徐偉，樓欽欽，魏無(wú)際,*，秦占芬

1. 南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210009 2. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

雌二醇短期暴露對(duì)非洲爪蟾性腺和輸卵管形態(tài)及性二態(tài)基因表達(dá)影響的初步研究

徐偉1，樓欽欽2，魏無(wú)際1,*，秦占芬2

1. 南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210009 2. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

環(huán)境雌激素對(duì)兩棲動(dòng)物的生殖內(nèi)分泌干擾作用已引起關(guān)注，目前的研究主要集中在長(zhǎng)期暴露對(duì)性腺分化和發(fā)育的影響。以雌二醇(E2，10 nmol·L-1)為模式化合物，以非洲爪蟾為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，6月齡的幼蛙暴露6 d，研究雌激素對(duì)性腺和輸卵管形態(tài)以及性二態(tài)性基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 d的E2暴露對(duì)精巢和卵巢的形態(tài)沒(méi)有明顯影響，但從組織學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看對(duì)卵和精子的發(fā)育有微弱的促進(jìn)作用。E2能夠明顯地促進(jìn)了雌性輸卵管的發(fā)育，表現(xiàn)為輸卵管變粗變彎曲。E2暴露顯著抑制精巢和卵巢中性激素合成相關(guān)基因cyp11a1、3βHSD、Srd5α、ARO的表達(dá)，對(duì)cyp17的表達(dá)無(wú)影響，使腦中LHβ和FSHβ的表達(dá)下調(diào)；對(duì)性別分化和性腺發(fā)育相關(guān)基因Dax、AR、ERα、TFⅢA、TBPL2的表達(dá)均無(wú)影響，但能夠促進(jìn)卵巢中Sox3的表達(dá)；同時(shí)促進(jìn)腦中Emi2的表達(dá)，抑制腦中Dmrt1的表達(dá)。因此，輸卵管可作為敏感的形態(tài)指標(biāo)，性腺中Srd5α、cyp11a1、3βHSD、ARO、Sox3和腦中LHβ、FSHβ、Dmrt1、Emi2可作為分子指標(biāo)。以上結(jié)果可為后續(xù)建立評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)兩棲動(dòng)物雌激素效應(yīng)的短期試驗(yàn)方法提供參考。

磁二醇；非洲爪蟾；雌激素效應(yīng)；輸卵管；性腺；性二態(tài)基因

大量研究顯示，環(huán)境雌激素類物質(zhì)廣泛存在于水體當(dāng)中[1-4]。這些環(huán)境雌激素對(duì)水生生物尤其魚(yú)類的生殖系統(tǒng)發(fā)育和生殖功能的影響已有大量報(bào)道[5-9]。與魚(yú)類相似，兩棲動(dòng)物的幼體在水中發(fā)育，成體也不能脫離對(duì)水環(huán)境的依賴。尤其有文獻(xiàn)證實(shí)，一些兩棲動(dòng)物種的性腺分化對(duì)雌激素敏感，在雌激素類物質(zhì)的誘導(dǎo)下可出現(xiàn)從雄到雌的逆轉(zhuǎn)或者雌雄兩性[10-14]。因此，環(huán)境雌激素對(duì)兩棲動(dòng)物的生殖內(nèi)分泌干擾作用受到關(guān)注。

目前有關(guān)環(huán)境雌激素對(duì)兩棲動(dòng)物生殖內(nèi)分泌干擾作用的研究，主要集中在長(zhǎng)期暴露對(duì)性腺分化和發(fā)育的影響。Hayes等[10]報(bào)道非洲爪蟾暴露低劑量阿特拉津46 d可導(dǎo)致雄性體內(nèi)睪酮水平顯著下降，并出現(xiàn)雌雄兩性個(gè)體。樹(shù)蛙暴露雌二醇108 d導(dǎo)致性別比顯著偏向雌性，出現(xiàn)間性個(gè)體，并促進(jìn)肝臟中vtg2、hdlbp、dhcr7等基因表達(dá)[14]。長(zhǎng)期暴露研究雖然能夠較為真實(shí)地揭示環(huán)境暴露的負(fù)面效應(yīng)，但是存在研究周期長(zhǎng)、耗時(shí)耗力等缺點(diǎn)。所以探索短期暴露的研究方法，尋找相對(duì)敏感的終點(diǎn)指標(biāo)，對(duì)于高效快速地評(píng)價(jià)環(huán)境雌激素對(duì)兩棲動(dòng)物的生殖內(nèi)分泌干擾作用具有重要的意義。

基于此，本文選擇對(duì)雌激素敏感的非洲爪蟾(Xenopus laevis)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以典型雌激素E2為模式化合物，研究雌激素對(duì)性腺和輸卵管形態(tài)以及性二態(tài)性基因表達(dá)的影響，篩選對(duì)雌激素敏感的終點(diǎn)指標(biāo)，為后續(xù)建立評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)兩棲動(dòng)物雌激素效應(yīng)的短期試驗(yàn)方法提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：離心機(jī)(5415R，Eppendorf Centrifuge)、組織碾磨儀(MM301，Retsch)、超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(ND-1000，Nanodrop)、熒光定量 PCR 儀(Lightcycler 480，Roche)、石蠟切片機(jī)(2135，Leica)、體式顯微鏡(XTL0745，重慶光電儀器有限公司)、數(shù)碼相機(jī)(COOLPIX995，尼康)。

試劑：MS-222、E2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，動(dòng)物飼料購(gòu)自香港Totoro Supplies公司，Trizol、 FastQuant RT Kit試劑盒、RNase-free H2O、SYBR Green Mix試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，異丙醇、乙醇、苦味酸、甲醛、冰醋酸、二甲苯、氯仿均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，熒光定量PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和短期暴露

本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的非洲爪蟾，雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)于盛有除氯水的玻璃缸中，水溫(22±2)℃, 明暗光周期為12 h:12 h。每日喂食1次面包蟲(chóng)，每周喂食2次1:1配比的豬肝和動(dòng)物飼料，喂食2 h后換水。

暴露實(shí)驗(yàn)選取個(gè)體發(fā)育一致且活躍的非洲爪蟾(變態(tài)后6個(gè)月)雌雄各5只，20 L玻璃缸中加18 L除氯水，暴露10 nmol·L-1E2，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。暴露6 d，每天喂食面包蟲(chóng)，喂食2 h后換水，換水后重新加藥以維持暴露濃度。

1.3 取樣

6 d暴露結(jié)束后，用MS-222麻醉非洲爪蟾，稱量體重，冰上解剖。取腦及部分性腺，液氮凍存，用于性二態(tài)基因表達(dá)分析；另取部分性腺浸入Bouin氏固定液，用于組織學(xué)結(jié)構(gòu)檢測(cè)；取腎臟(兩側(cè)附著輸卵管)浸入Bouin氏固定液，于體式顯微鏡下觀察輸卵管形態(tài)并照相。

1.4 性腺和輸卵管形態(tài)學(xué)和組織學(xué)檢查

腎臟(附著輸卵管)經(jīng)Bouin氏固定液固定2 h后取出，于體視顯微鏡下觀察輸卵管形態(tài)并照相。

性腺在Bouin氏固定液中固定過(guò)夜，取出，于體視顯微鏡下觀察形態(tài)并照相。隨后進(jìn)行組織學(xué)切片分析：流動(dòng)水沖水后梯度酒精(70%、80%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)切片，切片厚度6 μm，蘇木素、伊紅染色后樹(shù)膠封固，在顯微鏡下觀察并照相。

1.5 性二態(tài)基因表達(dá)分析(qRT-PCR)

腦、性腺組織勻漿后用Trizol提取總RNA，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及質(zhì)量，保證吸光度A260 nm/A280 nm在1.8～2.0，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度。 1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，操作根據(jù)FastQuant RT Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后合成的cDNA產(chǎn)物保存于-20℃用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室積累的研究數(shù)據(jù)，選擇5個(gè)性激素合成轉(zhuǎn)化相關(guān)基因(Srd5α、cyp11a1、3βHSD、cyp17、ARO)、3個(gè)性激素合成調(diào)控基因(GnRH、LHβ、FSHβ)以及8個(gè)性別分化和性腺發(fā)育相關(guān)基因(AR、ERα、Dmrt1、Dax、Emi2、TFⅢA、TBPL2、Sox3)作為候選基因，通過(guò)研究這些基因表達(dá)對(duì)E2的響應(yīng)，篩選對(duì)其敏感的基因。使用 Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1。qPCR根據(jù)SYBR Green Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法處理，內(nèi)參基因?yàn)閞pl8。

1.6 數(shù)據(jù)分析

腦和性腺中基因的表達(dá)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，E2處理組與對(duì)照組之間的顯著性差異用獨(dú)立T檢驗(yàn)分析(*表示 p<0.05)，圖形采用Origin 6.0軟件繪制。

表1 熒光定量PCR引物信息

2 結(jié)果(Results)

2.1 E2暴露對(duì)性腺和輸卵管組織形態(tài)的影響

E2暴露對(duì)精巢和卵巢的整體形態(tài)沒(méi)有明顯影響，但從組織學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)看，一定程度上促進(jìn)了精子和卵的發(fā)育。由精巢組織學(xué)觀察結(jié)果可見(jiàn)，正常的非洲爪蟾精巢(圖1a)由眾多生精小管緊密排列組成，生精小管中緊貼管壁排列著不同發(fā)育時(shí)期的生殖細(xì)胞：精原細(xì)胞(sg)、精母細(xì)胞(sc)、精細(xì)胞(st)，管腔中間可見(jiàn)零散分布著少量精子(sz)。10 nmol·L-1E2暴露促進(jìn)精巢的發(fā)育(圖1b)，生精小管變大，管腔中間精子(sz)數(shù)目顯著增多，成簇排列。卵巢組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，相比對(duì)照(圖1c)，6 d的E2暴露對(duì)卵巢的組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的改變(圖1d)，但略促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育。對(duì)照組卵巢中卵母細(xì)胞均處于Ⅰ期(直徑50～300 μm)。10 nmol·L-1E2處理后，卵巢中除了Ⅰ期卵母細(xì)胞外，同時(shí)存在Ⅱ期卵母細(xì)胞(直徑300～450 μm)。

正常性腺發(fā)育過(guò)程中，雌性的繆勒氏管分化為輸卵管，成為重要的第二性特征。對(duì)照中腎臟兩側(cè)輸卵管已明顯發(fā)育，但整體形態(tài)比較直挺，彎曲較少(圖2a)，而10 nmol·L-1E2處理6 d后(圖2b)，腎臟兩側(cè)輸卵管變粗變長(zhǎng)，出現(xiàn)多個(gè)彎曲盤(pán)旋，E2顯著促進(jìn)了輸卵管的發(fā)育。

2.2 E2暴露對(duì)性腺和腦中性二態(tài)基因表達(dá)的影響

2.2.1 對(duì)性激素合成轉(zhuǎn)化相關(guān)基因及上游調(diào)控基因表達(dá)的影響

圖3顯示E2暴露6 d后腦和性腺中性激素合成轉(zhuǎn)化相關(guān)基因cyp11a1、3βHSD、cyp17、Srd5α、ARO的表達(dá)水平。性激素合成轉(zhuǎn)化通路中的cyp11a1、3βHSD、Srd5α基因，精巢中表達(dá)水平顯著高于卵巢中表達(dá)；E2暴露后，cyp11a1、3βHSD基因在精巢和卵巢中的表達(dá)均降低，精巢中Srd5α的表達(dá)也受抑制。ARO為卵巢中高表達(dá)基因，E2暴露后ARO在卵巢中的表達(dá)下調(diào)了2.5倍。腦中這些基因的表達(dá)均沒(méi)有顯著雌雄差異，且不受E2影響。

腦中GnRH、FSHβ、LHβ調(diào)控激素的合成和轉(zhuǎn)化。在正常情況下，雄性中GnRH表達(dá)高于雌性，而雌性中FSHβ、LHβ表達(dá)高于雄性。E2暴露后雌雄個(gè)體腦中FSHβ、LHβ表達(dá)水平均受顯著抑制：與對(duì)照相比，E2暴露使雌雄腦中FSHβ的表達(dá)分別下調(diào)250倍和50倍，LHβ的表達(dá)分別下調(diào)1500倍和500倍，且不存在雌雄表達(dá)差異。E2暴露不影響腦中GnRH的表達(dá)(圖4)。

圖1 E2暴露對(duì)非洲爪蟾性腺組織學(xué)的影響(a. 對(duì)照組精巢；b. E2暴露組精巢；c. 對(duì)照組卵巢；d. E2暴露組卵巢；sg. 精原細(xì)胞；sc. 精母細(xì)胞；st. 精細(xì)胞；sz. 精子；Ⅰ.Ⅰ期卵母細(xì)胞；Ⅱ. Ⅱ期卵母細(xì)胞)Fig. 1 Effects of E2 on gonad histology in Xenopus laevis

圖2 E2暴露對(duì)非洲爪蟾輸卵管的影響(a. 對(duì)照組輸卵管；b. E2暴露組輸卵管；K. 腎臟；OD. 輸卵管)Fig. 2 Effects of E2 on oviductive morphology in Xenopus laevis

2.2.2 對(duì)性別分化及性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

正常情況下，Dmrt1、Dax、AR、ERα、TFⅢA在精巢中高表達(dá)(圖5a)，精巢中的表達(dá)分別是卵巢中的120倍、30倍、3倍、2倍、4.5倍。腦中這些基因的表達(dá)沒(méi)有性別差異。E2暴露對(duì)性腺中這些基因表達(dá)沒(méi)有影響，但使腦中Dmrt1的表達(dá)下調(diào)。

Sox3、Emi2、TBPL2在卵巢中高表達(dá)，卵巢中的表達(dá)水平分別是精巢中的1200倍、50倍、37倍。腦中這些基因的表達(dá)沒(méi)有性別差異。E2暴露促進(jìn)卵巢中Sox3的表達(dá)，對(duì)Emi2、TBPL2的表達(dá)則無(wú)影響。而在腦中，E2暴露促進(jìn)雌雄腦中Emi2的表達(dá)(圖5b)。

圖3 E2暴露對(duì)性激素合成轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of E2 on mRNA expression of the genes that are related to sex hormone synthesis and conversion in Xenopus laevis

圖4 E2暴露對(duì)非洲爪蟾腦中GnRH、FSHβ、LHβ表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of E2 on mRNA expression of GnRH, LHβ and FSHβ in Xenopus laevis brains

3 討論(Discussion)

有眾多研究證實(shí)，雌激素類物質(zhì)長(zhǎng)期暴露可影響兩棲動(dòng)物的性腺發(fā)育，導(dǎo)致性腺形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)雌性化特征[14-17]。本研究結(jié)果顯示，短期E2暴露對(duì)精巢及卵巢形態(tài)基本沒(méi)有影響，對(duì)組織結(jié)構(gòu)的影響也并不十分明顯，只是對(duì)精子和卵的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。顯示外源雌激素對(duì)性腺發(fā)育的影響需要一定時(shí)間累積。因此，性腺形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)不適合作為短期暴露評(píng)價(jià)雌激素效應(yīng)的指標(biāo)。但是，6 d的E2暴露對(duì)第二性特征輸卵管有顯著影響，導(dǎo)致輸卵管明顯變粗變彎曲。Pettersson等[17]研究了乙炔雌二醇(EE2)長(zhǎng)期暴露對(duì)熱帶爪蟾生殖器發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 nmol·L-1EE2暴露蝌蚪9個(gè)月后組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)所有性腺均呈現(xiàn)卵巢特性，且約有40%的卵巢沒(méi)有輸卵管，含有輸卵管的個(gè)體其輸卵管軀體指數(shù)(輸卵管重量/身體重量)相比對(duì)照升高，100 nmol·L-1EE2則顯著增加輸卵管軀體指數(shù)。因此輸卵管可能是一個(gè)對(duì)雌激素十分敏感的器官，可作為評(píng)價(jià)化學(xué)品短期暴露對(duì)非洲爪蟾雌激素效應(yīng)的形態(tài)指標(biāo)。

圖5 E2暴露對(duì)性別分化和性腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of E2 on mRNA expression of the genes that are related to sexual differentiation and gonadal development in Xenopus laevis

脊椎動(dòng)物的性腺發(fā)育受到下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)的調(diào)節(jié)和控制，激素及其受體在信息傳遞過(guò)程中起了重要作用[18]。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素GnRH促進(jìn)垂體分泌黃體生成素LH和促卵泡激素FSH，隨后FSH、LH作用于性腺，刺激性腺合成相應(yīng)性激素。本文研究結(jié)果顯示，10 nmol·L-1E2暴露 6 d后，腦中LHβ、FSHβ的表達(dá)顯著抑制。與我們的研究結(jié)果類似，Li等[19]用炔雌醇(EE)暴露8周齡SD雄鼠7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 mg·kg-1劑量下即可引起血清中LH和FSH的水平顯著下降，在10 mg·kg-1劑量下血清中睪酮水平也顯著下調(diào)。cyp11a1、3βHSD、cyp17、ARO、Srd5α等基因參與了膽固醇合成激素的過(guò)程：cyp11a1編碼P450 11-羥化酶催化膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，孕烯醇酮在3β-羥基類固醇脫氫酶(3βHSD)作用下轉(zhuǎn)化為孕酮，隨后孕酮由cyp17編碼的P450 17-羥化酶催化轉(zhuǎn)化為雄烯二酮，進(jìn)而轉(zhuǎn)化形成睪酮。在精巢中，睪酮經(jīng)5α-還原酶(Srd5α)作用生成活性更強(qiáng)的雙氫睪酮；在卵巢中，睪酮?jiǎng)t在芳香化酶(ARO)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫?。本文研究結(jié)果顯示，10 nmol·L-1E2暴露 6 d后，性腺中激素合成轉(zhuǎn)化重要基因cyp11a1、3βHSD、ARO、Srd5α的表達(dá)均受到顯著抑制，cyp17的表達(dá)水平不受影響。Liu等[20]的研究顯示，25 ng·L-1乙炔雌二醇(EE2)暴露7 d可抑制稀有鮈鯽性腺中cyp11a1、cyp17、cyp19的表達(dá)，但對(duì)3βHSD沒(méi)有影響。Overturf等[21]的研究結(jié)果則表明黑頭呆魚(yú)暴露左炔諾孕酮(LNG)28d后可引起FSH、3βHSD、ARO、ERβ表達(dá)顯著下調(diào)，但對(duì)LHβ、cyp11a1、cyp17、AR、ERα的表達(dá)沒(méi)有影響。這些結(jié)果與本文研究結(jié)果基本一致，顯示在短期暴露下，性激素的合成及轉(zhuǎn)化相關(guān)基因Srd5α、cyp11a1、3βHSD、ARO 以及上游調(diào)控基因LHβ、FSHβ對(duì)雌激素的作用十分敏感，且6 d暴露后產(chǎn)生的效應(yīng)與長(zhǎng)期暴露數(shù)據(jù)基本吻合，可以作為短期暴露篩查化學(xué)品雌激素效應(yīng)的分子指標(biāo)。

兩棲動(dòng)物的性別決定是由基因控制的，但性激素的暴露可干擾正常的性別分化[22-23]。Dmrt1、Dax、AR、ERα、TFⅢA、Sox3、Emi2、TBPL2是性別分化和性腺發(fā)育相關(guān)的重要基因。本文研究了E2暴露對(duì)這些基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2導(dǎo)致腦中Dmrt1的表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腦中Emi2及卵巢中Sox3的表達(dá)，對(duì)其他基因的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。在脊椎動(dòng)物中，Dmrt1被認(rèn)為與性腺發(fā)育有重要關(guān)聯(lián)，主要在非洲爪蟾精巢中表達(dá)，卵巢中水平很低[24]。Sox家族基因也是重要的性別決定基因，其中Sox3被認(rèn)為是重要的X決定基因[25]。Emi2基因則是非洲爪蟾卵母細(xì)胞減少分裂過(guò)程中重要的生長(zhǎng)抑制因子，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用[26]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，成年斑馬魚(yú)暴露25 ng·L-1EE2 兩周，顯著抑制精巢中Dmrt1的表達(dá)，對(duì)AR、ERα、ARO的表達(dá)則無(wú)顯著作用[27]。由此可見(jiàn)，雌激素暴露會(huì)在一定程度上干擾性別決定基因的表達(dá)，產(chǎn)生一定雌激素干擾效應(yīng)。但整體而言，除Sox3外，雌激素暴露對(duì)性別分化和性腺發(fā)育相關(guān)基因的影響并不十分明顯。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)輸卵管對(duì)雌激素的短期暴露十分敏感，可作為評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)兩棲動(dòng)物的雌激素效應(yīng)的形態(tài)指標(biāo)，并可發(fā)展輸卵管重量、盤(pán)曲數(shù)及相關(guān)基因表達(dá)水平等定量指標(biāo)。同時(shí)，性腺中Srd5α、cyp11a1、3βHSD、ARO、Sox3和腦中LHβ、FSHβ、Emi2、Dmrt1對(duì)雌激素的短期暴露也十分敏感，可作為研究化學(xué)品雌激素效應(yīng)的分子指標(biāo)。以上結(jié)果為后續(xù)建立評(píng)價(jià)化學(xué)品對(duì)兩棲動(dòng)物雌激素效應(yīng)的短期試驗(yàn)方法提供了參考。

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Initial Evaluation on Gonadal and Oviductive Morphology and Sexually Dimorphic Gene Expression ofXenopuslaveisafter Short-term Exposure to 17 beta-Estrodiol

Xu Wei1, Lou Qinqin2, Wei Wuji1,*, Qin Zhanfen2

1. College of Environment, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China 2. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

19 May 2014 accepted 9 June 2014

Reproductive endocrine disruption by environmental estrogens in amphibians has aroused great concern. The research in the field was focused on effects of long-term exposure on gonadal differentiation and development. In this study, Xenopus laevis frogs (6 month old) were exposed to 10 nmol·L-1estradiol (E2, a model compound) for six days to investigate the effects on gonadal and oviductive morphology as well as mRNA expression of sexually dimorphic genes. It was found that 6-day exposure to E2 had no significant effect on testicular and ovarian morphology, whereas it seemed to exhibit a weak promoting effect on egg and sperm development. E2 made oviducts widen and curve, exhibiting a promoting effect on oviductive development. Compared with the control, E2 exposure significantly inhibited expression levels of cyp11a1, 3βHSD, Srd5α and ARO, which are related to sex hormone synthesis and transformation, in testis and ovary, with no effect on the expression of cyp17. E2 also decreased LHβ and FSHβ expression in brain. Several genes that are related to sex differentiation and gonadal development, including Dax, AR, ERα, TFⅢA and TBPL2, were not affected by E2 at the transcriptional levels. By contrast, E2 significantly promoted Sox3 expression in the ovary and Emi2 in the brain, and inhibited Dmrt1 expression in the brain. Therefore, oviductive morphology and the expression levels of Srd5α, cyp11a1, 3βHSD, ARO and Sox3 in the gonad as well as LHβ, FSHβ, Dmrt1 and Emi2 in the brain can be used as sensitive endpoints. Our study can provide technical reference for developing a short-term assay for evaluating estrogenic effects of chemicals on amphibians.

17 beta-estrodoil; Xenopus laevis; estrogenic effect; oviduct; gonad; sexually dimorphic genes

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21377153；21077125)

徐偉(1989-)，男，碩士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)，E-mail: xuwei07415224@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: weiwujipg@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140519001徐偉, 樓欽欽, 魏無(wú)際, 等. 雌二醇短期暴露對(duì)非洲爪蟾性腺和輸卵管形態(tài)及性二態(tài)基因表達(dá)影響的初步研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(1): 263-270

2014-05-19 錄用日期：2014-06-09

1673-5897(2015)1-263-08

X171.5

A

魏無(wú)際(1955—)，男，應(yīng)用化學(xué)碩士，南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院副院長(zhǎng)、教授，主要研究方向金屬表面緩蝕劑的制備與應(yīng)用，有機(jī)高分子化合物的合成及改性、工業(yè)水處理。

Xu W, Lou Q Q, Wei W J, et al. Initial evaluation on gonadal and oviductive morphology and sexually dimorphic gene expression of Xenopus laveis after short-term exposure to 17beta-estrodiol [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 263-270 (in Chinese)