王惠君，王文泉，盧 誠，王海燕，陳 新

（1.瓊州學(xué)院，海南 三亞572022；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?71101）

中藥艾葉[1]為菊科植物艾（ArtemisiaargyiLevl et Vant）的干燥葉片。艾葉又稱作蘄艾、艾蒿、醫(yī)草、灸草等。其功效早在戰(zhàn)國的醫(yī)書《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有記載。2000多年前，艾葉作為正式藥物記載在陶弘景的《名醫(yī)別錄》中，從此艾葉在中醫(yī)臨床上得到廣泛應(yīng)用。艾葉的入藥成分主要是春、夏的葉片，葉片最好在花未開放、葉片較茂盛時采摘并陰干或曬干較好。中醫(yī)在長期臨床實踐中總結(jié)艾葉性溫、辛、味苦，具有固脫回陽、溫補益、散結(jié)消瘀、行氣活血、驅(qū)逐寒濕、溫經(jīng)通絡(luò)、安胎和止血等功效。艾資源在全球分布較廣泛，采收方便，因而艾具有較高的開發(fā)和利用價值。但艾在各地的質(zhì)量性狀參差不齊，目前仍未滿足大規(guī)模的開發(fā)和利用，因此對于發(fā)掘優(yōu)良艾的種質(zhì)資源用于大規(guī)模人工種植栽培品種尤為迫切。從艾的研究進(jìn)展看，雖在艾葉的有效成分提取分 離[2－5]、鑒定分析技術(shù)[6]和藥理性研究[7－8]方面均取得一定成果，但對于艾資源的各地品種質(zhì)量性狀的多樣性研究仍是空白。

運用現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)分析種質(zhì)材料的親緣關(guān)系和遺傳多樣性可提高艾育種效率。常見的分子標(biāo)記技術(shù)有SSR、RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SRAP、SNP等，通常用于品種鑒定、植物遺傳多樣性、遺傳作圖等方面的研究。其中，ISSR（inter－simple sequence repeat）又稱為簡單重復(fù)序列區(qū)間，是由加拿大Zietkiewicz 等[9]提出，通過利用錨定的SSRDNA 作為引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴增，進(jìn)而檢測相鄰SSR 之間基因組DNA 序列的差異。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，ISSR 分子標(biāo)記不僅信息量大、精確度高，而且多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡單、便于檢測，尤其可在不同的物種間通用，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用在農(nóng)作物、花卉、樹木、中藥材等方面，迄今未見任何分子生物學(xué)技術(shù)用于艾種質(zhì)資源研究的報道。由于ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)是在PCR 擴增反應(yīng)基礎(chǔ)上開發(fā)，因而其反應(yīng)條件也易受眾多因素的干擾，如引物、模板DNA、Mg2＋、dNTPs、Taq酶等濃度均直接影響ISSR－PCR 擴增。因此，為確保ISSR－PCR 擴增結(jié)果的穩(wěn)定和準(zhǔn)確，需對此擴增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。筆者在提取艾基因組DNA 以及單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行L16（45）正交試驗，用以優(yōu)化艾葉反應(yīng)體系，旨在為艾葉藥材分子鑒定、遺傳多樣性研究以及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 中藥艾、試劑與儀器

1.1.1 艾 采自湖北蘄春艾的葉片，采摘后迅速裝入自封袋中置于冰盒，于實驗室－70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、EDTA（乙二胺四乙酸）、EB（溴化乙錠）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、Buffer緩沖液、MgCl2、DL2000（DNA 分 子 標(biāo) 記）、dNTPs、Taq酶（大連寶生物公司）、ISSR 隨機引物（參照哥倫比亞大學(xué)UBC公布的第9套ISSR 引物序列、其序列由上海生物工程有限公司合成）、DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器 恒溫水浴鍋、GILSON 移液槍、超凈工作臺、電子天平、高速冷凍離心機、PCR 擴增儀（Bio－Rad，T1000）、梯 度PCR 儀（Eppendorf）、Gel Doc EQ 凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad，Chemi Doc XRS）、電泳儀和電泳槽（北京六一廠DYY－10C）、紫外分光光度計（ES－2）。

1.2 艾基因組DNA的提取與檢測

艾基因組DNA 的提取分別采用3種方法。即改良CTAB方法[10]、SDS法[11]和試劑盒法。

為保證基因組DNA 提取質(zhì)量，用試劑盒提取的艾基因組DNA 作對比。將提取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠（加入EB 濃度為0.5μg／mL）電泳及核酸檢測儀檢測其純度和濃度，并將提取得到的DNA 樣品稀釋至約50ng，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)體系單因素最優(yōu)設(shè)計

選用純度高的DNA 模板同時參考Zietkiewicz E[9]和劉本英[12]的反應(yīng)條件進(jìn)行引物初篩，初設(shè)定ISSR－PCR 反 應(yīng) 體 系 確 定 為 （20μL）：模 板DNA 25ng，Mg2＋2.5mmol／L，dNTPs 0.25mmol／L，引物0.6μmol／L，10×PCR Buffer緩沖液2.0μL，Taq DNA 聚合酶1.75U。

反應(yīng)的程序預(yù)設(shè)定：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)，72℃最后延伸8 min，產(chǎn)物在4℃保存。首選重復(fù)性好、擴增譜帶清晰的引物用于后續(xù)優(yōu)化試驗。依據(jù)表1中各個因素水平分別探究各因素對ISSR擴增反應(yīng)體系的影響，最后獲得單因素最優(yōu)處理。

表1 PCR 反應(yīng)體系各因素試驗水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of PCR reaction

1.4 PCR反應(yīng)體系正交試驗的最優(yōu)設(shè)計

選用正交設(shè)計L16（45）分別在4個不同水平上試驗（表2）。在PCR 儀上進(jìn)行擴增反應(yīng)，擴增產(chǎn)物選用1.6%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后將膠體放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。試驗結(jié)果參照何正文等[13]的方法分析，對ISSR－PCR 擴增結(jié)果依據(jù)譜帶的強弱和多少進(jìn)行直觀分析評分，分值為1～16。即將16個處理中譜帶數(shù)量最多且清晰度最高，同時背景最干凈的記為最高分值16，與此相反，最差的記最低分值1，最后獲得艾ISSR－PCR 擴增反應(yīng)各因素的最優(yōu)處理。參照穆立薔等[14]方法，根據(jù)分值求出各因素在同一水平上的試驗值之和Ki以及各因素水平上的數(shù)據(jù)平均值ki，并求出同一因素在不同水平之間平均值的方差SS和極差R。將單因素試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果進(jìn)行綜合分析，最后獲得艾ISSR－PCR 擴增的優(yōu)化反應(yīng)體系。

表2 PCR 反應(yīng)的因素水平L16（45）正交試驗設(shè)計Table 2 L16（45）orthogonal design for the factors and levels of PCR reaction

1.5 退火溫度的確定

依據(jù)試驗結(jié)果，將優(yōu)化的反應(yīng)體系在梯度PCR模式下設(shè)定退火溫度為48～54℃，依據(jù)產(chǎn)物結(jié)果數(shù)據(jù)確定最優(yōu)的退火溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾基因組DNA的提取

圖1 3種方法提取基因組DNA的電泳圖片F(xiàn)ig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by three methods

由圖1可見，試劑盒提取的艾基因組DNA，電泳譜帶明亮清晰，上樣孔干凈，無拖尾現(xiàn)象，亦無蛋白質(zhì)和RNA 雜質(zhì)的譜帶，經(jīng)過紫外分光光度計測定OD260和OD280，其OD260／OD280值為1.82，濃度為50～70ng／μL，試劑盒提取的DNA 純度和質(zhì)量均較高；用改良CTAB 法所提取的DNA 樣品清晰明亮，亦無雜質(zhì)譜帶，OD260／OD280值為1.85，濃度為20～50ng／μL，質(zhì)量相對較高，可滿足試驗的質(zhì)量要求；用SDS法提取的DNA 樣品明亮，但存在明顯拖尾，OD260／OD280值為1.92，表明樣品有RNA 污染。從經(jīng)濟方面考慮，選用改良CTAB 法提取艾基因組DNA。

2.2 ISSR－PCR擴增的反應(yīng)條件優(yōu)選

從圖2看出，不同因素影響下ISSR－PCR 擴增反應(yīng)體系的變化情況。結(jié)果表明：

1）Mg2＋濃度。當(dāng)Mg2＋濃度為1.5 mmol／L時，ISSR 擴增出的譜帶比較弱；而濃度為2.0～2.5mmol／L時，均能擴增出比較清晰的譜帶；當(dāng)Mg2＋濃度為3.0mmol／L時，擴增出的譜帶特異性減弱。故宜選取2.0mmol／L 和2.5mmol／L 為Mg2＋的最佳濃度。

2）引物濃度。隨著體系中的引物濃度增加，擴增的譜帶也逐漸增強。在濃度達(dá)1.0μmol／L 時，譜帶的清晰度開始下降，故確定0.6～0.8μmol／L作為引物的最佳濃度。

3）dNTPs 濃度。泳道1、泳道2 可能由于dNTPs濃度比較低，擴增出的譜帶條紋少。當(dāng)濃度在0.20mmol／L以上時得到的譜帶清晰穩(wěn)定，故確定0.20mmol／L作為dNTPs的最佳濃度。

4）模板DNA。經(jīng)電泳分離檢測結(jié)果顯示，各濃度存在差異，當(dāng)模板DNA 的量小于30ng時，擴增的譜帶較為模糊；當(dāng)模板DNA 的量達(dá)到120ng時，擴增條帶清晰明亮，開始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)模板DNA 的量為60～90ng 時，擴增譜帶比較清晰明亮，譜帶的數(shù)量和亮度的強弱基本一致。表明，艾ISSR 反應(yīng)對模板DNA 的濃度要求為60～90ng。為節(jié)約模板DNA 故設(shè)定模板DNA 的濃度為60ng。

5）Taq酶的含量。4 個Taq酶用量處理均可得到譜帶相同的擴增結(jié)果，當(dāng)酶的用量為0.5U 和1.0 U 時擴增出的譜帶稍弱；當(dāng)Taq 酶用量為1.5～2.0U可獲得良好的擴增結(jié)果。從降低試驗成本且保證質(zhì)量的角度考慮，試驗選擇Taq酶的用量為1.0U。

圖2 不同因素條件下ISSR－PCR 反應(yīng)體系的變化Fig.2 ISSR－PCR reaction system variation of different influencing factors

圖3 ISSR－PCR的擴增圖譜Fig.3 Result of orthogonal design PCR products

2.3 ISSR－PCR擴增的評分及最優(yōu)選擇

由圖3可見，ISSR－PCR 的擴增條帶的強弱，直觀分析評分得到1～16條帶的分值分別為1 分、7分、10分、5分、6分、11分、15分、5分、5分、14分、16分、10分、10分、11分、14分和6分。

由表3可知，對艾葉ISSR－PCR 反應(yīng)影響最大的是Mg2＋濃度，而Taq酶濃度的影響最小。此外，利用ki值還可估計各因素的最佳水平，當(dāng)ki值越大，則該水平最佳。因此，其中各因素的最佳水平為Mg2＋2.5mmol／L，引物0.8μmol／L，模板DNA 60 ng，Taq酶2.0 U。由于dNTPs的最大Ki值為2個，對 應(yīng) 的 濃 度 分 別 為 0.15 mmol／L和0.25mmol／L，從成本考慮選擇0.15 mmol／L，考慮Taq酶濃度對此反應(yīng)的影響最小。這一組合在正交表中并未出現(xiàn)，但與分值最高的11號處理接近，僅是模板DNA 量不同?？紤]到節(jié)約成本，Taq酶濃度應(yīng)選1.0U。

表3 ISSR－PCR 擴增的正交設(shè)計直觀分析Table 3 Intuitive analysis of orthogonal design of ISSR－PCR amplification

圖4 最佳體系的ISSR－PCR驗證圖譜Fig.4 The best system of ISSR－PCR

2.4 正交試驗與單因素分析的比較及其驗證

依據(jù)單因素分析最優(yōu)體系（1）為模板DNA 60 ng，Mg2＋2.0 mmol／L，引 物0.6 μmol／L，dNTP 0.2mmol／L，Taq酶1.0U。依據(jù)正交試驗直觀圖得最優(yōu)化體系及為處理11的體系（2）為模板DNA 30 ng，Mg2＋2.5 mmol／L，引 物0.8 μmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，Taq酶2.0U。依據(jù)正交分析結(jié)果 分 析 得 體 系 （3）為 模 板DNA 60 ng，Mg2＋2.5mmol／L，引物0.8μmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，Taq酶1.0U。

對以上3個體系驗證結(jié)果（圖4）表明，3個處理的譜帶相差較小，1處理譜帶清晰度相對弱，2處理與3處理幾乎沒有差別。從成本考慮，選擇3處理為艾葉最佳的ISSR－PCR 反應(yīng)體系。

2.5 PCR退火溫度的選擇

圖5 引物UBC811退火溫度不同的擴增圖譜Fig.5 Results of annealing temperature on ISSR－PCR amplification of UBC811

由圖5 顯示，溫度低時則特異性較差，泳道1～5，譜帶相對較多同時缺失小片段；退火溫度較高時引物與模板的結(jié)合性差，又造成大片段的缺失，泳道9～12，導(dǎo)致PCR 擴增產(chǎn)物譜帶數(shù)減少2 條，同時亮度減弱。因此，UBC811的最佳退火溫度范圍介于第6與第8的溫度之間，因而選定為54℃。

3 結(jié)論與討論

影響艾ISSR－PCR 擴增反應(yīng)效果的主要因素包括模板DNA、Mg2＋、引物濃度、dNTPs、Taq酶及退火溫度設(shè)定等。Mg2＋濃度對ISSR－PCR 擴增反應(yīng)起關(guān)鍵作用。其作為Taq 酶的輔助因子之一，Mg2＋濃度不但對Taq酶的活性有影響，而且還可與反應(yīng)液中的模板DNA、dNTPs及引物相結(jié)合，影響模板DNA 與引物的結(jié)合效率，影響模板DNA 與PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度，影響擴增產(chǎn)物的特異性，影響引物二聚體的形成。引物濃度對PCR 擴增產(chǎn)物的帶型產(chǎn)生較為明顯的影響，如濃度較高產(chǎn)生非特異條帶，濃度較低將不能擴增。dNTPs 作為ISSR－PCR擴增反應(yīng)的原料，其濃度較低將影響合成的效率，甚至因過早的被消耗而使產(chǎn)物單鏈化，直接影響擴增效果；其濃度較高又將導(dǎo)致PCR 錯配率增加，從而使擴增反應(yīng)出現(xiàn)較多的非特異性擴增。ISSR擴增反應(yīng)體系中模板DNA 的純度和含量對擴增產(chǎn)物的特異性及獲得率有直接影響。若模板含量較低，分子之間碰撞的機率也較低，PCR 擴增產(chǎn)物也不穩(wěn)定，甚者不能擴增出產(chǎn)物；若模板含量較高，相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴增。若模板DNA 的純度不高，多糖或RNA 等其他雜質(zhì)阻礙擴增反應(yīng)，使擴增反應(yīng)不穩(wěn)定，增加非特異性產(chǎn)物的擴增。在ISSR－PCR 擴增反應(yīng)中，Taq酶是PCR 擴增的重要影響因素之一。Taq酶用量過少將使酶過早地被消耗而降低產(chǎn)物合成反應(yīng)效率；過多會產(chǎn)生較多的非特異性擴增譜帶使試驗結(jié)果失真，同時還增加試驗成本。ISSR－PCR 擴增反應(yīng)中，退火溫度的高低也直接影響到模板DNA 與引物的特異性結(jié)合。一般情況下，較低的退火溫度可保證模板與引物結(jié)合的穩(wěn)定性，同時盡可能選擇較高的退火溫度，這樣可減少模板DNA 與引物之間的非特異性結(jié)合；對于不同的引物和不同基因組DNA 退火最適溫度也不同。用以上最優(yōu)體系分別對不同引物進(jìn)行梯度退火試驗，在梯度PCR 儀上設(shè)置溫度范圍，將PCR 擴增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳分離檢測。綜合以上2種方法結(jié)果，最終獲得適合艾的ISSR－PCR 最優(yōu)反應(yīng)體系。

試驗結(jié)果表明，在正交試驗中發(fā)現(xiàn)Mg2＋濃度對此反應(yīng)體系的影響較大，這與王彥華[15]、劉曉靜[16]和吳生[17]等研究結(jié)果相符。在單因素試驗中除Taq酶和模板DNA 外，其余3 個因素對ISSRPCR 反應(yīng)體系均有影響。2種方法得各因素的最佳優(yōu)化體系也不盡相同?？傊?，5種主要因素對反應(yīng)體系的影響既獨立又互補。單因素試驗可直觀地顯現(xiàn)出各主要因素對反應(yīng)體系的相對影響，但不能顯現(xiàn)各因素間的交互作用，利用正交設(shè)計可較快地獲得最優(yōu)體系，但對于結(jié)果的主觀性較強，因而缺乏可靠性。在不同的試驗條件下，如不同的試驗儀器、試驗試劑、試驗材料以及操作人員與實驗室環(huán)境條件等，均對擴增結(jié)果產(chǎn)生影響[18]，當(dāng)建立和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系時建議綜合采用上述2種方法。試驗結(jié)果還顯示，對艾ISSR－PCR 的影響依次為Mg2＋濃度＞引物＞模板DNA＞dNTPs濃度＞Taq酶，即艾的ISSR－PCR 分析的最佳擴增體系條件為模板DNA 60ng，Mg2＋2.5mmol／L，引物0.8μmol／L，dNTPs 0.15mmol／L，Taq酶1.0U。經(jīng)反復(fù)試驗，在此優(yōu)化條件下擴增反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定性強且重復(fù)性好。該反應(yīng)體系為ISSR 標(biāo)記技術(shù)開展艾的遺傳圖譜構(gòu)建及其遺傳多樣性分析奠定基礎(chǔ)。

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