 石油醚提取法揮發(fā)油總離子流圖Fig.3 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in solvent extraction

圖4 莖揮發(fā)油總離子流圖Fig.4 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in stem

圖5 葉揮發(fā)油總離子流圖Fig.5 GC－MS total chromatogram of the volatile oil in leaf

表2 3種不同方法提取揮發(fā)油的化學組成及相對含量Table2 The chemical composition of the volatile oil content and relative content with 3different extracting methods

續(xù)表2 Continued Table 2

表3 巖高蘭莖、葉揮發(fā)油的化學組成及相對含量Table3 The volatile oil chemical composition and relative content in stems and leaves of E.nigrum

續(xù)表3 Continued Table 3

4 討 論

通過光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察，除被子植物基本特征外，巖高蘭的分泌組織是巖高蘭的主要特征并與揮發(fā)性成分含量有著密切的關系，目前，許多學者采用了不同的方法和技術對植物分泌結構的起源和發(fā)生方式 做 了大量研究［11－14］，如Liang等［15］運用電鏡酶細胞化學技術和方法發(fā)現(xiàn)柑橘屬植物的分泌腔發(fā)生方式為裂溶生式。本研究通過對巖高蘭莖、葉表面、斷面的觀察可知巖高蘭的分泌組織有腺毛和分泌細胞，分泌組織多分布在莖的髓部以及葉上下表面腺毛中，腺毛數(shù)目和葉子的大小呈正相關，即葉片越大，毛的總數(shù)越多，而上下表面毛的密度則有很大差距，下表面明顯多于上表面。分泌組織能分泌出有香氣的芳香油，通過代謝途徑擴散到空氣里，使植株產(chǎn)生香味，通過對莖和葉粉末氣味進行鑒別，葉的氣味與原植物相近，初步推斷香氣是由葉片分泌組織產(chǎn)生，由于光學顯微鏡和掃描電鏡的局限性對巖高蘭分泌組織的超微結構與揮發(fā)油合成和含量變化規(guī)律需要進行進一步的研究。對巖高蘭揮發(fā)性成分進行GC－MS分析并比較，結果表明，從方法上來看，用不同的方法提取巖高蘭揮發(fā)油的效果不一樣，水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法－水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油顏色較淺雜質少，氣味與原植株散發(fā)香氣接近，但得率較小，而溶劑回流提取揮發(fā)油得率較高，所含雜質也較多。從化學成分上看，對3種提取方法的化學成分進行比較，水蒸氣蒸餾法含量超過1.5%共有14 個，相對含量較高的有：水楊酸芐酯（35.491%）、D－杜 松 烯 （7.402%）、芳 樟 醇（4.785%）；溶劑回流－水蒸氣蒸餾法含量超過1.5%的共有25 個，相對含量較高的有：十六烷（7.831%）、γ－畢澄茄烯（7.302%）、α－衣蘭油烯（5.698%）。溶劑提取法含量超過1.5%的共有15個，相對含量較高的有：根皮素（11.852%）、正三十四烷（11.433%）、無羈萜（11.765%）。三者共有化合物有2種，分別是順－α，α－5－三甲基－5－乙烯基四氫化呋喃－2－甲醇、植酮，前者化學性質未曾報道，后者可用作維生素E 醋酸酯的中間體。從不同部位來看，巖高蘭莖、葉揮發(fā)油主要為烷烴類以及少量的酸、酯、醇、醛、萘等化合物。從二者揮發(fā)油中共鑒定出43種化學成分，其中15種成分為兩者共有，除三十四烷、二十九烷等烷烴類所占含量最高，其余大部分成分為具有芳香氣味的香精香料成分，如棕櫚酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、角鯊烯等，但不同部位其共有成分含量有差異。

通過顯微觀察巖高蘭組織特征，GC－MS法分析比較揮發(fā)性成分，分泌組織與巖高蘭香氣物質產(chǎn)生密切相關，其分泌物的組成和含量對香氣有重要影響，正是這些有芳香氣味的化學成分的有機結合以及自身生長的環(huán)境因素才形成了巖高蘭的特征香味，也為資源開發(fā)與研究提供了很多有利途徑。

圖版Ⅰ 巖高蘭莖、葉顯微結構PlateⅠ The stem and leaf microstructure of E.nigrum

圖版Ⅱ 巖高蘭葉顯微結構（電鏡下）PlateⅡ The leaf microstructure of E.nigrum （scanning electron microscope）

［1］ MA J Y（馬俊瑩），ZHANG H（張 華）.Empetrumnigrumvar.japonicum［J］.JournalofPlant（植物雜志），1996，5：2（in Chinese）.

［2］ YIN J（尹 君），CUI K CH（崔克城），LIU J G（劉景貴）.The value ofEmpetrumnigrum［J］.SpecialEconomicAnimalandPlant（特種經(jīng)濟動植物），2002，1：23（in Chinese）.

［3］ CHEN H（陳 輝）.The distribution and protection ofEmpetrumnigrumutilization value［J］.InnerMongoliaForestryInvestigationand Design（內蒙古林業(yè)調查設計），2011，6：119－121（in Chinese）.

［4］ MAN ZH H（滿志宏），YANG X Y（楊玉新），ZHANG CH Y（張春雨）.The present situation and development of Heilongjiang ProvinceEmpetrumnigrum［J］.HeilongjiangScienceandTechnologyInformation（黑龍江科技信息），2007，1：122（in Chinese）.

［5］ 李春燕.東北巖高蘭對大鼠酒精性脂肪肝的預防作用研究［D］.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2009.

［6］ WANG X H（王旭紅），QIN M J（秦民堅），DNEG X（鄧 霞）.Five ranunculaceae plants root transverse section microscopic identification of Nanjing area［J］.JournalofChineseMedicinalMaterials（中藥材），2004，10：728－730（in Chinese）.

［7］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［8］ WANG P（王 平），CHEN X L（陳錫林），etal.A comparative study of steam distillation and supercritical fluid extraction of the volatile oilGalangaandLigusticumchuanxiongHort［J］.ChineseTraditionalPatentMedicine（中成藥），2004，6：12－15（in Chinese）.

［9］ CHEN X Y（陳曉穎）.Comparison between two methods for extractingTurmericvolatile oil by GC／MS method［J］.JournalofGuangdongPharmaceuticalUniversity（廣東藥學院學報），2001，4：293－296（in Chinese）.

［10］ YAN X X（晏小霞），etal.Different parts of the essential oils chemical constituents of GC－MS analysis fromAlpiniakatsumadaiHayata［J］.ChineseJournalofTropicalCrops（熱帶作物學報）2013，7：1 389－1 394（in Chinese）.

［11］ HU ZH H（胡正海），YU G（余 剛）.Study on the structure and development of secretory vesicle inPoncirustrifoliata［J］.Journalof IntegrativePlantBiology（植物學報），1993，6：447－452（in Chinese）.

［12］ TUMER G W.A brief history of the lysigenous gland hypothesis［J］.Bot.Rev.，1999，65（1）：76.

［13］ BENNICI A，TANI C.Anatomical and ultrastructural study of the secretory cavity development ofCitrussinensisandCitruslimon：Evaluation of schizolysigenous ontogeny［J］.Flora，2004，199（6）：464.

［14］ CHEN Y，WU H.Programmed cell death involved in the schizolysigenous formation of the secretory cavity inCitrussinensisL.（Osbeck）［J］.Chin.Sci.Bull.，2010，7（55）：2 160.

［15］ LIANG S J，WU H，LUN X.Secretory cavity development and its relationship with the accumulation of essential oil in fruits ofCitrus medicaL.var.sarcodactylis（Noot.）Swingle［J］.J.IntegratPlantBiol.，2006，48（5）：573.