張 寧，張 顯＊，張 勇，馬建祥，楊小振，王永琦，2

（1 西北農(nóng)林科技大學 園藝學院／農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊陵712100；2 漢中農(nóng)業(yè)技術推廣中心，陜西漢中723000）

甜瓜（CucumismeloL．）是黃瓜屬（Cucumis）作物，是廣泛種植的水果型蔬菜。隨著生活水平的不斷提高，消費者對甜瓜果實品質(zhì)的要求也日益提高，因此改善甜瓜營養(yǎng)品質(zhì)是當前甜瓜品質(zhì)育種的重要內(nèi)容。甜瓜果實中含糖量是影響其品質(zhì)成分的重要因子。甜瓜果實中可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖［1］，已有研究表明糖類的甜度由高到低依次為果糖、蔗糖和葡萄糖［2］。因此開展甜瓜果實糖含量相關性狀的遺傳改良對改善果實營養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，遺傳連鎖圖譜的出現(xiàn)為瓜類作物果實糖含量相關性狀的遺傳改良研究提供了有力的工具。目前國內(nèi)外研究者已開展了瓜類作物果實糖含量QTL 定位研究。Burger等［3］對西瓜糖含量性狀的遺傳效應研究結(jié)果表明高糖含量由單隱性基因控制。Paris等［4］對不同環(huán)境條件下甜瓜果實可溶性固形物含量進行了QTL 定位，在2種環(huán)境中均檢測到與可溶性固形物含量相關的2 個QTL 位點，分別為Ssc7．4 和Ssc10．8；Monforte等［5］利用F2群體和DH 系群體對甜瓜果實糖分進行了QTL 定位，檢測到與果實糖分相關的5個QTL位點。郭少貴等［6］對不同環(huán)境條件下西瓜果實可溶性固形物含量進行QTL 定位，分析認為位于第1連鎖群上的2個位點可能是控制西瓜可溶性固形物含量的主效基因位點。劉識等［7］通過構建西瓜F2群體對果實中心糖和邊糖含量進行QTL定位，檢測到與中心糖含量相關的QTL 為Tmsc3．1，貢獻率為6．56%；邊糖含量相關的QTL為Tesc12．1，貢獻率為7．90。然而有關利用甜瓜遠緣群體構建的遺傳圖譜對果實糖含量相關性狀進行QTL定位方面的研究尚未見報道。本研究以糖含量差異較大的甜瓜品系0246與野生種質(zhì)Y101雜交獲得的F2代群體為試驗材料，基于SSR 標記技術構建甜瓜遺傳連鎖圖譜，分析與果實糖含量相關性狀緊密連鎖的QTL 位點，以期為甜瓜果實糖含量相關基因的精細定位及克隆奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 試驗材料

親本材料為栽培厚皮甜瓜0246（P1）和野生薄皮甜瓜Y101（P2），雙親糖含量相關性狀差異顯著，其中P1和P2都是經(jīng)過多代自交選育的自交系。以雙親配制的包含135個單株的F2代群體為試驗材料。試驗材料由西北農(nóng)林科技大學園藝學院西瓜甜瓜課題組提供。

1．2 試驗方法

1．2．1 群體構建及田間試驗設計 2011年春季雙親雜交獲得F1代種子。2012年春季將F1代自交，獲得F2代種子。2013年春季將試驗材料種植于大棚內(nèi)，其中P1、P2、F1代各種植30株，每個小區(qū)種植10株，3 次重復；隨機種植F2代135 株。株距35 cm，行距75cm，吊蔓栽培，單蔓整枝，第13～15節(jié)子蔓留單果，按常規(guī)栽培管理進行。

1．2．2 糖含量的測定 果實收獲后，取每個果實的邊部直到中心的果肉混合，稱取每份5g，重復3次，放于－80℃冰箱中保存。果實糖含量待測液提取參照萬學閃等［8］的方法，略有改動：取5g凍樣加入6mL 80%乙醇溶液，混勻后放于80℃水浴鍋中浸提40min，10 000r／min離心20min，吸取上清液，并將殘渣重復上述操作合并上清液，定容至25mL待用。果糖和蔗糖含量采用蒽酮比色法測定［9］，還原糖含量采用3，5－二硝基水楊酸比色法測定［10］，測定的還原糖含量數(shù)值減去果糖含量數(shù)值即為葡萄糖含量數(shù)值，果糖、葡萄糖和蔗糖含量數(shù)據(jù)的和即為總糖含量［11］，重復3次，取平均值。

果糖含量（g／kg）＝（0．178A＋0．00018）×f

還原糖含量（g／kg）＝（0．6A＋0．0078）×f

蔗糖含量（g／kg）＝（0．04A－0．0004）×f

式中，A為吸光值；f為稀釋倍數(shù)，以鮮重計。

1．2．3 SSR 引物來源 2013年春季，苗期采集母本、父本、F1、F2單株莖間嫩葉2g，采用改良CTAB法提取甜瓜基因組DNA［12］。試驗用的SSR 引物序列來自已公開發(fā)表文獻［13－25］及互聯(lián)網(wǎng)葫蘆科作物EST 數(shù) 據(jù) 庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／dbEST；http：／／www．icugi．org／），共計506 對，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。甜瓜SSR－PCR反應體系及程序參照喬軍等［26］方法，略有改動。SSR 擴增產(chǎn)物用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，對結(jié)果進行記錄。

1．2．4 QTL分析 利用Microsoft Excel 2010軟件對分子試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。將符合分離比（1∶2∶1）的標記利用Joinmap 4．0軟件構建遺傳連鎖圖譜。選擇QTL IciMapping V3．2軟件進行QTL分析。采用完備區(qū)間作圖（ICIM）法對果實糖含量相關性狀進行QTL 定位，LOD 閾值設定為3．0，以1cM 為步進區(qū)間對全基因組進行QTL 掃描，并進行1 000次置換檢測。

2 結(jié)果與分析

2．1 糖含量相關性狀遺傳分析

由表1 可知，母本與父本果糖含量分別為16．326和3．559g／kg，葡萄糖含量分別為12．462和2．420g／kg，蔗糖含量分別為50．045 和2．538 g／kg，總糖含量分別為78．770 和8．517g／kg。利用DPS V7．05軟件對親本間糖含量性狀進行顯著性分析，表明雙親糖含量性狀差異極顯著，數(shù)據(jù)可用于QTL分析。F2代群體果糖、葡萄糖、蔗糖和總糖含量性狀多數(shù)均介于雙親之間且分離明顯，表現(xiàn)多峰分布，峰度及偏度均小于1，由此可知屬于典型的數(shù)量性狀遺傳。

2．2 多態(tài)性引物的篩選

利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計對提取的雙親、F1及F2基因組DNA 進行檢測，結(jié)果表明其濃度和質(zhì)量均適用于SSR 擴增。選擇506對SSR 引物對雙親進行多態(tài)性擴增，共篩選出具有多態(tài)性且穩(wěn)定遺傳的SSR 引物67 對，多態(tài)率為13．24%。

2．3 遺傳連鎖圖譜的構建

利用篩選出具有多態(tài)性的SSR 引物67對，并對F2遠緣群體135個單株DNA 進行多態(tài)性擴增，然后再進行卡方檢測。結(jié)果表明在67個標記中有58個標記符合理論分離比（1∶2∶1），其余9個標記表現(xiàn)出不同程度的偏分離現(xiàn)象。SSR 標記在F2群體部分單株中的擴增帶型如圖1。

采用Joinmap 4．0 軟件對篩選出的58 個標記進行遺傳連鎖圖譜的構建，得到一張包含有14個連鎖群的遺傳連鎖圖譜。58個標記分屬于14個連鎖群，覆蓋基因組長度為726．30cM，相鄰標記間距離為12．74cM，各連鎖群的標記數(shù)為2～10，長度為18．1～118．0cM。標記最多的第8連鎖群，分布10個標記，標記間平均距離為13．10cM，標記最少的分別為第7、10、14連鎖群，只分布了2個標記。平均遺傳距離最大的為第13連鎖群，平均遺傳距離為30．70cM，平均遺傳距離最小的連鎖群為第13 連鎖群，平均遺傳距離為9．00cM（表2）。

表1 親本及F2 群體果實糖含量相關性狀遺傳分析Table 1 Genetic analysis of fruit sugar content correlated traits in two parents and F2population

2．4 糖含量相關性狀的QTL分析

依據(jù)得到的甜瓜遺傳連鎖圖譜和果實糖含量相關性狀的表型數(shù)據(jù)，運用QTL IciMapping V3．2軟件對果實糖含量相關性狀進行QTL 掃描分析。結(jié)果表明，在第3和第4連鎖群（LG3、LG4）上檢測到2個分別與總糖含量和果糖含量相關的QTL（圖2）。QTL的命名是以性狀的英文縮寫、連鎖群號以及QTL編號為依據(jù)。

將與果糖含量和總糖含量相關的QTL 位點分別命名為Fru4．1和Ts3．1。由表3中可知，F(xiàn)ru4．1位點位于第4連鎖群CMAGN73－CMTC168標記區(qū)間，與標記CMAGN73的遺傳距離為16．0cM。該位點加性效應值為0．40，加性效應為正值，對增加果糖含量表現(xiàn)為增效累加效應?？山忉尡硇妥儺惖?3．02%。Ts3．1 位點位于第3 連鎖群CMCTN5－TJ10標記區(qū)間，與標記TJ10 的遺傳距離為12．6 cM。該位點加性效應值為9．26，加性效應為正值，對增加總糖含量表現(xiàn)為增效累加效應。可解釋表型變異的14．89%。

表2 甜瓜連鎖遺傳圖譜的基本參數(shù)Table 2 Description of the linkage groups in melon

圖1 SSR 標記在F2 群體中PCR 擴增的部分帶型Fig．1 PCR profiles generated by SSR in part of F2population

圖2 甜瓜遺傳連鎖圖譜構建及果糖和總糖含量相關QTL分析Fig．2 The construction of genetic linkage map and analysis of QTLs associated with fructose and total sugar contents in melon

表3 甜瓜果糖和總糖含量相關的QTLTable 3 QTLs associated with fructose and total sugar contents in melon

3 討 論

偏分離是植物構建遺傳連鎖圖譜研究中的一種非常普遍的現(xiàn)象，能夠提高群體內(nèi)雜合基因型的頻率。研究者普遍關注偏分離現(xiàn)象的原因，主要是因為其具有一種非常重要的進化原動力［27］。劉莉等［28］采用西瓜F2群體，基于AFLP 標記構建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為27%；朱子成等［29］采用甜瓜重組自交系，基于SSR 標記構建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為7．98%；張雪嬌等［30］采用甜瓜重組自交系，基于SSR 標記構建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為9．33%；王兆吉等［31］采用西瓜F2群體，基于SSR 標記構建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為18．18%。本研究采用甜瓜F2群體，基于SSR 標記構建遺傳連鎖圖譜，偏分離率為13．43%。由此可見，不同的試驗材料及構圖群體可能會導致不同程度的偏分離現(xiàn)象。本研究偏分離率較高，可能是由于所選用的作圖群體較小，導致標記表現(xiàn)出偏分離現(xiàn)象。

SSR 標記具有覆蓋基因組范圍廣、共顯性和可重復性好等特點而不僅被廣泛應用于瓜類遺傳連圖譜的構建工作中，還被應用于構建高密度遺傳連鎖圖譜。譚行之等［32］利用SSR 和AFLP標記構建了一張包括12個連鎖群和84個標記位點的南瓜遺傳連鎖圖譜。本研究利用SSR 標記構建了一張包括14個連鎖群和58個標記的遺傳連鎖圖譜。覆蓋基因組長度為726．30cM，標記間平均圖距為12．74 cM。此外，在LG2、LG3、LG4、LG5、LG11、LG12連鎖群上標記間遺傳距離較大，表明這些部位的標記空缺較多，可能是由于作圖群體數(shù)量較小，導致了標記間交換值估計的偏差。在以后的研究中，需增加作圖群體數(shù)量來獲得標記間遺傳距離較小的遺傳圖譜。

Harel－Beja等［22］對甜瓜果實糖含量性狀進行QTL定位發(fā)現(xiàn)了與蔗糖含量相關的6 個QTL 位點，遺傳效應以加性為主，同時還將與果糖含量相關的1個QTL 位點定位到第4 連鎖群。Soon等［33］對甜瓜果實糖含量性狀進行QTL 定位，結(jié)果表明與蔗糖含量相關的6個QTL 位點遺傳效應以加性為主。這與本試驗的結(jié)果一致。本研究共檢測到與果糖和總糖含量相關的2 個QTL 位點，且均為加性遺傳效應，分別對增加果糖和總糖含量效應表現(xiàn)出增效累加性。其中將與果糖含量相關的1個位點定位于第4連鎖群，可解釋表型變異的13．02%；將與總糖含量相關的1個位點定位于第3連鎖群，可解釋表型變異的14．89%。已有研究表明貢獻率低于5%可視為微效QTL，貢獻率高于15%可視為主效QTL［34］。本研究中與總糖含量相關的QTL 位點貢獻率為14．89%，接近于15%，可視為主效QTL。然而糖分含量符合典型數(shù)量性狀遺傳特征，比較容易受到環(huán)境條件的影響。因此本研究檢測到的2個QTL 位點需進一步利用永久性群體進行重復的驗證，以期為甜瓜果實糖含量相關基因的精細定位提供理論依據(jù)，進而為甜瓜果實品質(zhì)的遺傳改良奠定基礎。

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