李林陽，廖江榮

結(jié)核感染T細胞斑點試驗對塵肺結(jié)核的診斷價值

李林陽，廖江榮

塵肺；結(jié)核

塵肺是由于在職業(yè)活動中長期吸入生產(chǎn)性粉塵并在肺內(nèi)潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病，是我國現(xiàn)階段最主要、最嚴重的職業(yè)病病種[1-2]。肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，是塵肺常見的嚴重合并癥。臨床上把這兩種病變復(fù)合共存的特殊類型單列為塵肺結(jié)核[3]。塵肺結(jié)核患者體內(nèi)的矽塵與結(jié)核菌協(xié)同作用引起復(fù)雜的組織反應(yīng)，使其病理改變、臨床表現(xiàn)與影像學(xué)特點均不同于單純的塵肺或結(jié)核[4]。塵肺結(jié)核在臨床上常被漏診或誤診。傳統(tǒng)的結(jié)核病輔助診斷方法如痰涂片抗酸染色(AFB)、結(jié)核菌素試驗(TST)、結(jié)核抗體檢測等均存在敏感性或特異性方面的不足，而“結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)”作為診斷結(jié)核的金標準，特異性雖高但敏感性低，且培養(yǎng)時間一般為2～8周。結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)為近年來發(fā)展起來的一種診斷結(jié)核性疾病的新方法[5]。本研究將T-SPOT.TB與PPD試驗、TB-Ab檢測、痰A(chǔ)FB等方法進行比較，探討其在塵肺結(jié)核診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2014年4月－2015年2月入住我院呼吸科、臨床診斷疑似塵肺結(jié)核(SCTB)的患者為研究對象。所有患者均進行詳細病史采集，并平行進行T-SPOT.TB、TB-Ab、AFB、TST等檢測。

1.2 診斷標準 根據(jù)臨床癥狀、實驗室檢查結(jié)果及隨訪后最終診斷，將疑似病例分為塵肺結(jié)核組與塵肺組。塵肺診斷標準：依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部塵肺病診斷標準(GBZ70-2009)，由專門的塵肺病診斷專家小組進行確診，并發(fā)放塵肺病鑒定證書。塵肺結(jié)核的診斷標準：(1)臨床診斷：①有結(jié)核接觸病史，近期出現(xiàn)低熱、盜汗、乏力、消瘦等結(jié)核中毒表現(xiàn)；②合并有結(jié)核性胸膜炎；③高千伏X線提示：肺尖或鎖骨下出現(xiàn)不對稱小片狀或斑片狀密度不均陰影，或上肺野迅速出現(xiàn)浸潤病灶；動態(tài)胸片可見原已確診為塵肺的融合團塊短期多變，形成形態(tài)不規(guī)則的較大空洞，伴同側(cè)或?qū)?cè)播散者病變進展快，毀損、破壞等改變嚴重；④常規(guī)抗感染治療2周無效，經(jīng)抗結(jié)核治療后好轉(zhuǎn)，跟蹤隨訪半年，胸片提示病灶明顯吸收，最終確診；(2)實驗室檢查：痰、支氣管鏡刷片、灌洗液結(jié)核分枝桿菌涂片陽性，病理檢查可見結(jié)核典型改變(如干酪樣壞死)。患者HIV抗體均呈陰性，近期無嚴重病毒感染史，無嚴重肝腎衰竭，近期無輸血及PET-CT檢測，無免疫抑制劑用藥史及放化療治療。

1.3 實驗室檢測項目

1.3.1 AFB檢測及結(jié)果判定 按照說明書進行。

1.3.2 PPD試驗 所有入選患者左前臂曲側(cè)中上部1/3處皮下注射5U(0.1ml)人型純蛋白衍生物(purified prote in derivatives，PPD)試劑，實驗后48～72h觀察并記錄結(jié)果，硬結(jié)直徑≥5mm判定為陽性。

1.3.3 結(jié)核抗體檢測 按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 T-SPOT.TB檢測 (1)操作步驟：①采集肝素鋰抗凝的外周血5ml行外周血單個核細胞(PBMC)分離，采用全血模式進行細胞計數(shù)，配制成終濃度為25萬個單個核細胞/100μl的細胞懸液。②在每個樣本的板條上按順序設(shè)置陰性對照、抗原A(早期分泌性靶抗原6，ESAT-6)、抗原B(濾液培養(yǎng)蛋白10，CFP-10)、陽性對照，再按上述順序，在4個孔中分別加入已制備好的終濃度細胞懸液100μl，將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20h，PBS洗4次。③每孔加入50μl新鮮配制的酶標二抗工作液，2～8℃孵育1h，PBS洗4次。④每孔加入50μl顯色液，避光顯色7～12min，蒸餾水終止顯色3～4次，使用濾紙拍板，自然干燥后進行結(jié)果判讀，干燥后的板條可在干燥避光條件下長期保存。(2)結(jié)果判讀：①陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個，且(抗原A孔或抗原B孔斑點數(shù))－(陰性對照孔斑點數(shù))≥6，為“陽性”；②陰性對照孔斑點數(shù)為6～10個，且(抗原A孔或抗原B孔斑點數(shù))≥2×(陰性對照孔斑點數(shù))，為“陽性”；③如不符合上述標準，且陽性對照孔正常時檢測結(jié)果為“陰性”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比、陰性似然比、Youden指數(shù)等，使用U檢驗比較不同檢測方法靈敏度、特異度等診斷效果評價指標的差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

共納入疑似塵肺結(jié)核患者94例，其中男66例，女28例，年齡21～79(48.6)歲。塵肺結(jié)核65例，男43例，女22例，年齡26～79(50.2)歲。支氣管肺泡灌洗液檢出抗酸桿菌者8例，支氣管刷檢檢出抗酸桿菌者6例，痰涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌者4例，經(jīng)皮肺活檢組織病理證實為結(jié)核病者5例，抗結(jié)核治療后臨床癥狀明顯改善且胸片顯示病灶明顯吸收者42例。塵肺29例，男23例，女6例，年齡21～73(48.9)歲，均符合SC診斷標準，經(jīng)抗感染治療后胸片提示病灶吸收。

4種檢測方法對肺結(jié)核的單項檢測結(jié)果見表1，診斷效果見表2。T-SPOT.TB檢測肺結(jié)核的靈敏度顯著高于TB-Ab、PPD試驗和AFB(u=4.925，P<0.001；u=6.156，P<0.001；u=11.637，P<0.001)。T-SPOT.TB檢測肺結(jié)核的特異度顯著高于PPD試驗(u=2.169，P<0.05)，T-SPOT.TB的特異度與TB-Ab、AFB比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(u=1.867，P>0.05；u=1.466，P>0.05)。T-SPOT.TB檢測肺結(jié)核的Youden指數(shù)顯著高于TB-Ab、PPD 和AFB(u=4.306，P<0.001；u=5.130，P<0.001；u=8.218，P<0.001)。T-SPOT.TB對肺結(jié)核的檢出效果明顯優(yōu)于TB-Ab、PPD試驗和AFB。

表1 4種檢測方法結(jié)果比較Tab.1 Comparison of the results of 4 test methods

表2 4種檢測方法診斷效果比較Tab.2 Comparison of the diagnostic effects of 4 test methods

3 討 論

塵肺患者肺內(nèi)沉積著大量難溶性矽塵，使肺部毛細血管床和淋巴系統(tǒng)嚴重受損，肺纖維化破壞了大批巨噬細胞，削弱了巨噬細胞吞噬、消化、殺菌的能力。同時結(jié)核免疫的效應(yīng)細胞也受到影響，使入侵的結(jié)核菌不能被及時消滅而繼續(xù)繁殖、生長、播散，阻礙了結(jié)核獲得性免疫的建立，因此塵肺患者易于合并肺結(jié)核。已知塵肺結(jié)核可促進塵肺病發(fā)展，塵肺又可促進結(jié)核病病情惡化，使塵肺結(jié)核的死亡發(fā)生率顯著增高[6]。因此，盡早確診塵肺結(jié)核對降低患者病死率、延長塵肺患者生命具有重要意義。

PPD是從結(jié)核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，含有超過200種抗原成分，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介苗(bacillus calmette-gurin，BCG)的共同抗原成分，易發(fā)生交叉反應(yīng)，造成較高“假陽性”率。其次，TST對于感染結(jié)核菌2周之內(nèi)、近期免疫受抑制者、重癥患者、年幼兒童及營養(yǎng)不良、器官移植者缺乏足夠靈敏度。本研究PPD試驗敏感性為58.5%，特異性為72.4%。Meta分析指出PPD試驗的診斷敏感性為78.7%～81.6%，特異性為52.4%～57.9%[7]。與本研究數(shù)據(jù)差異較大，主要可能是塵肺患者免疫功能低、全身反應(yīng)弱所致。本研究T-SPOT.TB敏感性為96.9%，特異性為93.1%，與Cho等[8]及高愛忠等[9-11]的研究結(jié)果相近。Piana等[12]認為T-SPOT.TB在免疫抑制患者中有穩(wěn)定的靈敏度和性能。本研究中T-SPOT.TB假陰性率僅為3.08%，而PPD試驗假陰性率41.54%，也說明T-SPOT.TB檢測穩(wěn)定性好，準確率高，受免疫功能影響小。

血清TB-Ab是由機體感染結(jié)核桿菌后針對結(jié)核菌素混合抗原所產(chǎn)生的一組免疫球蛋白。一項Meta分析顯示，抗結(jié)核抗體檢查具有較大的不穩(wěn)定性，各種測試之間差異較大[13]。儲新民等[14]報道TB-Ab對結(jié)核類疾病診斷的敏感性和特異性都遠低于T-SPOT.TB等其他結(jié)核檢測方法。本研究中結(jié)核抗體敏感性66.2%，特異性75.9%，均低于本研究中T-SPOT.TB的敏感性(96.9%)及特異性(93.1%)。

盡管痰涂片抗酸染色簡便、快捷，特異性高，但敏感性較低。大量資料顯示，當痰液中分枝桿菌含量為(1000～10 000)/ml時，其痰涂片陽性率為40%～50%，表明大量涂陰結(jié)核患者未檢出，漏診率較高。本研究中抗酸桿菌試驗敏感性為27.7%，與敏感性為93.1%的T-SPOT.TB比較不具優(yōu)勢。

T-SPOT.TB結(jié)合了酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(即ELISPOT技術(shù))與γ-干擾素釋放試驗，通過檢測受結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應(yīng)T細胞來診斷結(jié)核感染。結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素。本實驗利用ESAT6和CFP10兩種結(jié)核特異性抗原刺激外周血中結(jié)核特異性T淋巴細胞分泌γ-干擾素，通過ELISPOT方法檢測γ-干擾素的釋放水平(即斑點多少)，從而判斷機體是否感染結(jié)核桿菌。ESAT6和CFP10均來自結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)域，且僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群存在RD1區(qū)，因此，該檢測不受卡介苗接種、環(huán)境分枝桿菌感染的影響，特異性強，是目前早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病最有效的檢測手段。本研究中T-SPOT.TB敏感性96.92%，特異性93.10%，與文獻報告相近[8-11]，高于PPD試驗、AFP及TB-Ab檢測。Meier等[15]認為血T-SPOT.TB高陰性預(yù)測值對于排除結(jié)核病有重要價值。有文獻報告免疫抑制狀態(tài)也不影響T-SPOT.TB敏感性，適用于免疫低下、接受免疫抑制劑治療患者結(jié)核感染的檢測[16]。本研究T-SPOT.TB假陽性率為6.9%，低于PPD試驗(27.6%)和TB-Ab(24.1%)，盡管AFP假陽性率為0，但敏感性遠低于T-SPOT.TB。T-SPOT.TB假陰性率3.1%，低于PPD試驗(41.5%)、結(jié)核抗體檢測(33.8%)和AFP(72.3%)。

綜上所述，T-SPOT.TB對診斷塵肺結(jié)核顯示出較好的敏感性、特異性，且假陽性率、假陰性率較低，有臨床診斷價值。但T-SPOT.TB檢測尚不能完全鑒別診斷潛伏性結(jié)核感染與活動性結(jié)核感染，這在結(jié)核發(fā)病率高，潛伏性結(jié)核多的我國，削弱了T-SPOT.TB診斷活動性結(jié)核感染的特異性。盡管如此，T-SPOT.TB還是展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。

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A

0577-7402(2015)08-0683-03

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2015-03-14；

2014-06-29)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

遵義市科技局資助項目(201329)

563000 貴州遵義 貴州航天醫(yī)院肺科(李林陽、廖江榮)

廖江榮，E-mail: ljr3409@sina.com