聶文龍，王曉丹，張玉想

烏司他丁對(duì)膿毒癥晚期大鼠Treg和Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

聶文龍，王曉丹，張玉想

目的觀察烏司他丁對(duì)晚期膿毒癥大鼠脾臟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)以及Treg/Th17比值的影響，探討烏司他丁注射液的免疫調(diào)理作用。方法24只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、生理鹽水治療組(NS組)和烏司他丁治療組(UTI組)，每組8只；采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法建立膿毒癥模型。于術(shù)后24h摘取大鼠脾臟，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟Th17和CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例，計(jì)算Treg/Th17比值，RT-PCR檢測(cè)脾臟中叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)、維甲酸相關(guān)性孤核受體γt(RORγt)mRNA的表達(dá)水平，觀察烏司他丁注射液的干預(yù)效果。結(jié)果NS組CD4+CD25+Treg、Th17細(xì)胞比例明顯高于Sham組(P<0.01)，而UTI組CD4+CD25+Treg、Th17細(xì)胞比例明顯低于NS組(P<0.01)。Sham組與NS組之間Treg/Th17比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，UTI組Treg/Th17比值低于NS組(P<0.01)。NS組Foxp3和RORγt mRNA表達(dá)水平明顯高于UTI組和Sham組(P<0.01)，而后兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論膿毒癥晚期大鼠同時(shí)存在著過度炎癥反應(yīng)和免疫抑制狀態(tài)。烏司他丁注射液能有效減輕晚期膿毒癥大鼠過度的炎癥反應(yīng)和免疫抑制。

膿毒癥；T淋巴細(xì)胞，輔助誘導(dǎo)；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性

膿毒癥的重要致病機(jī)制是機(jī)體對(duì)病原微生物所作出的不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，其發(fā)生并非僅僅與病原體及其所分泌的毒素導(dǎo)致的直接損害有關(guān)，機(jī)體的免疫狀態(tài)變化也起著至關(guān)重要的作用[1]。輔助性T細(xì)胞1(Th1)和輔助性T細(xì)胞2(Th2)是傳統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞亞群，通過細(xì)胞因子產(chǎn)生拮抗作用，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。Th1和Th2的平衡狀態(tài)直接影響著機(jī)體的免疫功能，并與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)了另外兩類新的輔助性T細(xì)胞亞群，即輔助性T細(xì)胞17(Th17)和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)[2-3]。Th17和Treg細(xì)胞都來源于初始T細(xì)胞，兩者的功能和分化過程相互聯(lián)系相互制約，在維持機(jī)體免疫平衡方面發(fā)揮重要作用，是對(duì)Th1/Th2免疫平衡理論的重要補(bǔ)充。Treg細(xì)胞可以影響Th1/Th2/Th17細(xì)胞的極化，并導(dǎo)致淋巴細(xì)胞功能抑制[4]，其免疫抑制作用越來越受到重視。Th17細(xì)胞分泌的特征性的細(xì)胞因子白介素17(IL-17)對(duì)保持黏膜的完整性以及黏膜對(duì)病原微生物的抵抗力有重要作用[5]。

烏司他丁作為一種從尿液中提取的糖蛋白，對(duì)胰蛋白酶、纖溶酶、巰基酶等多種酶具有抑制作用，同時(shí)還可調(diào)節(jié)多種致炎/抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6的分泌水平[6-7]，但對(duì)晚期膿毒癥中Treg和Th17這兩種重要的CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用研究尚少。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，觀察烏司他丁對(duì)晚期膿毒癥大鼠Treg和Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性清潔級(jí)Wistar大鼠24只，體重280～300g(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周，實(shí)驗(yàn)前常規(guī)禁食12h。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、生理鹽水治療組(NS 組)、烏司他丁治療組(UTI組)，每組8只，以術(shù)后24h為觀察時(shí)間點(diǎn)。

1.2 主要試劑及儀器 紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞刺激劑、細(xì)胞染色緩沖液、細(xì)胞破膜固定液、細(xì)胞破膜緩沖液、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記抗大鼠叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)單克隆抗體，PE標(biāo)記大鼠免疫球蛋白G2ak同型對(duì)照劑、PE標(biāo)記抗大鼠白介素-17A(IL-17A)單克隆抗體、別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記抗大鼠CD25單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗大鼠CD4單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。RNA提取試劑(Trizol)、ND-1000核酸定量檢測(cè)儀、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR熒光實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司。注射用烏司他丁(10萬U/支)購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)H19990134)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠膿毒癥模型制作及標(biāo)本制備 采用氯胺酮注射液+速眠新Ⅱ注射液按2:1混合肌內(nèi)注射麻醉大鼠，CLP法復(fù)制膿毒癥模型。消毒、鋪無菌巾，沿腹正中線開1～2cm切口，找到盲腸后在距離其根部1cm處結(jié)扎。以18號(hào)穿刺針貫穿2次盲腸，并留置2條寬0.5cm的橡皮片貫通盲腸，防止針孔閉合。縫合腹壁切口，術(shù)畢立即皮下注射生理鹽水10ml補(bǔ)充術(shù)中丟失液體和抗休克。Sham組只暴露盲腸后縫合，并以生理鹽水復(fù)蘇。UTI組在術(shù)后0.5、8、16h由腹腔注射烏司他丁注射液(10萬U/kg)，NS組經(jīng)腹腔給予等體積生理鹽水，時(shí)相點(diǎn)與UTI組一致。術(shù)后24h處死動(dòng)物，即刻分離出脾組織。取一半脾臟立即放入液氮中保存，另一半放入PBS中以備流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞 在200目尼龍網(wǎng)上研磨脾臟組織，收集研磨后的細(xì)胞，300×g離心5min；加入5ml紅細(xì)胞裂解液裂解5min，300×g離心5min，棄上清；加入5ml PBS混勻，300×g離心5min，棄上清，加入RPMI 1640培養(yǎng)基重復(fù)洗滌細(xì)胞，重懸計(jì)數(shù)，將1×106個(gè)細(xì)胞在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、離子霉素(Ionomysin)以及布雷菲德菌素A(BFA)阻斷劑，刺激培養(yǎng)6h；收集每孔刺激好的細(xì)胞到流式上樣管中，加入2ml細(xì)胞染色緩沖液，300×g離心5min，棄上清；將管底細(xì)胞重懸于100μl細(xì)胞染色緩沖液中，加入細(xì)胞表面染色抗體CD4-FITC，混勻后常溫避光反應(yīng)20min；加入2ml細(xì)胞染色緩沖液，300×g離心5min，棄上清；加入0.5ml細(xì)胞破膜固定液，常溫避光放置30min，300×g離心5min，棄上清；加入2ml染色緩沖液，300×g離心5min，棄上清；加入2ml 1×細(xì)胞破膜緩沖液，300×g離心5min，棄上清；將試管底部細(xì)胞重懸在100μl 1×細(xì)胞破膜緩沖液中，加入適量的胞內(nèi)細(xì)胞因子熒光標(biāo)記抗體IL-17A，混合均勻后，常溫避光反應(yīng)30min；加入2ml 1×破膜緩沖液，300×g離心5min，棄上清；加入0.5ml染色緩沖液重懸細(xì)胞，待上機(jī)分析檢測(cè)Th17占淋巴細(xì)胞比例。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞 直接取計(jì)數(shù)好的細(xì)胞1×106個(gè)(約100μl細(xì)胞懸液)至流式管底部；加入CD4-FITC/CD25-APC表面熒光標(biāo)記抗體，混勻后常溫避光反應(yīng)20min；加入2ml細(xì)胞染色緩沖液，300×g離心5min，棄上清；加入0.5ml Foxp3固定緩沖液，4℃避光放置20min，300×g離心5min，棄上清；加入2ml細(xì)胞染色緩沖液，300×g離心5min，棄上清；加入2ml 1×Foxp3破膜緩沖液，300×g離心5min，棄上清；將試管底部細(xì)胞重懸在100μl 1×Foxp3破膜緩沖液中，加入合適量Foxp3 PE抗體，混合均勻后，常溫避光反應(yīng)30min；加入2ml 1×Foxp3破膜緩沖液，300×g離心5min，棄上清；加入0.5ml細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)分析Treg占淋巴細(xì)胞比例。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time Q-PCR)檢測(cè)脾臟Foxp3、維甲酸相關(guān)性孤核受體γt(RORγt) mRNA表達(dá) 無菌分離約100mg脾組織后勻漿，采用Trizol提取脾臟組織總RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作步驟及方法均參照使用說明書。各目的基因mRNA序列由美國(guó)Invitrogen公司合成提供，引物序列見表1。采用SYBR Green Realtime PCR Kit反應(yīng)試劑盒進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)，95℃變性15s，60℃退火60s，60℃延伸60s，共40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of specific primer pairs

圖1 各組膿毒癥大鼠脾臟內(nèi)Treg(A)和Th17(B)細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Treg (A) and Th17 (B) cells in spleen of sepsis rats (Flow cytometry)

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠大體形態(tài)觀察 Sham組動(dòng)物蘇醒后活動(dòng)情況如常。NS組大鼠術(shù)后蘇醒延遲，10h左右出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、呼吸急促、鼻孔血性分泌物增多，剖腹可見有渾濁膿血性滲出液，部分盲腸末端發(fā)黑壞死，有惡臭味。UTI組大鼠術(shù)后表現(xiàn)較NS組輕。

2.2 各組大鼠脾臟中Treg和Th17細(xì)胞比例及Treg/ Th17比值比較 與Sham組比較，NS組Treg、Th17細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例明顯升高(P<0.01)，UTI組Treg、Th17細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例與NS組比較明顯下降(P<0.01)。NS組Treg/Th17比值與Sham組比較無明顯差異(P>0.05)，UTI組Treg/Th17比值與其他兩組比較明顯降低(P<0.05，表2，圖1)。

表2 CLP術(shù)后大鼠脾臟Treg、Th17比例及Treg/Th17比值比較(%，±s，n=8)Tab.2 Expression of Treg, Th17 and Treg/Th17 in spleen of sepsis rats after CLP (%,±s,n=8)

表2 CLP術(shù)后大鼠脾臟Treg、Th17比例及Treg/Th17比值比較(%，±s，n=8)Tab.2 Expression of Treg, Th17 and Treg/Th17 in spleen of sepsis rats after CLP (%,±s,n=8)

(1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with sham group, (3)P<0.01 compared with NS group

Index Sham group NS group UTI group Treg 1.11±0.24 6.53±1.56(2) 0.99±0.80(3)Th17 0.98±0.47 4.68±0.95(2) 1.33±0.80(3)Treg/Th17 1.23±0.35 1.41±0.31 0.75±0.55(1)(3)

2.3 脾臟Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)變化及烏司他丁干預(yù)的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NS組Foxp3 mRNA表達(dá)水平最高(P<0.01)，而UTI組Foxp3 mRNA表達(dá)與Sham組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NS組RORγt mRNA表達(dá)明顯高于Sham組和UTI組(P<0.01)，而后兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表3 CLP術(shù)后大鼠脾臟Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)水平比較(±s，n=8)Tab.3 Expression of Foxp3 and RORγt mRNA in spleen of sepsis rats after CLP (±s,n=8)

表3 CLP術(shù)后大鼠脾臟Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)水平比較(±s，n=8)Tab.3 Expression of Foxp3 and RORγt mRNA in spleen of sepsis rats after CLP (±s,n=8)

(1)P<0.01 compared with sham group, (2)P<0.01 compared with NS group

Index Sham group NS group UTI group Foxp3 0.85±0.14 3.26±0.32(1) 1.10±0.34(2)RORγt 0.87±0.11 2.78±0.38(1) 0.95±0.22(2)

3 討 論

膿毒癥常繼發(fā)于各種重度創(chuàng)傷、嚴(yán)重?zé)齻?、大手術(shù)，盡管積極的抗生素治療和充分的液體復(fù)蘇在一定程度上改善了其預(yù)后，但其死亡率仍然在30%左右[8]。在膿毒癥早期，感染激活了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)以及隨后代償性的抗炎反應(yīng)，后期則不可避免地導(dǎo)致免疫功能紊亂。導(dǎo)致膿毒癥后期難以控制的感染的病原微生物常常是機(jī)會(huì)性致病菌，這實(shí)際上是機(jī)體免疫功能崩潰的反映，僅僅寄希望于單一使用抗生素是難以控制感染的。因此，對(duì)膿毒癥所導(dǎo)致的免疫紊亂的研究尤為重要。

Th17細(xì)胞是以分泌IL-17為特征的T細(xì)胞，可分泌多種重要的細(xì)胞因子，如IL-17和IL-21[6]。Th17細(xì)胞是最早參與抗感染免疫的效應(yīng)性T細(xì)胞，可以有效地招募中性粒細(xì)胞并且使其激活而發(fā)揮作用[9]，在抵御致病細(xì)菌感染(尤其是與大量病原體直接接觸的腸道、呼吸道黏膜感染)中發(fā)揮著重要作用。因此，Th17細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例及其功能在很大程度上決定了機(jī)體清除病原體的能力。然而隨著病情的進(jìn)展，Th17細(xì)胞比例和IL-17分泌水平的增高也可能意味著更為嚴(yán)重的病情和更高的死亡率[10-11]。Treg細(xì)胞作為一種具備負(fù)向免疫調(diào)節(jié)能力的CD4+T細(xì)胞亞群，其特異性轉(zhuǎn)錄因子為Foxp3。Treg細(xì)胞的免疫抑制功能也在很大程度上依賴于Foxp3持續(xù)的高表達(dá)[12]。在膿毒癥患者外周血中，Treg細(xì)胞的表達(dá)情況與APACHEⅡ評(píng)分和血乳酸水平呈正相關(guān)[10]，Treg細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)能夠抑制效應(yīng)性CD4+和CD8+細(xì)胞的活化及增殖，而CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)量和功能的下降可能意味著不良的預(yù)后結(jié)果[13]。

近年有研究表明，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Treg、Th17主要通過接觸機(jī)制及釋放炎癥介質(zhì)分別起到抗炎及促炎作用，其作用互相依賴、互相抑制，維持平衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)以24h為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，使大鼠處于低血糖、低胰島素、低血流動(dòng)力學(xué)循環(huán)的狀態(tài)，同時(shí)存在明顯的高乳酸分泌，以此復(fù)制晚期膿毒癥模型[14]。目前的理論認(rèn)為膿毒癥發(fā)生后機(jī)體立即啟動(dòng)了促炎與抗炎的雙重機(jī)制，但是在病程的初期以過度的炎癥反應(yīng)為特點(diǎn)，隨后免疫抑制又成為更為棘手且具有代表性的問題[1,15]。本研究結(jié)果顯示，NS組大鼠的Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例均高于Sham組，而Treg/Th17比值在NS組和Sham組無明顯差異，說明處于膿毒癥晚期的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在免疫功能受到嚴(yán)重抑制的同時(shí)，也并存著強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，兩者交織存在。分析其原因，我們發(fā)現(xiàn)NS組脾臟中RORγt 的mRNA含量增加，表明Th17細(xì)胞的生成增加，抗感染免疫反應(yīng)及清除病原體的能力增強(qiáng)，機(jī)體在發(fā)生亢進(jìn)的炎癥反應(yīng)的同時(shí)也出現(xiàn)了不可避免的嚴(yán)重的抗炎反應(yīng)。NS組Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯高于Sham組，表明膿毒癥時(shí)機(jī)體內(nèi)Treg細(xì)胞的生成明顯增加。Treg細(xì)胞的增多會(huì)使淋巴細(xì)胞增殖下降，是患者最終陷入免疫麻痹的一個(gè)重要機(jī)制。同時(shí)，異常增加的Treg細(xì)胞可以通過細(xì)胞接觸機(jī)制和釋放細(xì)胞因子作用于效應(yīng)T細(xì)胞，同時(shí)也使Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞漂移，最終使機(jī)體陷入嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)。

UTI可以起到清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)過度釋放的作用[16]，并且可以提高淋巴細(xì)胞的功能，改善機(jī)體的免疫狀態(tài)[17]。UTI組脾臟中的Foxp3 mRNA和Treg細(xì)胞比例相較于NS組均下降，說明UTI可以使Treg細(xì)胞生成量以及占淋巴細(xì)胞比例均降低，體內(nèi)的免疫衰竭狀態(tài)得以有效緩解。而UTI 組RORγt mRNA表達(dá)水平和Th17細(xì)胞比例均較NS組降低，也說明該組中Th17細(xì)胞生成量下降。但是，僅僅Th17細(xì)胞比例下降并不能說明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物此時(shí)所處的確切的免疫狀態(tài)[10,18]，Teg/Th17比值下降與Th17細(xì)胞比例下降的雙重現(xiàn)象反映出烏司他丁使機(jī)體處于促炎反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的狀態(tài)，既有利于病原微生物的清除，又可減輕過度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷[18]。上述結(jié)果表明，烏司他丁在緩解免疫抑制狀態(tài)的同時(shí)可抑制過度的炎癥反應(yīng)，具有雙相調(diào)節(jié)作用。

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Regulatory effect of ulinastatin on Treg and Th17 cells of rats in late stage of sepsis

NIE Wen-long1, WANG Xiao-dan1, ZHANG Yu-xiang2*1Hebei North University, Zhangjiakou, Hebei 075000, China
2Department of ICU, 309 Hospital of PLA, Beijing 100091, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: 15810550308@163.com

, E-mail: 15810550308@163.com
This work was supported by the Research Funding of Tianpu (UF201320)

ObjectiveTo investigate the expression levels of helper T cells 17 (Th17), regulatory T cells CD4+CD25+(Treg) and Treg/Th17 in spleen of rats in late stage of sepsis, and to explore the significance and evaluate the regulatory effects of ulinastatin injection on their expression.MethodsTwenty-four Wistar rats were randomly divided into the sham group (n=8), normal saline (NS) group (n=8) and ulinastatin (UTI) group (n=8). The sepsis model was reproduced by cecum ligation and puncture (CLP). The spleens of the rats were harvested 24h after the operation. The expression levels of Th17 and CD4+CD25+Treg in spleen tissue were detected by flow cytometry, and Treg/Th17 was calculated after the examination. Expression levels of forkhead transcription factor p3 (Foxp3) and retinoid-related orphan nuclear receptor γt (RORγt) mRNA in spleen tissue were quantified by RT-PCR. The effects of ulinastatin on the animals were evaluated.ResultsThe expression levels of CD4+CD25+Treg and Th17 cells were significantly higher in NS group than in sham group and UTI group (P<0.01). No statistical difference was found in the ratio of Treg/Th17 between sham group and NS group (P>0.05), but the ratio of Treg/Th17 was lower in UTI group than in NS group (P<0.01). The expression levels of Foxp3 and the RORγt mRNA were obvious higher in NS group than in both sham and UTI groups (P<0.01). The expression levels of Foxp3 and the RORγt mRNA showed no statistical difference between sham group and UTI group (P>0.05).ConclusionExcessive inflammatory response and immune suppression status simultaneously exist in the rats with late stage sepsis, and ulinastatin may effectively relieve the excessive inflammatory response and immune suppression status.

sepsis; T-lymphocytes, helper-inducer; T-lymphocytes, regulatory

R631

A

0577-7402(2015)11-0892-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.07

2015-04-18；

2015-07-19)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

天普研究基金(UF201320)

聶文龍，碩士研究生。主要從事膿毒癥免疫功能紊亂機(jī)制方面的研究

075000 河北張家口 河北北方學(xué)院(聶文龍、王曉丹)；100091 北京 解放軍309醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(張玉想)

張玉想，E-mail: 15810550308@163.com