李國臻，鄭波，郭鈺英，楊志偉，陶林林

(邢臺不孕不育?？漆t(yī)院，河北邢臺054000)

不同時間去除卵丘細胞對短時受精結(jié)果的影響

李國臻，鄭波，郭鈺英，楊志偉，陶林林

(邢臺不孕不育專科醫(yī)院，河北邢臺054000)

目的 探討短時受精技術(shù)進行體外受精(IVF)時，不同時間去除卵丘細胞對短時受精結(jié)果的影響。方法 選擇行IVF助孕的原發(fā)不孕且取卵后本周期移植的患者226例，隨機分為A組119例和 B組107例，A組移植精卵結(jié)合4～6 h后去除卵丘細胞發(fā)育來的胚胎，B組移植精卵結(jié)合4～6 h后保留卵丘細胞發(fā)育來的胚胎。比較兩組的胚胎種植率和妊娠率。結(jié)果 A、B組胚胎種植率分別為36.51%和52.09%，兩組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；妊娠率分別為52.94%和66.35%，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)論 短時受精過程中，在保證患者受精的情況下，將剩余的卵母細胞保留卵丘細胞可以提高胚胎的種植率。

體外受精；去除卵丘細胞時間；種植率

使用短時受精技術(shù)進行體外受精(IVF)時，卵子脫顆粒時間何時為最佳存在爭議。早脫顆?？赡軙黾佣嗑芫剩绊懪咛セ虮磉_與甲基化修飾，影響胚胎質(zhì)量；晚脫顆?？赡軐е律贁?shù)患者受精失敗，失去補救單精子卵胞漿顯微注射(ICSI)的最佳時機[1]。本研究觀察了IVF去除卵丘細胞和保留卵丘細胞發(fā)育來的胚胎的種植率和妊娠率，為短時受精及短時受精早補救ICSI周期移植胚胎的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年6月～2013年11月在我院行IVF短時受精第三天移植的原發(fā)性不孕患者226例，年齡25～35歲，獲卵數(shù)大于10枚。病因為女方原發(fā)不孕并男方精液正?；蜉p度少弱精子癥。將患者隨機分為A組119例和B組107例，A組年齡(28.26±4.34)歲，基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)(5.23±1.65)IU/L；B組年齡(27.85±4.85)歲，基礎(chǔ)FSH(4.95±2.07)IU/L。兩組年齡、基礎(chǔ)FSH具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 受精方法及分組 患者超促排卵，肌注人絨毛膜促性腺激素(hCG)6 000～10 000 U后36～37 h經(jīng)陰道B超取卵，取卵后常規(guī)給予黃體酮(P)肌肉注射80～100 mg/d。取卵后3～4 h進行微滴法授精。每微滴為30～50 μL含5%血清白蛋白的G-IVF，加入10 000～20 000條精子(精液處理均為密度梯度法)，加卵1～2枚。精卵共孵育4～6 h后用巴氏德吸管隨機取出5～10枚卵母細胞，輕輕吹打去除卵丘細胞，置于新鮮培養(yǎng)液微滴中(含5% HSA的G-IVF)中觀察第二極體出現(xiàn)情況(無卵丘細胞)；若>50%的卵母細胞出現(xiàn)第二極體判定受精成功。將剩余的卵母細胞保留卵丘細胞自微滴移出，放入另一新鮮的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)(含5% HSA的G-IVF)。受精后18～20 h(D1天)全部去除卵丘細胞，觀察受精情況，并進行原核評分。根據(jù)移植胚胎來源分組：A組為移植受精后4～6 h去除卵丘細胞發(fā)育來胚胎的患者，B組為移植受精后4～6 h保留卵丘細胞(18～20 h去除卵丘細胞)發(fā)育來胚胎的患者。

1.2.2 胚胎培養(yǎng) 受精卵繼續(xù)培養(yǎng)至72 h觀察發(fā)育情況，并進行胚胎分級。以胚胎細胞數(shù)≥6枚，卵裂球大小較為均勻，碎片≤10%為可用胚胎。于取卵后72 h移植。移植胚胎數(shù)目1～3枚，胚胎移植后給予黃體酮支持黃體。移植后14 d測血hCG，移植28～35 d行B超檢查，發(fā)現(xiàn)孕囊即為臨床妊娠，種植率為B超下可見孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，組間均數(shù)比較采用配對t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組平均獲卵數(shù)、平均移植數(shù)、移植日內(nèi)膜、妊娠率比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，兩組種植率比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 兩組發(fā)育胚胎移植后的結(jié)局比較

注：與B組比較，*P<0.05。

3 討論

Chen等[2]提出，在常規(guī)IVF短時受精后6 h通過剝除卵丘細胞觀察第二極體是否排出可預測受精與否。此后，許多研究表明早補救ICSI能有效預防受精失敗，提高妊娠率，獲得良好的臨床結(jié)局[3～6]。也有學者報道，早期脫顆粒多精受精的比例偏高。其原因可能是：在受精早期，過早脫卵丘細胞的機械操作很可能對卵母細胞造成損傷，特別是透明帶的損傷[4]，可能影響皮質(zhì)反應和透明帶反應，如果造成透明帶上的微小缺口，也會增加多精入卵的機會；卵丘顆粒細胞上的特有成分可降低多精受精率，受精早期去除卵丘細胞會使其微環(huán)境發(fā)生改變，也可能造成增加多精受精的機會。我們在實際工作中發(fā)現(xiàn)，短時受精過程中4～6 h全部去除卵丘細胞多精受精的比例偏高，所以采取部分剝除法(5～10枚)去除卵丘細胞，若大于50%就不再去除卵丘細胞，避免了多精受精的概率，也可以達到早判斷受精結(jié)果的目的，與文獻[7]報道一致。關(guān)于顆粒細胞對后續(xù)胚胎的發(fā)育潛能的影響，以及短時受精早去除卵丘細胞對胚胎基因表達與甲基化修飾的影響、對胚胎發(fā)育潛能和種植率的影響，目前尚無定論。李蕾等[8，9]研究認為，顆粒細胞可以分泌一些對早期胚胎發(fā)育有利的物質(zhì)，如生長因子、糖蛋白等，其可作為共培養(yǎng)細胞促進胚胎的發(fā)育。而且顆粒細胞也可以通過代謝去除胚胎體外微環(huán)境中的不利于胚胎發(fā)育的物質(zhì)，如重金屬二價離子等。Raman等[10]研究認為，卵丘細胞與卵母細胞之間存在的包括縫隙連接在內(nèi)的細胞間復雜的連接機制，對卵泡的發(fā)育及胚胎的質(zhì)量都至關(guān)重要。有研究對常規(guī)IVF(精卵共孵育16～18 h)與短時受精的情況進行比較，發(fā)現(xiàn)短時受精不能提高胚胎利用率和臨床妊娠率[11]，另外一些研究的結(jié)論則相反[10，12]。本研究只比較了短時受精后去除卵丘細胞與保留卵丘細胞所發(fā)育來胚胎的移植后結(jié)局。結(jié)果顯示，移植選擇短時受精后全部為4～6 h去除卵丘細胞發(fā)育來的胚胎與受精后18～20 h去除卵丘細胞發(fā)育來的胚胎的種植率比差異有統(tǒng)計學意義。提示卵母細胞周圍的顆粒細胞不僅與受精有重要關(guān)系，而且對胚胎之后的發(fā)育潛能也具有重要意義，為移植時的胚胎選擇(胚胎評分同等級別的情況下首選保留卵丘細胞的胚胎移植)提供了一個參考。由于例數(shù)所限，本文數(shù)據(jù)顯示雖然保留卵丘細胞組的妊娠率高于無卵丘細胞組，但無統(tǒng)計學差異，需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，在短時受精去除卵丘細胞判斷受精情況時，在能保證正確判斷受精的前提下要盡可能減少數(shù)目。在新鮮移植過程中優(yōu)先選擇沒有去除卵丘細胞發(fā)育來的胚胎，有助于改善輔助生殖的結(jié)局，安全性更高。

[1] 劉素英,曹英,曹翔,等.早期補救ICSI應用價值的初步探討[J].生殖與避孕,2010,30(1):742-745.

[2] Chen C, Kattera S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6h post-insemination in conventianal IVF[J]. Hum Reprod, 2003,18(10):2118-2121.

[3] 宋小兵,張翠蓮,張欽憲,等.不同脫顆粒細胞時間對IVF-ET治療周期的影響[J].當代醫(yī)學,2013,15(21):40-41.

[4] 李宜學,王振榮,郭劍,等.短時受精并即刻脫顆粒細胞在IVF-ET治療中的應用分析[J].中國婦幼保健,2012,27(22):3441-3443.

[5] 王喜良,周敏,白雪,等.短時受精結(jié)合早期補救卵胞漿內(nèi)單精子注射在IVF-ET治療中的應用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(6):103-104.

[6] 胡娟,劉群,任新玲,等.脫顆粒時間對體外受精的胚胎質(zhì)量和臨床結(jié)局的影響[J].武漢大學學報(醫(yī)學版),2011,32(5):661-663.

[7] 金海霞,孫瑩璞,辛志敏,等.保留卵丘細胞對短時受精結(jié)果的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2011,27(21):3879-3880.

[8] 李蕾,李尚為,靳松,等.應用顆粒細胞部分剝除法提高體外受精—胚胎移植后胚胎質(zhì)量及臨床妊娠率的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2003,41(3):201-202.

[9] 趙學明,杜衛(wèi)華,郝海生,等.卵丘細胞在牛卵母細胞體外受精生產(chǎn)胚胎中的作用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2011,19(2):375-380.

[10] Raman RS, Chan PJ, Corselli JU, et al. Comet assay of cumulus cell DNA status and the relationship to oocyte fertilization via intracytoplasmic sperm injection[J]. Hum Repord, 2001,16(5):831-835.

[11] Barraud-Lange V, Sifer C, Pocate K, et al. Short gamete co-incubation during in vitro fertilization decreases the fertilization rate and does not improve embryo quality: a prospective auto controlled study[J]. J Assist Reprod Genet, 2008,25(7):305-310.

[12] 何晶晶,章志國,邢瓊,等.短時受精與傳統(tǒng)受精的臨床應用[J].安徽醫(yī)科大學學報,2011,46(1):76-78.

郭鈺英

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.031

R711.6

B

1002-266X(2015)01-0074-02

2014-01-08)