郭洹銘，趙日明，王 錦，藺萬煌

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學理學院，湖南長沙 410128)

吲哚-3-乙酸分子印跡聚合物的合成及吸附性能分析

郭洹銘1，趙日明1，王 錦2，藺萬煌1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學理學院，湖南長沙 410128)

以吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)為模板、甲基丙烯酸為功能單體、乙腈為致孔劑，采用本體聚合法合成了對IAA有特異性識別的吲哚-3-乙酸分子印跡聚合物(IAA-MIP)。紅外光譜分析表明，IAA是以氫鍵形式結(jié)合在聚合物的空腔中。等溫吸附線及Scatchard分析表明，洗脫模板后的IAA-MIP結(jié)合IAA的能力比空白印跡聚合物(NIP)強，且有2種結(jié)合方式，其解離常數(shù)分別為KD1=1.04×10-6mol·L-1和KD2=9.23×10-6mol·L-1，最大表觀結(jié)合位點分別為Bmax1=0.10μmol·g-1和Bmax2=0.28μmol·g-1。對植物樣品的固相萃取實驗表明，洗脫模板后的IAA-MIP對IAA具有較強的特異性吸附能力。

吲哚-3-乙酸;分子印跡聚合物;本體聚合;固相萃取;吸附性能

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，MIT)是指以某一特定的分子為模板，制備對該分子具有特異選擇吸附性聚合物的過程［1］。該聚合物稱為分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer，MIP)。當模板分子與聚合物單體接觸時就會形成多重作用位點，通過聚合過程這種作用就會被記憶下來，去除模板分子后的聚合物在分子結(jié)構(gòu)上形成了與模板分子空間構(gòu)型匹配且具有多重作用位點的空間，這樣的空間將對模板分子或其類似物有選擇性識別的特性［2］。因為MIP具有選擇性吸附的功能，在天然產(chǎn)物分離純化、固相萃取、生物傳感器、藥物分析和膜分離技術(shù)［3-7］等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)是植物體內(nèi)一種重要的植物激素，參與植物體內(nèi)多種生理生化過程的調(diào)控，對植物生長發(fā)育具有十分重要的作用，植物樣品中IAA的高效提取和精確測定對于研究其在植物生命活動中的調(diào)控作用具有非常重要的意義［8-10］。但是IAA在植物體內(nèi)含量很少，每克鮮樣僅含10～100 ng，而且在光和空氣中易分解。傳統(tǒng)的植物激素分析測試方法都需要對樣品進行冷凍干燥、粉碎等前處理，并經(jīng)有機溶劑提取、分離純化后才能進行相應(yīng)測定，且對植物樣品的需求量很大，凍干樣品需要約0.5 g以上［11］。為減少植物樣品的用量，作者采用本體聚合法［12-13］合成了吲哚-3-乙酸分子印跡聚合物(IAA-MIP)，并對其特異吸附性能進行了探討，擬為植物樣品中IAA的高效吸附分離提供幫助。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，分析純，Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.;乙腈，色譜純，Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd.;甲基丙烯酸(MAA)、吲哚-3-乙酸、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

FTIR-680型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Perkin Elmer公司;LC-9A型高效液相色譜儀、UVmini-1240型紫外可見分光光度計，日本島津公司;RCT-60型真空冷凍離心機，法國Jouan公司。

1.2 IAA-M IP的合成

準確稱取IAA 0.7 g，量取3 mL功能單體甲基丙烯酸，將兩種物質(zhì)加入30mL致孔劑乙腈中充分混合，超聲波處理10 min;然后加入15 mL二甲基丙烯酸乙二醇酯與250 mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，混勻，通氮氣10 min后抽真空并密封，50℃ 水浴避光反應(yīng)24 h;反應(yīng)完成后，取出白色固體，研磨，過篩(孔徑為75 μm)，然后用丙酮沉降，去除細小顆粒;沉降后加入50 mL甲醇與乙酸(體積比9∶1)的混合液，搖床中振蕩(5 h×3次);再加入50 mL甲醇搖床中振蕩(5 h×3次)，在索氏提取器中用甲醇提取至提取物中檢測不到IAA，烘干，備用。

與上述制備條件完全相同，僅不加模板分子制備空白印跡聚合物(NIP)。

1.3 紅外光譜檢測

將IAA-MIP、洗脫模板后IAA-MIP和NIP分別與KBr混合(質(zhì)量比1∶100)，研磨均勻，進行紅外光譜檢測［14］。

1.4 等溫吸附線與Scatchard分析

分別稱取0.1 g洗脫模板后的IAA-MIP與NIP粉末放入 2組離心管中，分別加入 1μmol·L-1、2μmol·L-1、4μmol·L-1、6μmol·L-1、8μmol· L-1、10μmol·L-1的IAA乙醇溶液10 mL，以加入不含IAA的無水乙醇10 mL作空白對照。放入25℃的恒溫搖床中振蕩12 h，再在25℃下靜置12 h，取上清液測定218 nm波長處吸光度?？疾煜疵撃０搴驣AAMIP、NIP對不同濃度IAA的吸附情況，繪制等溫吸附線，并進行Scatchard分析［15］。

1.5 對植物樣品的固相萃取

分別稱取0.5 g洗脫模板后的IAA-MIP與NIP粉末裝于3 mL的固相萃取空柱中，再依次加入乙腈、去離子水，烘干柱子，備用。

準確稱取3 g擬南芥新鮮植物樣品，使用液氮研磨后加入50 mL預(yù)冷的80%甲醇，浸提過夜，3 000×g離心，取上清液，濃縮，用無水乙醇定容至10 mL。

取2 mL擬南芥提取液加入1 mL 0.1 mol·L-1的IAA乙醇溶液中，以無水乙醇定容至10 mL制成上樣液;同時另取擬南芥提取液2 mL，不加IAA標準溶液，僅以無水乙醇定容至10 mL作為對照上樣液。分別將上樣液與對照上樣液加入制好的洗脫模板后的IAAMIP與NIP固相萃取小柱中，收集萃取液;再加入9 mL乙醇進行淋洗，收集淋洗液;最后加入9 mL甲醇-乙酸混合液(體積比9∶1)進行洗脫，收集洗脫液;濃縮，分別配制成1 mL的乙醇溶液進行HPLC檢測。按下式計算IAA樣品回收率:

HPLC檢測條件如下:檢測波長218 nm，流速0.8 mL·min-1，柱溫35℃，梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC梯度洗脫條件Tab.1 The condition of HPLC gradient elution

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析(圖1)

圖1 IAA-M IP(a)、洗脫模板后IAA-M IP(b)及NIP(c)的紅外光譜Fig.1 FTIR Spectra of IAA-M IP(a)，IAA-M IP removed temp late(b)and NIP(c)

圖1a在3 446.63 cm-1處出現(xiàn)羧基的O-H伸縮振動吸收峰，而圖1b、c中O-H的伸縮振動吸收峰出現(xiàn)在3 454.82 cm-1和3 454.59 cm-1處。這是因為，IAA-MIP中羧基上的-OH與功能單體MAA上的-COOH產(chǎn)生了氫鍵作用力［16］，O-H伸縮振動吸收峰發(fā)生紅移;而洗脫模板后的IAA-MIP中無模板分子，O -H吸收峰又恢復(fù)到了3 454.82 cm-1處，與NIP中O -H的伸縮振動吸收峰基本保持一致。表明，IAA與MAA是以氫鍵方式結(jié)合在IAA-MIP的空腔中，索氏提取后IAA-MIP中IAA被完全洗脫。

2.2 等溫吸附線與Scatchard分析

為了研究洗脫模板后的IAA-MIP對IAA的吸附特性，計算出洗脫模板后的IAA-MIP與NIP對不同濃度IAA溶液的吸附量Bbound，繪制等溫吸附線，結(jié)果見圖2。

圖2 洗脫模板后IAA-M IP與NIP的等溫吸附線Fig.2 Adsorption isotherm of IAA-M IP removed template and NIP

由圖2可看出，洗脫模板后的IAA-MIP對不同濃度IAA的吸附能力明顯比NIP強。

根據(jù)Scatchard方程可得:

式中:c為IAA濃度;KD為聚合物的平衡解離常數(shù);Bmax為最大表觀結(jié)合位點。

以Bbound/c對Bbound作圖，結(jié)果見圖3。

圖3 IAA-M IP的Scatchard分析圖Fig.3 Scatchard analysis of IAA-M IP

由圖3可看出，Bbound/c和Bbound并非是很好的線性關(guān)系，表明MIP與IAA的結(jié)合位點并不是等價的［17］;但是圖中的前后兩部分卻分別顯示出了良好的線性關(guān)系。這表明IAA-MIP存在2種不同的結(jié)合位點。

根據(jù)2條直線的斜率及截距可求得低結(jié)合力結(jié)合位點的KD1=1.04×10-6mol·L-1、最大表觀結(jié)合位點Bmax1=0.10μmol·g-1;高結(jié)合力結(jié)合位點的KD2= 9.23×10-6mol·L-1、最大表觀結(jié)合位點Bmax2=0.28 μmol·g-1。

2.3 對植物提取液中IAA的吸附情況

分別將擬南芥樣品的萃取液、淋洗液、洗脫液濃縮后配制成1 mL的乙醇溶液進行HPLC檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 植物提取液中IAA的HPLC圖譜Fig.4 HPLC Chromatograms of IAA from plant extraction liquid

由圖4可看出:上樣液分別經(jīng)過洗脫模板后的IAA-MIP小柱與NIP小柱后，萃取液中IAA的含量分別為7.94%和37.55%(圖4a);洗脫模板后的IAAMIP淋洗液與 NIP淋洗液中 IAA的含量分別為13.09%和29.30%(圖4b);洗脫模板后的IAA-MIP洗脫液與NIP洗脫液中IAA的含量分別為62.64%和 32.16%(圖4c);植物樣品提取液中其它成分上柱后全部流出，洗脫液中無相關(guān)吸收峰出現(xiàn)。表明，洗脫模板后的IAA-MIP對IAA有較強的選擇吸附能力，對其它成分幾乎不吸附。增大洗脫液的極性及酸度，被吸附的IAA與其它成分分離后能有效地被洗脫回收。

3 結(jié)論

采用本體聚合法合成了IAA-MIP。紅外光譜分析表明，IAA是以氫鍵形式結(jié)合在IAA-MIP空腔中;Scatchard分析表明，洗脫模板后的IAA-MIP與IAA具有2種結(jié)合方式，其解離常數(shù)分別為KD1=1.04×10-6mol ·L-1和KD2=9.23×10-6mol·L-1，最大表觀結(jié)合位點分別為Bmax1=0.10μmol·g-1和 Bmax2=0.28μmol ·g-1。使用洗脫模板后的IAA-MIP對植物提取液中的IAA進行固相萃取，結(jié)果表明，洗脫模板后的IAAMIP對IAA具有較強選擇吸附性，可實現(xiàn)植物提取液中IAA的分離，對于樣品中復(fù)雜植物激素分析具有良好的應(yīng)用前景。

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Synthesis and Adsorption Property of Indole-3-Acetic Acid M olecular Im printed Polymers

GUO Huan-m ing1，ZHAO Ri-m ing1，WANG Jin2，LIN W an-huang1
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.College of Sciences，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

Using indole-3-acetic acid(IAA)as template andmethacrylic acid as functionalmonomer and acetonitrile as porogen，indole-3-acetic acid molecular imprinted polymers(IAA-MIP)that had specific recognition to IAA were synthesized by bulk polymerization.Infrared spectroscopy indicated that IAA was hydrogen bonded in the cavity of the polymers.Adsorption isotherm and Scatchard analysis showed IAA-MIP removed template had higher affinity to IAA than non-imprinted polymers(NIP).There were two binding modes between IAA-MIP and IAA，the dissociation constants were KD1=1.04×10-6mol·L-1and KD2=9.23×10-6mol·L-1，themaximum apparent binding capacity were Bmax1=0.10μmol·g-1and Bmax2=0.28μmol·g-1.Experiments of solid-phase extraction from plant sample solutions showed IAA-MIP removed template had specific adsorption ability for IAA.

indole-3-acetic acid;molecular imprinted polymer;bulk polymerization;solid-phase extraction;adsorption property

O 658

A

1672-5425(2015)02-0036-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.009

國家自然科學基金資助項目(91317312);湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金資助項目(11K032)，湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2012B286)

2014-10-31

郭洹銘(1987-)，男，陜西西安人，碩士研究生，研究方向:植物激素與生長發(fā)育，E-mail:king_cat_guo@163.com;通訊作者:藺萬煌，教授，E-mail:linwhat@163.com。