朱超，夏建才，朱麗

（云南開(kāi)放大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650500）

L-α-甘油磷脂酰膽堿的制備研究進(jìn)展

朱超，夏建才，朱麗

（云南開(kāi)放大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650500）

L-α-甘油磷脂酰膽堿（L-α-glycerol phosphatidylcholine，L-α-GPC）是具有良好生物活性的小分子物質(zhì)，在人和動(dòng)物體內(nèi)大量存在，參與中間代謝，發(fā)揮著至關(guān)重要的生理作用，是磷脂改性研究的一個(gè)重要組成部分。介紹并對(duì)比了L-α-GPC的各種制備方法，全合成法具有產(chǎn)物分離容易、純度高的優(yōu)勢(shì)，但存在原料昂貴、藥學(xué)性質(zhì)不同等缺點(diǎn)；半合成法具有原料廉價(jià)易得、收率高的特點(diǎn)，成為當(dāng)前研究的主流。

磷脂；L-α-甘油磷脂酰膽堿；制備

L-α-甘油磷脂酰膽堿（L-α-glycerol phosphatidylcholine，L-α-GPC）是具有良好生物活性的小分子物質(zhì)，在人和動(dòng)物細(xì)胞膜、腦部、血漿、肝臟等器官中大量存在，參與中間代謝，在人的神經(jīng)、記憶、生殖等生理功能上發(fā)揮著重要作用，同時(shí)它還是一個(gè)重要的化學(xué)合成中間體［1-4］。其分子由一個(gè)非極性頭（甘油）和一個(gè)極性頭（磷脂酰膽堿）組成，因而具有兩性特性，此外，分子內(nèi)存在季胺堿正電荷和磷酸負(fù)電荷，為一個(gè)分子內(nèi)鹽，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 L-α-GPC的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of L-α-GPC

高純度的L-α-GPC在常溫常壓下穩(wěn)定，為具有黏性的無(wú)色透明液體，但久置在空氣中易被氧化而顏色變深，國(guó)產(chǎn)的部分L-α-GPC因含有色素、非極性雜質(zhì)而呈黃色，其儲(chǔ)存條件一般為－20℃密封保存。低純度的L-α-GPC藥理作用弱，還可能產(chǎn)生毒素，我國(guó)的藥用L-α-GPC主要靠進(jìn)口，價(jià)格十分昂貴，1 g純度大于95%的L-α-GPC的價(jià)格接近1 000美元［5］。所以，改進(jìn)生產(chǎn)工藝以提高L-α-GPC的純度和收率具有十分重要的意義。

1 全合成法制備L-α-GPC

L-α-GPC的全合成主要是以較純的對(duì)映異構(gòu)體，如（S）-2，2-二甲基-1，3-二氧-4-甲醇、（L）-甘油-3-磷酸、D-亞異丙基甘油等［6］為起始原料，經(jīng)過(guò)幾步縮合反應(yīng)而得到。

Puricelli［7］用亞異丙基甘油與2-氯-2-氧-1，3，2-環(huán)氧磷戊烷為原料，經(jīng)取代、縮合、水解、陽(yáng)離子樹(shù)脂提純、乙醇重結(jié)晶得到L-α-GPC。得到的產(chǎn)物因起始原料的旋光性的不同而具有不同的旋光性。但是，2-氯-2-氧-1，3，2-環(huán)氧磷戊烷不穩(wěn)定，其制備工藝復(fù)雜，環(huán)境污染大，難以應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中。反應(yīng)路線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2 以亞異丙基甘油為起始原料的L-α-GPC制備方法Fig.2 Preparation method of L-α-GPC using isopropylideneglycerol as startingmaterial

隨后，Puricelli［7］又以D-亞異丙基甘油對(duì)甲苯磺酸酯為起始原料，與磷酸膽堿四甲基銨鹽反應(yīng)，一步制備L-α-GPC。優(yōu)點(diǎn)是中間體穩(wěn)定易分離，且收率高達(dá)75%。缺點(diǎn)是起始原料成本較高。反應(yīng)路線(xiàn)見(jiàn)圖3。

圖3 以D-亞異丙基甘油對(duì)甲苯磺酸酯為原料的L-α-GPC制備方法Fig.3 Preparation method of L-α-GPC using D-isopropylideneglycidyl tosylate as startingmaterial

Song等［8］運(yùn)用shapless環(huán)氧開(kāi)環(huán)原理，以磷酸膽堿水合鹽為起始原料，經(jīng)酸解、縮合得到甘油磷酸膽堿鹽晶體，再經(jīng)離子交換樹(shù)脂除去氯離子，得到L-α-GPC。該方法工藝簡(jiǎn)潔，起始原料便宜，交換樹(shù)脂用量少，但原料不穩(wěn)定，不易保存，且總收率低于50%。反應(yīng)路線(xiàn)見(jiàn)圖4。

圖4 Song等的L-α-GPC制備方法Fig.4 Preparation m ethod of L-α-GPC by Song，et al.

Lee等［9］先用芐基對(duì)縮水甘油進(jìn)行保護(hù)，經(jīng)開(kāi)環(huán)、?；浠玫?，2-二乙酰甘油，再與三甲胺反應(yīng)，最后水解得到L-α-GPC，收率58%，此反應(yīng)路線(xiàn)長(zhǎng)、收率不高，同時(shí)也存在三甲胺不易儲(chǔ)存等問(wèn)題。

陳新等［10］針對(duì)縮水甘油穩(wěn)定性不高、難以純化的缺陷，提出先將縮水甘油制備成穩(wěn)定、易分離的縮水甘油對(duì)甲苯磺酸酯，再與磷酸膽堿四乙基銨鹽反應(yīng)，再純化得到L-α-GPC，收率75.6%。反應(yīng)路線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 陳新等的L-α-GPC制備方法Fig.5 Preparation method of L-α-GPC by Chen Xin，et al.

全合成法具有產(chǎn)物分離容易、純度高的優(yōu)勢(shì)，但是存在反應(yīng)起始原料需要純對(duì)映異構(gòu)體，價(jià)格昂貴，產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的藥理性質(zhì)存在一定的差異，而且一些反應(yīng)中間體制備、儲(chǔ)存困難等缺點(diǎn)，所以應(yīng)用上仍然受到很大限制。

2 半合成法制備L-α-GPC

半合成法制備L-α-GPC的方法是：先從自然界中提純得到磷脂化合物，再對(duì)其進(jìn)行脫酰反應(yīng)制得。磷脂化合物的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖6，當(dāng)R3為磷脂酰膽堿（PC）時(shí)，如果只脫掉1位、2位脂肪酸，3位磷脂鍵保留，就可得到目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-α-GPC。

圖6 磷脂化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structural formula of phospholipids com pounds

2.1 磷脂酰膽堿（PC）的提純

雖然磷脂廣泛存在于自然界中，但從動(dòng)物中提取磷脂的成本較高，且純度較低；從植物中提取磷脂兼具純度和成本的優(yōu)勢(shì)，而大豆磷脂是大豆油精煉時(shí)的副產(chǎn)品，且磷脂含量高，是研究得最多也是最為重要的磷脂來(lái)源。天然的大豆磷脂是混合物，除含有磷脂酰膽堿（PC）外，還含有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷酯酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、磷脂酰絲氨酸（PS）等磷脂組分。PC含量一般僅為20%～40%［11］，且純的PC價(jià)格十分昂貴，所以一般以磷脂的混合物作為原料。由于混合物中其它類(lèi)型的磷脂也可以進(jìn)行脫酰反應(yīng)得到對(duì)應(yīng)的單甘油磷脂?；衔铮ǚ謩e為GPE、GPI、GPA、GPS），所以，為了減小反應(yīng)后的分離壓力，在進(jìn)行脫酰反應(yīng)前需要進(jìn)行提純。目前，國(guó)內(nèi)外純化PC的方法主要有：溶劑萃取法、柱層析法、超臨界流體萃取法、膜分離法等［12］。

溶劑萃取法是提純卵磷脂的常用方法，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、流程短、便于連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)。單一溶劑（如乙醇）的萃取效果不如混合溶劑，但混合溶劑回收較困難。經(jīng)初步萃取的粗品可以利用金屬離子處理，產(chǎn)品的PC含量在85%以上，但容易被金屬離子污染。吸附柱層析法和離子交換柱層析法可以得到高純度的PC，但是處理量小，洗滌溶劑用量大，蒸發(fā)溶劑能耗大，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。國(guó)外在超臨界流體萃取法提純磷脂方面做了大量工作［13］。此外，提純磷脂的非常規(guī)方法還有酶催化精制法、酶預(yù)水解法、高壓脈沖電場(chǎng)法等，都還處于研究的初始階段。

2.2 磷脂酰膽堿的脫酰反應(yīng)

磷脂的脫酰反應(yīng)，主要是磷脂化合物在水溶液或低碳醇作為溶劑的體系中，在催化劑的存在下發(fā)生酯交換反應(yīng)（圖7）。酯交換催化劑主要有生物酶、堿性催化劑、酸性催化劑3類(lèi)。以磷脂酰膽堿為原料合成L-α-GPC，需要合適的催化劑使1、2位發(fā)生反應(yīng)，而3位磷脂鍵保留。

圖7 磷脂脫酰酯交換反應(yīng)制備L-α-GPCFig.7 Preparation of L-α-GPC by deacylation transesterification reaction equation of phospholipid compound

在生物體代謝過(guò)程中，存在多種可以水解甘油磷脂酯鍵的磷脂酶類(lèi)。磷脂酶A1和A2可分別使甘油磷脂的第1位和第2位酯鍵斷裂；磷脂酶B能脫去溶血磷脂的脂肪酸；磷脂酶C、D可使3位磷酸酯鍵水解。Uziel等從干燥的青霉菌絲中提取得到溶血卵磷脂酶B，可以選擇性地使純的溶血磷脂脫去一個(gè)脂肪酸得到L-α-GPC，收率能達(dá)到45%～60%，但是此酶對(duì)脂肪酸的飽和度的選擇性存在差異，而且要求溶血磷脂必須是單酰化取代L-α-GPC，即必須是溶血磷脂，反應(yīng)路線(xiàn)見(jiàn)圖8?？傊话闱闆r下，生物酶對(duì)于底物的要求具有專(zhuān)一性，且要大量得到則需要靠細(xì)菌的大量繁殖分泌，所以，尋找能分泌催化特定酯基脫落的酶是主要任務(wù)。

圖8 青霉菌絲催化溶血磷脂脫酰反應(yīng)Fig.8 Deacylation reaction of lysophosphatide catalyzed by m ycelia of Penicillium

酸性催化劑如硫酸和苯磺酸，催化效率低，且會(huì)產(chǎn)生大量廢酸，已基本淘汰，偶爾用作高酸值的原料。常用的堿性催化劑有KOH、NaOH、甲醇鈉、Na2CO3等，具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高等特點(diǎn)，是工業(yè)上最常用的催化劑。Evans等［14］用甲醇鈉水解低濃度（大約2 g·L－1）的卵磷脂溶液后得到粗GPC，再經(jīng)提純處理，得到純的L-α-GPC，收率達(dá)96.8%。Robles等［15］采用甲醇鋰醇解從粉末蛋黃中萃取的磷脂也得到了L-α-GPC。但使用甲醇鈉作為催化劑的反應(yīng)也存在問(wèn)題：在酰氧基斷裂的同時(shí)，會(huì)造成部分P－O鍵的斷裂，得到一些對(duì)人體有害的副產(chǎn)物。Okui提出用堿土金屬進(jìn)行水解反應(yīng)，但是產(chǎn)物摻雜大量的副產(chǎn)物。Brockerhoff等將水解催化劑換為季銨堿（四丁基氫氧化銨），水解過(guò)程與Chadha［16］的結(jié)果一致，但是四丁基氫氧化銨價(jià)格昂貴，得到的產(chǎn)物不是游離的L-α-GPC，而是四丁基氫氧化銨鹽的復(fù)合物，需要再進(jìn)行結(jié)晶操作，不易大規(guī)模生產(chǎn)和重現(xiàn)性不高都使其應(yīng)用受到制約。

由此可見(jiàn)，當(dāng)使用堿性催化劑催化脫酰反應(yīng)時(shí)，需要控制好堿性的強(qiáng)弱。堿性過(guò)強(qiáng)，則易使磷脂的磷脂鍵水解；而堿性偏弱，既浪費(fèi)原料，又需要更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。另外，金屬離子的去除需要消耗大量的酸、堿、樹(shù)脂。

近年來(lái)，有學(xué)者開(kāi)始使用固體堿催化劑，得到了較一般堿性催化劑更好的結(jié)果。de Ferra等［17］以甲醇為溶劑，采用強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂作為催化劑，與PC進(jìn)行酯交換反應(yīng)，同時(shí)利用堿性樹(shù)脂本身的吸附性，初步分離，制備得到L-α-GPC。該法快速、工藝簡(jiǎn)單，收率和晶形都比較好。

2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的提純

雖然磷脂經(jīng)過(guò)提純后，PC含量顯著提升，但是原料中仍含有一定量的PE、PI、PS、PA，它們水解后則分別得到GPE、GPI、GPS、GPA。除此之外，反應(yīng)混合物還含有脂肪酸甲酯、中性脂類(lèi)等。脂肪酸甲酯和中性脂類(lèi)可以用石油醚等非極性溶劑萃取除去，但是L-α-GPC、GPE、GPI、GPS等物質(zhì)極性相近，且大都帶有弱堿性，所以它們的分離提純是需要解決的主要問(wèn)題。

最初提純L-α-GPC的方法主要是采用形成金屬?gòu)?fù)合物的方法。美國(guó)專(zhuān)利介紹了一種用過(guò)量的AgCl處理反應(yīng)液使副產(chǎn)物沉淀，再用H2S和BaCO3除去過(guò)量的銀離子，但是銀離子不能完全除盡。Hanahan等、Tattrie等通過(guò)形成氯化鎘復(fù)合物的方法提純L-α-GPC，再用大量樹(shù)脂去除鎘離子。由于得到的產(chǎn)物不是游離的L-α-GPC，需要使用離子交換樹(shù)脂去除氯化鎘，導(dǎo)致純化非常復(fù)雜，收率較低，而最主要的問(wèn)題是：即使微量的鎘離子存在，毒性仍然相當(dāng)大，不能用于工業(yè)生產(chǎn)。Tronconi等［18］報(bào)道了一種從磷脂脫酰混合物中分離L-α-GPC和GPE的方法，即向混合物中加入ZnCl2，形成（GPC+GPE）ZnCl2混合沉淀，再用吡啶置換出ZnCl2，得到純的GPC和GPE混合物，再通過(guò)強(qiáng)堿離子樹(shù)脂分離得到GPC、GPE，其工藝流程見(jiàn)圖9。但是此工藝存在操作步驟多、選擇性不強(qiáng)、產(chǎn)率不夠高等缺點(diǎn)。

圖9 Tronconi等的工藝路線(xiàn)Fig.9 Process route by Tronconi，et al.

為了得到不含金屬離子的游離L-α-GPC，人們用樹(shù)脂對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行分離，取得了很好的效果。Tronconi等［18］先用堿金屬將脫酰反應(yīng)混合物中的GPS沉淀出來(lái)，再用陽(yáng)離子樹(shù)脂、強(qiáng)堿性離子樹(shù)脂分離得到L-α-GPC與GPE。此方法樹(shù)脂用量少，收率和純度都相對(duì)較高。de Ferra等［17］研究了強(qiáng)堿性離子交換樹(shù)脂作為催化劑處理粗磷脂的醇提取液，以甲醇為溶劑進(jìn)行酯交換反應(yīng)，得到L-α-GPC、GPE、GPI。利用堿性樹(shù)脂本身的吸附性，使用不同的洗滌液將不同的產(chǎn)物洗滌下來(lái)，達(dá)到了分離的效果。反應(yīng)、分離同時(shí)在一個(gè)容器進(jìn)行，具有工藝簡(jiǎn)單、迅速、收率和純度都比較高的特點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

全合成法得到的L-α-GPC純度比較高，收率高，但原料比較昂貴，而且可能有劇毒，不易儲(chǔ)存，合成工藝路線(xiàn)長(zhǎng)；半合成法具有原料廉價(jià)易得、收率高的優(yōu)點(diǎn)。制備高純度具有醫(yī)用價(jià)值的L-α-GPC將是研究的主要方向，其中采用離子交換樹(shù)脂作為催化劑和分離介質(zhì)具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)加大研究開(kāi)發(fā)的力度。

［1］GOLDFARB D S.Method using lifespan-altering compounds for altering the lifespan of eukaryotic organisms，and screening for such compounds：US，2009163545［P］.2008-12-22.

［2］FARESE S.Dietary supplemental composition effective for enhancing cognitive performance，elevating mood and reducing oxidative stress： US，2010056484［P］.2008-08-26.

［3］MITCHELL M W.Biomarkers for prostate cancer and methods using the same：WO，2008036691［P］.2007-09-18.

［4］YAMAMOTO T，HORII I，YOSHIDA T.Integrated NMR-based metabonomic investigation of earlymetabolic effectsofethylene glycolmonomethyl ether（EGME）onmale reproductive organs in rats［J］.Journal of Toxicological Sciences，2007，32（5）：515-528.

［5］左青，胡建新.我國(guó)食品級(jí)磷脂市場(chǎng)及其存在問(wèn)題［J］.中國(guó)油脂，2012，37（11）：69-71.

［6］NGUYEN HOANG P，NGUYEN THANH T，CHABRIER P.New method for preparing alpha-and beta-glycerylphosphorylcholines and their homologs and analogs［J］.Bulletin de la Societe Chimique de France，1975，（9-10，Pt2）：2326-2328.

［7］PURICELLIL.Process for preparing alpha-glycerophosphorylch-oline： EP，486100［P］.1991-11-09.

［8］SONG Y S，SONG E S，KANG D S，et al.A process for preparation of L-alpha-glycerophosphorylcholine via condensation reaction of phosphocholine chloride with R-（+）-glycidol：WO，2007145476［P］.2007-06-14.

［9］LEE H J，PARK JM，LEE B H.Method for preparing glyceryl phosphorylcholine：KR，2009039132［P］.2007-10-17.

［10］陳新，梅以成，梁鵬.一種L-α-甘油磷酸膽堿的合成方法：中國(guó)，101544667［P］.2008-03-27.

［11］李招群，歐陽(yáng)曉露，萬(wàn)屏南.大豆磷脂的研究進(jìn)展［J］.江西化工，2009，（1）：14-16.

［12］吳麗芹，邵榮，云志.大豆卵磷脂的提純與磷脂酰膽堿含量的分析［J］.化學(xué)世界，2009，50（5）：276-279.

［13］DUNFORD N T，TENEKKU F.Extraction of phospholipids fro-m canola with supercritical carbon dioxide and ethanol［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，1995，72（9）：1009-1015.

［14］EVANSC T，MCCAGUE R，TYRRELL N D.Preparation of phospholipid-intermediate glycerophosphocholine by a crystallization process： WO，9315088［P］.1992-12-31.

［15］ROBLESEC，ROELSG F.Preparation of deacylated phosphoglycerides［J］.Chemistry and Physics of Lipids，1971，6（1）：31-38.

［16］CHADHA JS.Preparation of crystalline L-alpha-glycerophosphorylcholine-cadmium chloride adduct from commercial egg lecithin［J］.Chemistry and Physics of Lipids，1970，4（1）：104-108.

［17］de FERRA L，BONIFACIO F，CIFARELLIG，etal.A process for the preparation of glycerophospholipids：EP，575717［P］.1993-04-08.

［18］TRONCONIG，COCCOLIC.Chromatographic process for separating themain components of a mixture of raw deacylated phospholipids： WO，9115494［P］.1991-03-28.

Research Progress on Preparation of L-α-Glycerol Phosphatidylcholine

ZHU Chao，XIA Jian-cai，ZHU Li
（School of Chemical Engineering，Yunnan Open University，Kunming 650500，China）

L-α-Glycerol phosphatidylcholine（L-α-GPC）is smallmolecule with good biological activity and abounds in human and animal body，which plays critical physiological role in themetabolism.Ithas become an important research direction ofmodification of phospholipids.Various preparationmethods of L-α-GPC were introduced and compared.Total syntheticmethod had the advantages of high purity and easy in separation，but the raw materials were expensive，and pharmaceutical propertieswere different.Semi-synthetic method had the advantages of high yield and thematerialswere cheap and readily available，which became themainstream of the present study.

phospholipids；L-α-glycerol phosphatidylcholine；preparation

TQ 645.9

A

1672-5425（2015）07-0005-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.002

云南省教育廳科學(xué)研究基金一般項(xiàng)目（2013Y182）

2015-03-02

朱超（1986－），男，重慶人，博士，講師，研究方向：磷脂的提純、分離、檢測(cè)，E-mail：mikejoid@163.com。