徐 晟，江宜龍，蔣明敏，卜 多，傅江燕，夏 冰，汪 仁

（江蘇省中國科學院植物研究所，南京210014）

石 蒜（Lycorisradiata）為石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜屬（Lycoris）多年生草本植物，具有重要的觀賞和藥用價值。石蒜適應性強，耐旱、耐濕和耐瘠薄土壤，并有一定的耐陰性，是園林綠化造景的好材料［1］。石蒜鱗莖含有石蒜堿（lycorine）、石蒜胺堿（lycoramine）、石蒜倫堿（lycorenine）、加蘭他敏（galanthamine）等多種石蒜科生物堿，臨床上可用于治療阿爾茨海默式病和小兒麻痹癥等疾?。?］。

Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶（Δ1－pyrroline－5－carboxylate synthetase，P5CS，EC 2.7.2.11／1.2.1.41）是植物通過谷氨酸途徑合成脯氨酸的關鍵酶［3］，它是一個雙功能酶，具有γ－谷氨酰激酶和谷氨酰γ－半醛脫氫酶活性，催化從谷氨酸合成脯氨酸的最初兩步反應，其活性受脯氨酸反饋抑制［4］。在逆境條件下，P5CS基因的誘導表達伴隨著脯氨酸合成的增加，因此，P5CS被認為是植物體一個重要的抗逆相關基因［5－6］。目前，已經在豇豆、擬南芥、蒺藜苜蓿、高粱、大麥、普通菜豆、水稻、普通煙草及唐古特白刺等多種植物中克隆到了P5CS基因，并對它們在逆境脅迫下的表達模式進行了研究［3，7－14］。此外，大量研究表明，通過轉基因技術在植物體內過表達P5CS基因，能夠顯著提高植物的耐旱和耐鹽性［15－22］。

目前，對石蒜脯氨酸合成酶基因仍然沒有很好的研究，尚未有石蒜P5CS基因的相關報道。我們在先前的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，石蒜屬植物換錦花和中國石蒜體內脯氨酸含量增加［23］。本研究采用同源克隆、RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術結合RT－PCR 技術從石蒜葉片中克隆到1個P5CS同源基因的全長cDNA（LrP5CS），并對其在滲透脅迫下的表達規(guī)律進行了分析；最后通過構建原核表達載體，轉化獲得LrP5CS編碼基因的大腸桿菌BL21（DE3）工程菌，通過IPTG 成功誘導表達出目的蛋白，為進一步研究LrP5CS及脯氨酸在石蒜中的作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

實驗材料為種植于江蘇省中國科學院植物研究所實驗場的石蒜（Lycorisradiata）。選取大小、生長狀況一致的石蒜鱗莖，在其處于休眠期時移栽到相同規(guī)格的塑料盆（直徑11cm，高15cm）中，盆土為土、河沙和腐殖質的混合物（土∶河沙∶腐殖質＝1∶3∶1），每盆裝土1kg。待其出葉后，選取葉片長勢一致的植株，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照16h、黑暗8h、溫度（22±2）℃、相對濕度60%，培養(yǎng)至二葉期供試備用。

聚乙二醇（PEG）處理：將石蒜材料根及鱗莖浸于25%PEG6000溶液中，分別于處理后的0、1、3、6、12、24和48h取供試樣品葉片，液氮冷凍后置于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

干旱脅迫處理：參考汪仁等［23］描述的水分梯度法進行干旱脅迫處理，各處理分別在達到設定水分標準的第0、4、8、12和16天取樣進行指標測定。

原核表達載體pET－28a、大腸桿菌菌株BL21（DE3）和TOP10均由本實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 石蒜總RNA 提取及cDNA 合成 利用高純度總RNA 提取試劑盒的操作說明，進行各個組織及PEG 處理不同時間點RNA 的提??；提取完畢后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的純度與完整性。cDNA 第一鏈合成參照Fermentas公司反轉錄試劑盒的說明書進行。采用Clontech公司的試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit進行序列的RACE擴增。

1.2.2LrP5CS基因克隆 根據GenBank上已知的P5CS基因序列，經序列多重比對分析，在P5CS各成員的保守區(qū)設計兼并引物用于擴增保守區(qū)序列，經測序后，根據得到的序列分別設計3′－RACE和5′－RACE引物用于擴增3′末端和5′末端。擴增產物經測序后，在DNAMAN 上進行序列拼接，根據拼接全長預測最大開放閱讀框（ORF），設計引物進行ORF 驗證，本研究所用的引物信息見表1。PCR 反應程序為：95 ℃預變性3min；94 ℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產物，采用普通DNA 產物純化試劑盒純化目的條帶，通過TA 克隆法連接到pMD19－T 載體（TaKaRa試劑公司），轉化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素（50mg／L）LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落，菌落PCR 檢測是否有插入片段，將陽性克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.3LrP5CS基因的生物信息學分析 在NCBI數(shù)據庫BLAST（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）中進行序列比對，并利用ORF Finder軟件進行開放閱讀框（ORF）預測。采用DNAMAN 7.0軟件對基因編碼的氨基酸序列進行比對分析；用Prot－Param 軟件（http：／／web.expasy.org／protparam／）在線分析該蛋白的分子量、等電點；用TMHMM（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM－2.0）預測跨膜結構；用SignalP（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）預測信號肽；用SOPMA在線軟件預測蛋白的二級結構。從NCBI數(shù)據庫下載不同植物P5CS蛋白序列，利用軟件MEGA 5.0采用Neighbor－Joining（NJ）模型，進行1 000 次Bootstrap統(tǒng)計學檢驗構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR 分析 實時熒光定量PCR 采用TaKaRa 公司熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行。以石蒜Actin片段為內標，上述cDNA材料為模板，分別根據本實驗室轉錄組測序結果中比對到的LrActin基因［24］和本研究中LrP5CS基因的測序結果設計定量PCR 特異引物（表1）。20 μL熒光定量PCR 反應體系中，包含1μL cDNA 模板，10μL 2×SYBR Premix ExTaqⅡ，10μmol·L－1的上下游引物各0.8μL，7.4μL ddH2O。反應程序如下：95℃預變性2min；95℃變性15s，60℃退火15s，72 ℃延伸20s，共40個循環(huán)。每個樣品設置3 次重復。反應結束后，利用2－ΔΔCt法進行相對表達量分析。

1.2.5LrP5CS基因原核表達載體的構建 根據原核表達載體pET－28a的多克隆位點，設計帶有酶切位點的原核表達引物（上游引物含有BamHⅠ酶切位點，下游引物含有SalⅠ酶切位點，表1）。以石蒜cDNA 為模板擴增LrP5CS基因編碼區(qū)（CDs）序列片段。經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶后，連接到pMD19－T 載體上，轉化到大腸桿菌Top10中，挑取經PCR 驗證含有目的基因條帶的單菌落，擴大培養(yǎng)提取質粒。

通過BamHⅠ和SalⅠ分別雙酶切pMD19TLrP5CS和pET－28a質粒，連接后，轉化到大腸桿菌Top10，挑取經PCR 驗證正確的單菌落測序。待測序正確后將單菌落擴大培養(yǎng)提取目的質粒，轉化BL21（DE3）表達菌株并PCR 驗證。

1.2.6LrP5CS基因的原核表達 分別挑取含有pET－28a和pET－28a－LrP5CS 質 粒 的BL21（DE3）表達菌株，轉接到10 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 mg／L卡那霉素）中，于37℃恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。第2天，按1∶1 000的比例將菌液轉接到100 mL新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.8 左右（取樣，作為0h 樣品），加入終濃度1 mmol／L IPTG 37 ℃培養(yǎng)12h，離心收獲菌體（取樣，作為誘導后樣品）。6 000r／min離心10min，棄上清，菌體樣品加入50μL 2×上樣緩沖液和50μL ddH2O 混勻，在100 ℃沸水中煮沸5min，冰上冷卻后，取20μL 進行SDS－PAGE（5%濃縮膠，10%分離膠）電泳檢測。電泳后，經考馬斯亮蘭染色、拍照，分析蛋白表達結果。

1.2.7 脯氨酸含量 脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定［25］。

1.3 數(shù)據處理

實驗數(shù)據采用SPSS 16.0進行方差分析，采用Duncan氏新復極差法進行處理間多重比較，并用t測驗對處理與對照樣品的相對定量結果進行統(tǒng)計分析，Origin統(tǒng)計制圖。

2 結果與分析

2.1 LrP5CS 基因全長cDNA克隆與序列分析

以石蒜葉片cDNA 為模板，利用兼并引物，通過PCR 擴增獲得1條977bp特異條帶，經測序后，獲得了預期的保守序列。通過3′－RACE擴增，獲得了1 204bp 3′端序列；通過5′－RACE 擴增，獲得了709bp 5′端序列（圖1、表1）。利用DNAMAN 6.0將獲得的3 段序列進行拼接，并根據ORF Finder查找和設計ORF 引物，對拼接序列進行PCR 擴增和測序驗證（圖1）。結果顯示：LrP5CS基因（Gen－Bank登錄號KT247899）全長cDNA 序列為2 521 bp，其中5′非編碼區(qū)序列（5′－UTR）長93bp，3′非編碼區(qū)序列（3′－UTR）長286bp，開放閱讀框（ORF）為2 139bp。編碼713個氨基酸殘基。Protparam 軟件預測結果顯示：該基因編碼蛋白分子式為C3411H5594N958O1033S20，相對分子質量為77.19kD，理論等電點為6.34，不穩(wěn)定系數(shù)為32.91，為不穩(wěn)定類蛋白。

保守結構域分析表明，該基因編碼的蛋白含有G5K 結構域（Glutamate－5－kinase domain），具有激酶活性位點、ATP結合位點，屬于氨基酸激酶超基因家族（amino acid kinases superfamily，AAK）；此外，該蛋白還包1個屬于依賴于NAD（P）的醛脫氫酶超基因家族（aldehyde dehydrogenase superfamily，ALDH－SF）的結構域。利用SOPMA 在線軟件進行二級結構預測結果顯示：該氨基酸序列由40.39%α－螺旋、24.26%無規(guī)則卷曲、24.26%延伸鏈和11.08%β－轉角組成。另外，該蛋白無信號肽，無跨膜結構域，屬于疏水性蛋白。

表1 P5CS基因克隆與表達分析引物信息Table1 Primers used in P5CSgene cloning and expression analysis

2.2 LrP5CS 基因編碼的蛋白同源性及進化分析

根據石蒜LrP5CS推導氨基酸序列，與NCBI數(shù)據庫中部分植物P5CS 蛋白氨基酸序列進行比對。結果（圖2）顯示，該基因編碼氨基酸序列與其他物種P5CS氨基酸序列具有較高的相似度，其中與海棗（Phoenixdactylifera）PdP5CS（XP＿008777668）、油棕（Elaeisguineensis）EgP5CS（XP＿010931190）、毛果楊（Populustrichocarpa）PtP5CS（XP＿002315202）、菜豆（Phaseolusvulgaris）PvP5CS（ABY61079）和牛角瓜（Calotropisprocera）CpP5CS（AHM25913）的相似度分別為85.85%、86.82%、81.28%、78.50%和79.89%。聚類結果（圖3）顯示，石蒜LrP5CS基因氨基酸序列與海棗假定蛋白PdP5CS（XP＿008777668）及油棕假定蛋白EgP5CS（XP＿010931190）聚為一類，說明它們的親緣關系最近。

2.3 LrP5CS 基因的組織分布及在滲透脅迫下的基因表達分析

采用實時熒光定量PCR 技術，以LrActin基因為內參，分析LrP5CS基因的組織特異性表達（圖4）。結果顯示，LrP5CS在根、鱗莖和葉片中均有表達，其中在鱗莖中的表達量最高，根中的表達量最低。此外，對LrP5CS在20% PEG 處理下的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)LrP5CS受PEG 脅迫處理的誘導表達，其基因相對表達量在處理后6h達到最高，是對照的5倍多，達極顯著水平；在處理12～48h，基因相對表達量水平逐漸下調至對照水平（圖5）。

2.4 干旱脅迫處理下石蒜體內脯氨酸含量的變化

干旱脅迫下，石蒜體內脯氨酸含量也隨干旱脅迫時間的延續(xù)而逐漸增加，而在正常對照處理下，石蒜體內脯氨酸含量變化不顯著（表2）。例如，石蒜體內脯氨酸含量在脅迫的第8天時，比對照顯著增加了66.31%；在脅迫的第16 天時，石蒜體內脯氨酸含量比對照顯著增加了134.41%，達到最大值。

圖2 LrP5CS推導的氨基酸序列與其他植物P5CS蛋白序列比對Fig.2 The deduced amino acid sequences of LrP5CS compared with other plant P5CS proteins

圖3 石蒜與其他物種P5CS 基因氨基酸序列進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of LrP5CS fromL.radiataand other plants

圖4 LrP5CS 基因在石蒜不同組織中的表達Fig.4 The expression patterns of LrP5CSgene in different tissues of L.radiata

2.5 LrP5CS 基因原核表達載體構建與表達分析

使用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pET－28a－LrP5CS質粒，可切出目的片段（圖6），表明LrP5CS基因已成功插入表達載體pET－28a中。隨后，對重組表達質粒測序，結果表明，目的基因與原序列一致，且未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象。進一步，挑取測序正確的單菌落擴大培養(yǎng)提取目的質粒，轉化BL21（DE3）表達菌株并PCR 驗證（圖6），結果顯示擴增的目的片段與預期結果一致。

圖5 20%PEG 處理對LrP5CS 基因表達的影響Fig.5 The expression level of LrP5CSgene under 20%PEG treatment

將重組質粒pET－28a－LrP5CS和空載體質粒pET－28a轉化的表達宿主菌在37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.8 左右，分別加入終濃度1 mmol／L 的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)，分別誘導表達0、6和12h后，提取細菌總蛋白進行SDS－PAGE 分析。結果（圖7）表明，與對照相比，pET－28a－LrP5CS轉化菌經IPTG誘導后，在相對分子質量82.58kD（含部分載體蛋白）左右有1條明顯的蛋白條帶，表明重組質粒pET－28a－LrP5CS在大腸桿菌BL21（DE3）中成功誘導表達了LrP5CS蛋白。

表2 干旱脅迫處理下石蒜體內脯氨酸含量的變化Table2 Changes of proline content in L.radiata under drought stress

圖6 重組質粒pET－28a－LrP5CS的酶切鑒定和菌落PCRFig.6 Restriction digestion of recombinant plasmid pET－28a－LrP5CS and its colony PCR

3 討 論

圖7 LrP5CS 誘導表達的SDS－PAGE分析Fig.7 SDS－PAGE analysis of the expression of LrP5CS protein

脯氨酸是植物體應對干旱和高鹽等非生物脅迫積累的最為重要的滲透調節(jié)物質之一，植物體內脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性［26－27］。已有研究表明，植物體脯氨酸的合成根據起始氨基酸的不同分為谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑，其中谷氨酸途徑在滲透脅迫和氮素缺乏的情況下發(fā)揮了重要作用［28］。而P5CS 則是植物體內催化谷氨酸途徑合成脯氨酸過程中的限速酶，在脯氨酸的合成過程中起著至關重要的作用［3，29］。本研究采用同源克隆、RACE方法結合RT－PCR 技術從石蒜中克隆得到了P5CS基因，并命名為LrP5CS。氨基酸序列比對顯示，該基因推導的氨基酸序列與已知的其他植物P5CS基因的氨基酸序列一致性均在70%以上，說明該基因在物種進化上具有高度的保守性。多序列比對還發(fā)現(xiàn)，LrP5CS 氨基酸序列與其他物種P5CS序列具有相似的保守域。LrP5CS基因分別屬于氨基酸激酶（AAK）和醛脫氫酶（ALDH－SF）超基因家族中的一個成員。LrP5CS 蛋白質的保守結構域，包括ATP和NADPH 結合位點，2個亮氨酸結構域，谷氨酰激酶（GK）結構域和谷氨酸半醛（GSA）結構域，不具有跨膜結構及信號肽，進一步說明該基因在物種進化過程的保守性很高。此外，系統(tǒng)進化樹分析結果說明，LrP5CS與海棗和油棕的P5CS聚為一類，親緣關系最近。

實時熒光定量PCR 結果表明，LrP5CS在根、鱗莖和葉中具有表達，其中在鱗莖中的表達量最高，這可能與石蒜具有肉質鱗莖的特征有關；石蒜作為較為耐旱的一種石蒜屬植物，鱗莖是其具有抗旱性的重要器官。此外，LrP5CS基因受PEG 滲透脅迫誘導表達，而干旱處理下，石蒜體內脯氨酸含量則顯著上升；上述結果進一步暗示石蒜體內可能存在著滲透脅迫后脯氨酸積累的適應機制，同時LrP5CS基因與石蒜的抗旱性可能具有一定的相關性。另一方面，通過多物種P5CS基因序列比對分析表明，植物基因在進化過程中發(fā)生過基因拷貝復制現(xiàn)象，即P5CS基因在植物體內存在雙拷貝［30］。例如：擬南芥中有AtP5CS1 和AtP5CS2 兩個P5CS同源基因。在滲透脅迫下，AtP5CS1基因在各種器官和不同的組織中都表達，并在脫水、高鹽和ABA 處理下誘 導 表 達［31－32］。AtP5CS2 基 因 在 培 養(yǎng) 的 分 裂 細 胞表達，并且逆境下該基因的誘導依賴于蛋白質的合成［33］。由此可見，同一植物P5CS基因可以對不同的逆境脅迫作出反應，而不同的P5CS基因也可以受同一種脅迫誘導表達。而石蒜體內是否存在P5CS同源基因，還需進一步研究。

此外，本研究通過構建LrP5CS基因原核重組表達載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3），成功實現(xiàn)了該基因的原核表達。這為通過組氨酸（His）標簽純化、獲得高純度的融合蛋白，深入研究LrP5CS的反應動力學催化特性奠定了基礎。另外，近年來，通過生物技術提高植物自身體內脯氨酸的含量，從而獲得對于逆境脅迫抗性較強的轉基因植株取得了一定應用。LrP5CS基因的克隆及相關研究也為進一步研究分析石蒜耐旱分子機制和抗逆分子育種提供了有利的理論基礎。

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