王東勝 呂 燕 王 興

對于采用骨粉、骨支架材料修復(fù)骨缺損，以及觀察人工種植牙修復(fù)結(jié)果的研究中，不脫鈣骨磨片技術(shù)是必要的檢測手段。此方法自上世紀(jì)80 年代以來，得到了廣泛的應(yīng)用。本實驗室自上世紀(jì)九十年代開始利用此項技術(shù)，經(jīng)過不斷的探索，已應(yīng)用于各類骨缺損修復(fù)的實驗研究，以及人工種植牙與骨結(jié)合的研究中[1]。

但在我們應(yīng)用的過程中發(fā)現(xiàn)，許多實驗者對于采用不脫鈣骨磨片的具體應(yīng)用范圍還不明確，特別是制成磨片后采用哪種染色方法可以得到較理想的實驗觀測結(jié)果，了解就更少。文獻對此類問題也無較全面闡述。針對于此，我們對在本實驗室2010年-2015 年所制作的100 張磨片中，對其所應(yīng)用的修復(fù)材料以及采用的染色方法進行了對比分析，就不同的實驗?zāi)康?、材料，?yīng)該采用哪種染色方法進行了研究，以期對于此類研究者在染色方法的選擇上提供參考。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)備及材料 EXAKT 300 CP 骨組織切割機(EXAKT 公司，德國)；EXAKT 400 CS/AW 骨組織磨片機(EXAKT 公司，德國)；EXAKT E520 光固化包埋機(EXAKT 公司，德國)；K320磨盤紙(EXAKT 公司，德國)；P800 磨盤紙(EXAKT 公司，德國)；K1200 磨盤紙(EXAKT 公司，德國)；K4000 磨盤紙(EXAKT 公司，德國)。

1.1.2 標(biāo)本 比格犬，兔，大鼠的下頜骨、股骨等骨缺損術(shù)后，或人工種植體植入后。實驗方法為選取在本實驗室制作磨片中分別采用納米羥基磷灰石復(fù)合材料修復(fù)骨缺損，β-磷酸三鈣支架材料修復(fù)骨缺損，Bio-oss 骨粉修復(fù)骨缺損，帶人工種植牙骨組織等多種實驗的標(biāo)本。

1.1.3 試劑 甲苯胺藍染色液；亞甲基藍-酸性品紅染色液；Goldner’s 三色法染色液。

1.2 方法

1.2.1 組織取材與處理 組織采用EXAKT 300CP 骨組織切割機將骨組織修切成小塊，采用中性福爾馬林固定。

1.2.2 組織脫水與包埋 取分切后的組織塊經(jīng)梯度酒精脫水，氯仿透明，三次浸潤液浸泡，最后用EXAKT E520 光固化包埋機包埋[2]。

1.2.3 切割與磨片 采用EXAKT 300 CP 骨組織切割機將骨組織包埋塊切為200μm 厚的薄切片，再用EXAKT 400 CS/ AW 骨組織磨片機，經(jīng)K320、P800、K1200、K4000 等不同目數(shù)的磨盤紙打磨切片，最終磨成25-30μm 厚的磨片。

1.2.4 染色 主要采用Goldner’s 三色法[1，3]、甲苯胺藍[4]和亞甲基藍-酸性品紅[1，5]等三種特殊染色法進行染色。每張磨片只能使用一種染色方法，具體采用哪種方法染色，根據(jù)實驗?zāi)康膩泶_定。

1.2.5 鏡下觀察 選取按以上方法處理的磨片，在正置顯微鏡下觀察對比不同染色方法的適用范圍。

2. 結(jié)果

2.1 帶有Bio-oss 骨粉的骨磨片染色 觀察帶有Bio-oss 骨粉修復(fù)骨缺損組織磨片的三種染色方法，染色結(jié)果對比，以甲苯胺藍法染色法為最佳(見圖1)。

圖1 利用Bio-oss 骨粉修復(fù)骨缺損后磨片三種染色(100 倍)

2.2 采用β-磷酸三鈣支架材料修復(fù)骨缺損的染色 結(jié)果顯示Goldner’s 三色法染色可以更清晰的觀察新生骨生成的層次與過程，同時若輔助以亞甲基藍-酸性品紅染色法，能更全面的得到實驗結(jié)果(見圖2-1，2-2，2-3)。

圖2-1 β-磷酸三鈣支架材料修復(fù)骨缺損磨片三種方法染色(40 倍)

圖2-2 β-磷酸三鈣支架材料修復(fù)骨缺損磨片三種方法染色(100 倍)

圖2-3 β-磷酸三鈣支架材料修復(fù)骨缺損磨片三種方法染色(200 倍)

2.3 采用羥基磷灰石復(fù)合材料修復(fù)骨缺損成骨實驗的染色結(jié)果 顯示對于類似于這種細顆粒多層支架修復(fù)材料來說，成骨是大面積散在的，染色方法應(yīng)能清晰準(zhǔn)確的顯示結(jié)果，比較后發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍-酸性品紅染色法較適合于此類研究(見圖3-1，3-2)。

圖3-1 羥基磷灰石復(fù)合材料修復(fù)骨缺損磨片三種方法染色(40 倍)

圖3-2 羥基磷灰石復(fù)合材料修復(fù)骨缺損磨片三種方法染色(100 倍)

2.4 顯示新骨形成的骨磨片染色 通過對比亞甲基藍-酸性品紅染色法和甲苯胺藍等兩種染色方法，以甲苯胺藍法為最好，新生骨和成熟骨界限清楚，對比明顯(見圖4)。

圖4 顯示區(qū)分新生骨與成熟骨的染色方法

2.5 觀察種植體骨結(jié)合人工種植體植入實驗的染色 結(jié)果顯示，亞甲基藍-酸性品紅染色法能更清晰地反映種植體與骨結(jié)合的邊界和數(shù)量，更有利于計算成骨面積(見圖5)。

圖5 顯示種植體骨結(jié)合的染色方法

2.6 同時觀察軟組織及骨的骨磨片染色 結(jié)果表明亞甲基藍-酸性品紅染色法能清晰的顯示粘膜、纖維及骨組織(見圖6)。

圖6 同時觀察軟組織及骨組織的磨片染色方法

3. 討論

對于人工種植牙、帶熒光標(biāo)記的骨組織、陶瓷材料以及β-磷酸三鈣等材料進行骨缺損修復(fù)實驗的標(biāo)本，因其材料的特殊性，不脫鈣骨組織磨片是必要的研究手段。在成功制作好骨磨片后，究竟選擇哪種或哪幾種染色方法來顯示實驗結(jié)果成為一個關(guān)鍵問題。

本實驗室在近20 年的實驗研究中，特別是近幾年來，采用德國EXAKT 公司生產(chǎn)的切磨系統(tǒng)制作骨組織磨片后，對制作好的磨片選擇哪種染色方法進行了深入的研究。從各種材料的染色結(jié)果中可以看出，不同的實驗，因其實驗?zāi)康牡牟煌x擇材料的不同，實驗終結(jié)時反映在組織上的結(jié)果也是不同的。

對于骨缺損修復(fù)支架材料來說，比較常用的基礎(chǔ)材料是Bio-oss 骨粉，β-磷酸三鈣，羥基磷灰石，只是實驗者對其進行一些改性或添加一些復(fù)合物，以提高其成骨的效能[6，7]。

Bio-oss 骨粉是口腔科臨床常用的成骨材料，作為實驗的陽性對照材料來使用，其成骨過程是材料不斷降解新骨不斷生成，新骨將材料包圍最終全部轉(zhuǎn)化為骨組織。從圖1 中可以看到，Goldner’s三色法、甲苯胺藍和亞甲基藍-酸性品紅等三種染色法的染色結(jié)果，亞甲基藍-酸性品紅染色后，新生的骨組織包圍著骨粉，但新生骨的成骨過程不如甲苯胺藍法更清楚，Goldner’s 三色法材料與新骨的顏色有些接近，且骨細胞顯示不如以上兩種明顯。通過對比后可以看出對于使用Bio-oss 骨粉修復(fù)骨缺損的實驗，甲苯胺藍法染色結(jié)果最能達到實驗的效果，可以觀察到材料降解，以及新骨是如何形成的等多種結(jié)果。如經(jīng)費允許，還可以再輔以亞甲基藍-酸性品紅染色，但不建議采用三色法。

β-磷酸三鈣也是口腔、骨科和整形外科常用的骨缺損修復(fù)材料[8]，從圖2-1 到2-3 不同放大比例結(jié)果來看，Goldner’s 三色法的顯示結(jié)果是，礦化骨和膠原：藍色；類骨質(zhì)：紅色；胞質(zhì)：橙色。是三種染色法中最能反映采用β-磷酸三鈣支架材料后，骨形成與修復(fù)過程的染色方法，從圖中可以清楚的顯示骨形成的層次和順序。但因三色法骨細胞為桔紅色，不清晰，最好再輔以亞甲基藍-酸性品紅染色，其紅色骨與藍色的成骨細胞和破骨細胞對比明顯。

羥基磷灰石是使用歷史比較長的骨修復(fù)支架材料，現(xiàn)在所使用的多是在原有基礎(chǔ)上的改性或添加骨生長因子的復(fù)合材料[9]。從圖3 中可以看出對于類似這種顆粒層狀支架材料來說，其成骨是以散在的片狀形式出現(xiàn)，新骨包繞材料生長。三種染色對比發(fā)現(xiàn)，亞甲基藍-酸性品紅染色法效果最好，甲苯胺藍法中材料與新骨對比更明顯。在此類研究中，這兩種染色方法可以對照來使用。

對于支架材料植入后新骨是否生長，生成了多少新生骨，從圖4 的甲苯胺藍法中可以清楚的看到新生骨與成熟骨的邊界，但亞甲基藍-酸性品紅染色法則界限不清。對于人工種植體植入后，種植體與骨結(jié)合的情況及面積測量，從圖5 中可以清楚的看到，亞甲基藍-酸性品紅染色法更有優(yōu)勢，在僅是觀察種植體骨結(jié)合的實驗中，建議采用此種染色法。在有些種植體植入實驗中，同時要觀察軟組織及骨組織時，比如牙齦組織、粘膜、纖維等。從圖6 中也可以看到，亞甲基藍-酸性品紅染色法能清晰的觀察粘膜、纖維和牙齦組織，其他兩種方法比較模糊，不適合此種研究。

[1] 王東勝，劉洪臣.帶種植體骨磨片技術(shù)[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，7(6)：360-362

[2] 王東勝，路正剛. 種植體骨界面組織形態(tài)學(xué)研究方法探討[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，3(3)：142-144

[3] Cruber Helen E. Adaptation of Goldner’s Masson Trichrome stain for the study of undecalcified plastic embedded bone[J].Biotechnic Histochemistry， 1992，67(1)30-34

[4] 廖二元，譚利華. 代謝性骨病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：279-283

[5] Doneth K， Breuner G. A method for the study of undecadcified bones and teeth with attached tissues-The sige-Schliff technique[J]. J Oral Pathol，1982，11:318-326

[6] 趙 錚，趙春雨.骨組織工程應(yīng)用于口腔頜面部骨組織缺損修復(fù)研究進展[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2015，29(9)：77-79

[7] 張朕坡，張正文.組織工程骨修復(fù)下頜骨缺損研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志，2015，29(10)：949-951

[8] 劉星綱，鄧旭亮，鄒 超，等.多孔β-磷酸三鈣/ 膠原支架修復(fù)兔下頜牙槽骨缺損的實驗研究[J]. 北京口腔醫(yī)學(xué)，2014，22(1)：1-3

[9] 方依婷，曾 艷，張星宇，等.兩種羥基磷灰石成骨能力的對比研究[J].解剖學(xué)研究，2015，37(4)：268-269