方超，寧博，范江霖,，董四君,*

1. 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361021 2. 日本山梨大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)工學(xué)綜合研究部 分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山梨県 409-3898

雙酚A(BPA)暴露對(duì)WHHL家兔糖類和脂類代謝的影響

方超1，寧博2，范江霖1,2，董四君1,*

1. 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門(mén) 361021 2. 日本山梨大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)工學(xué)綜合研究部 分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山梨県 409-3898

為利用和人類更為接近的動(dòng)物模型來(lái)研究在高脂血癥條件下，BPA暴露是否能促進(jìn)脂類和糖類代謝異常，并探索潛在的毒性效應(yīng)機(jī)制，選取渡邊可遺傳高脂血癥家兔(WHHL)模型，通過(guò)灌胃的方式將其暴露于400 μg·kg-1體重的BPA溶液長(zhǎng)達(dá)12周。在持續(xù)暴露第8周，檢測(cè)了在空腹?fàn)顟B(tài)下，家兔血漿中葡萄糖、胰島素和脂肪含量的變化，并根據(jù)所得結(jié)果進(jìn)行了靜脈注射胰島素耐受試驗(yàn)(IVTT)。在暴露第12周，同樣對(duì)空腹?fàn)顟B(tài)下，家兔血漿中的葡萄糖，胰島素和脂肪含量進(jìn)行了檢測(cè)，并測(cè)量了血壓和心率。然后，將所有的家兔進(jìn)行解剖，通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)及糖原(PAS)染色分別對(duì)心臟和肝臟部位的脂肪及糖原蓄積情況進(jìn)行了病理學(xué)切片分析。同時(shí)，檢測(cè)了肝臟中與脂類和糖類代謝相關(guān)基因在mRNA水平上的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，BPA暴露8周后促使WHHL家兔發(fā)生了胰島素抵抗現(xiàn)象，導(dǎo)致第12周血糖及胰島素含量升高，同時(shí)也促進(jìn)了高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及游離脂肪酸(NEFA)含量的上升。BPA暴露第12周，暴露組WHHL家兔的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化損傷程度未發(fā)生明顯增加，但心肌細(xì)胞發(fā)生了腫脹，胞質(zhì)中出現(xiàn)了脂肪的蓄積，同時(shí)伴隨著心律失常。肝臟重量發(fā)生增加，肝細(xì)胞中同時(shí)出現(xiàn)了脂肪和糖原的蓄積現(xiàn)象，相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著上調(diào)。研究結(jié)果表明，BPA持續(xù)暴露可促進(jìn)WHHL家兔發(fā)生脂類和糖類代謝異常，其毒性效應(yīng)機(jī)制可能和胰島素抵抗及相關(guān)基因的異常表達(dá)有關(guān)。

雙酚A(BPA)；WHHL家兔；代謝異常；脂肪和糖原蓄積；胰島素抵抗；基因表達(dá)

雙酚A(BPA)是一類具有雌激素活性的典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。作為當(dāng)今世界生產(chǎn)量最大的人造化學(xué)物質(zhì)之一，BPA被廣泛應(yīng)用于飲用水容器、餐具、嬰兒奶瓶、食品飲料包裝、罐裝食品的內(nèi)涂層、熱敏紙及各類醫(yī)療設(shè)備中[1]。因此，BPA可通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境造成污染，使得人類對(duì)BPA的暴露幾乎無(wú)處不在。一些流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)絕大部分人體的尿液和血液中均能檢測(cè)到BPA的存在[2-3]。據(jù)此，美國(guó)“時(shí)代周刊”有文章稱，BPA廣泛存在于現(xiàn)代人的體內(nèi)[4]。正因?yàn)锽PA在環(huán)境和人體內(nèi)廣泛分布，其對(duì)人類健康的影響也越來(lái)越受到關(guān)注。一些流行病學(xué)調(diào)查顯示，尿液或血液中的BPA含量和各類代謝相關(guān)疾病如肥胖癥、2型糖尿病及心血管疾病存在顯著相關(guān)性[5-8]。雖然BPA對(duì)人體代謝系統(tǒng)的危害不容忽視，但其毒性效應(yīng)和致病機(jī)理還尚未明確。目前，已有研究利用大/小鼠模型發(fā)現(xiàn)出生前或出生后暴露于BPA即可擾亂母體及后代的血糖和血脂平衡，從而增加患胰島素抵抗和代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。此外，長(zhǎng)期暴露于BPA還能損害大/小鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能，引起心律失常[11]。但利用小/大鼠模型來(lái)研究BPA的毒性效應(yīng)所得到的結(jié)果無(wú)法確定是否能推測(cè)到人體上，因?yàn)橐延写罅康难芯勘砻餍?大鼠和人類存在很多不同點(diǎn)，包括脂類代謝、血糖代謝、心血管系統(tǒng)以及對(duì)炎癥刺激的分子響應(yīng)水平等[12-13]。并且，人類和小/大鼠在局部脂質(zhì)沉積，細(xì)胞的組成(如褐色和白色脂肪的比例，巨噬細(xì)胞的入侵)以及對(duì)各類蛋白(如抵抗素、刺蛋白和脂肪酶)，血糖轉(zhuǎn)運(yùn)和相關(guān)受體(如腎上腺素能受體)的調(diào)節(jié)方面也存在很大的區(qū)別[14-15]。而家兔模型則由于在基因組和上述各方面條件上更接近于人類，被證明更適用于各項(xiàng)人類疾病的研究[12]。

此外，高脂血癥被定義為血液中的脂肪或脂蛋白含量異常升高，在當(dāng)今社會(huì)尤其是在發(fā)達(dá)國(guó)家已成為一種普遍的病理現(xiàn)象[16]。根據(jù)發(fā)病機(jī)制的不同，高脂血癥可分為先天性和后天性高脂血癥，前者是由于基因缺陷造成的常見(jiàn)家族性遺傳疾病，全球有近千萬(wàn)人患此疾病[17]；后者則是由于各類疾病(糖尿病、肥胖、腎病和肝病等)的影響，不健康飲食，吸煙，過(guò)度酗酒，藥物反應(yīng)及缺乏運(yùn)動(dòng)等原因造成的典型“現(xiàn)代病”[18]，在美國(guó)血脂含量超標(biāo)的人口超過(guò)30%[19]。同時(shí)，由于BPA在各類醫(yī)療設(shè)備中運(yùn)用廣泛，導(dǎo)致高脂血癥人群接觸和暴露于BPA的風(fēng)險(xiǎn)大幅度提高[20]。然而，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有研究來(lái)專門(mén)探討在高脂血癥的條件下，BPA暴露是否能促進(jìn)脂類和糖類代謝異常，并加速相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

針對(duì)上述問(wèn)題，本研究選取了渡邊可遺傳高脂血癥家兔(WHHL)模型來(lái)研究BPA對(duì)脂類和糖類代謝的影響。WHHL家兔作為日本特有的模式生物，是由日本神戶大學(xué)的渡邊博士在1973年發(fā)現(xiàn)，并經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展而形成的自發(fā)性內(nèi)源性高膽固醇血癥家兔品系。其特點(diǎn)類似于高脂血癥家族人群，由于先天性低密度脂蛋白(LDL)受體缺乏，不需要投喂高脂高糖飲食就能自發(fā)形成高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，已被廣泛應(yīng)用于代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化和胰島素抵抗等疾病的研究[21]。但目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有人利用此類動(dòng)物模型來(lái)研究BPA對(duì)心血管及代謝系統(tǒng)方面的毒性作用和潛在的病理學(xué)機(jī)制。因此，本研究利用此類模型一方面關(guān)注BPA是否促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，另一方面重點(diǎn)研究BPA對(duì)血液、心臟及肝臟系統(tǒng)中脂類和糖類代謝的影響，以期為進(jìn)一步闡明BPA的毒性效應(yīng)機(jī)制，并為該類污染物及相關(guān)疾病的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：Lightcycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士 Roche公司)，ML870 PowerLab血壓和心率監(jiān)測(cè)儀(日本ADInstuments公司)，SpectraMAX M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)，Tissue- Tek?TECTM5組織包埋機(jī)(日本Sakura公司)，Tissue-Tek?VIPTM5 Jr. 組織自動(dòng)脫水機(jī)(日本Sakura公司)，REM-700石蠟切片機(jī)(日本Ymato公司)，Olympus BX51TF光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

試劑：雙酚A(BPA)，純度為97%，購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；無(wú)水乙醇，分析純，購(gòu)于日本W(wǎng)ako化學(xué)公司；玉米油，純度為98%，購(gòu)于日本W(wǎng)ako化學(xué)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

WHHL家兔：雄性，體重(2.34±0.24) kg，4個(gè)月大小，處于青年期，均由日本神戶大學(xué)提供。根據(jù)體重將其分為2組，分別為對(duì)照組(含6只兔子)和BPA暴露組(含6只兔子)。所有兔子均在日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部的無(wú)菌動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)和暴露實(shí)驗(yàn)，每只兔子單獨(dú)在不銹鋼鐵籠中進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室的溫度控制在(25 ± 2) °C，并保持12 h光照和12 h黑暗的循環(huán)周期，每天由不銹鋼自動(dòng)出水裝置提供飲水，并提供100 g經(jīng)過(guò)壓制的普通飲食。每周的體重和每天的攝食量均嚴(yán)格進(jìn)行記錄。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作均得到了山梨大學(xué)倫理委員會(huì)及動(dòng)物管理協(xié)會(huì)的許可，并嚴(yán)格遵照美國(guó)聯(lián)邦衛(wèi)生研究所頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作指南上的相關(guān)規(guī)定。

400 μg·kg-1體重BPA溶液的配置：首先將BPA溶于少量無(wú)水乙醇(體積比控制在4%)然后溶于玉米油。每天早上，通過(guò)灌胃的方式將WHHL家兔暴露于上述濃度的BPA溶液(投喂量控制在2 mL·kg-1)，并持續(xù)12周。對(duì)照組也同樣通過(guò)灌胃的方式每天投喂相同體積但不含BPA的玉米油。在持續(xù)暴露第8周，我們檢測(cè)了在空腹?fàn)顟B(tài)下，家兔血漿中葡萄糖、胰島素和脂肪含量的變化，并根據(jù)所得結(jié)果進(jìn)行了靜脈注射胰島素耐受試驗(yàn)(IVTT)。在暴露第12周，我們對(duì)家兔進(jìn)行了血壓和心率的檢測(cè)，并對(duì)空腹?fàn)顟B(tài)下血漿中的葡萄糖、胰島素和脂肪含量進(jìn)行了分析。然后，我們將所有的家兔進(jìn)行解剖，通過(guò)蘇木精-伊紅(HE)和糖原(PAS)染色，重點(diǎn)對(duì)心臟和肝臟部位的脂肪及糖原蓄積情況進(jìn)行了病理學(xué)切片分析。同時(shí)，我們還對(duì)肝臟中和脂類及糖類代謝密切相關(guān)的若干基因在mRNA水平上的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。為了使每只兔子的條件保持一致，我們?cè)诮馄是皩?shí)施了絕食16 h的處理。

1.3 血漿中葡萄糖、胰島素和脂肪含量的測(cè)定

血漿中葡萄糖含量的測(cè)定采用葡萄糖測(cè)定試劑盒(日本W(wǎng)ako化學(xué)公司)；胰島素含量的測(cè)定采用兔子胰島素ELISA試劑盒(日本Shibayagi公司)；血漿中脂肪含量，包括總膽固醇(TC)、三油甘酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及游離脂肪酸(NEFA)，脂肪酶(Lipase)均采用相應(yīng)的試劑盒(日本W(wǎng)ako化學(xué)公司)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 靜脈注射胰島素耐受試驗(yàn)(IVTT)

采用Waqar等[22]建立的方法進(jìn)行。此外，濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)代表某種物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)后隨時(shí)間在體內(nèi)或血液中的總蓄積量，其大小可通過(guò)梯形面積累加法進(jìn)行計(jì)算[22]。本實(shí)驗(yàn)利用AUC來(lái)表征從0到120 min，葡萄糖在WHHL家兔血漿中累積的總濃度。

1.5 石蠟切片及蘇木精-伊紅(HE)和糖原(PAS)染色

采用Waqar等[22]建立的方法進(jìn)行。同時(shí)，我們采用3人隨機(jī)打分的方式對(duì)HE和PAS染色中脂肪和糖原蓄積程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，得分越高則代表富集程度越嚴(yán)重。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

采用Fang等[23]建立的方法進(jìn)行，用于熒光定量PCR的引物序列見(jiàn)表1所示。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的引物序列

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用WinROOF ver. 7.0圖像處理軟件(日本Mitani公司)對(duì)HE和PAS染色的圖像進(jìn)行比較分析。采用SPSS16.0軟件中的Independent-Samples T Test檢驗(yàn)對(duì)暴露組和對(duì)照組之間各實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。置信水平P<0.05時(shí)差異顯著，置信水平P<0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 BPA暴露8周后血糖、胰島素和血脂含量的變化

經(jīng)400 μg·kg-1體重的BPA暴露8周后，WHHL家兔血液中胰島素和葡萄糖的含量如圖圖1A所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)暴露組WHHL家兔血液中胰島素和葡萄糖含量和對(duì)照組相比均未發(fā)生顯著性變化。因此，我們進(jìn)一步進(jìn)行了靜脈注射胰島素耐受試驗(yàn)(IVTT)，注射胰島素后，WHHL家兔的血糖濃度和時(shí)間變化曲線如圖1B所示，從圖中可以看出，暴露組家兔對(duì)血糖的代謝略滯后于對(duì)照組，特別是在60 min這個(gè)點(diǎn)表現(xiàn)出了顯著性差異(P=0.02)；在90 min和120 min，暴露組家兔血糖的含量分別是對(duì)照組的1.19和1.21倍，但兩者之間沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)。

這表明暴露組家兔對(duì)胰島素的利用率或敏感性要低于對(duì)照組，表現(xiàn)出了一定的胰島素抵抗效應(yīng)，這一結(jié)論從濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)上也得到了證實(shí)。此外，暴露組家兔血液中的血脂含量，包括總膽固醇(TC)、三油甘酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及游離脂肪酸(NEFA)的含量和對(duì)照組相比均未出現(xiàn)顯著性變化(數(shù)據(jù)未展示)。

圖1 BPA暴露8周后，(A)WHHL家兔血漿中胰島素和葡萄糖的含量(B)靜脈注射胰島素耐受試驗(yàn)(IVTT)中WHHL家兔的血糖濃度和時(shí)間變化曲線Fig. 1 Exposure to BPA for 8 weeks, (A) the insulin and glucose levels in the plasma of WHHL rabbits (B) intravenous insulin tolerance test (IVTT),the time curve of plasma glucose levels

2.2 BPA暴露12周后血糖、胰島素和血脂含量的變化

經(jīng)400 μg·kg-1體重的BPA暴露12周后，WHHL家兔血液中胰島素和葡萄糖的含量如圖2所示，從圖中可以看出，暴露組WHHL家兔血液中的胰島素和葡萄糖含量均顯著高于對(duì)照組；此外，血液中的脂肪酶、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及游離脂肪酸(NEFA)的含量也發(fā)生了顯著升高。然而，血液中的總膽固醇(TC)和三油甘酯(TG)的含量和對(duì)照組相比均沒(méi)有發(fā)生顯著性變化(數(shù)據(jù)未展示)。雖然，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)在含量上也未發(fā)生顯著性變化，但和0周相比，其增加的倍數(shù)要顯著高于對(duì)照組所增加的倍數(shù)。

其次，我們從圖3A發(fā)現(xiàn)在整個(gè)12周的暴露階段，暴露組WHHL家兔和對(duì)照組相比，體重未發(fā)生顯著性改變，但肝臟的重量發(fā)生了顯著增加。圖3B顯示暴露組家兔的血壓也沒(méi)有顯著性改變，但心率和對(duì)照組相比則發(fā)生了顯著下降。

圖2 BPA暴露12周后，WHHL家兔血漿中胰島素、葡萄糖和脂肪含量的變化Fig. 2 Exposure to BPA for 12 weeks, the changes of plasma insulin, glucose and lipid levels

圖3 BPA暴露12周后，(A)WHHL家兔體重、肝臟重量的變化(B)血壓和心率的變化Fig. 3 Exposure to BPA for 12 weeks, (A) the changes of body and liver weights (B) the changes of blood pressure and heart rate in the WHHL rabbits

2.3 BPA暴露12周后對(duì)心臟脂肪蓄積的影響

經(jīng)400 μg·kg-1體重的BPA暴露12周后，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的損傷程度如圖4A，B所示，結(jié)果顯示，暴露組和對(duì)照組家兔冠狀動(dòng)脈硬化的損傷程度均達(dá)到了73%左右，兩者之間并沒(méi)有顯著性差異。但經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)，暴露組家兔的心肌細(xì)胞發(fā)生了明顯的腫脹，并且在胞質(zhì)中還出現(xiàn)了脂肪蓄積現(xiàn)象(圖4C，箭頭所指)，進(jìn)一步通過(guò)軟件統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其損傷區(qū)域面積顯著高于對(duì)照組(圖4D)。2.4 BPA暴露12周后對(duì)肝臟脂肪和糖原蓄積的影響

經(jīng)400 μg·kg-1體重的BPA暴露12周后，從圖5A的肝臟HE染色圖可以發(fā)現(xiàn)，暴露組家兔的肝臟細(xì)胞中發(fā)生了明顯的脂肪蓄積現(xiàn)象，脂肪顆粒以中央靜脈為中心，向四周略呈放射狀排列。圖5B是我們進(jìn)一步通過(guò)3人隨機(jī)打分的方式來(lái)評(píng)估每只家兔肝臟中的脂肪蓄積程度，結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)暴露組家兔肝臟中脂肪蓄積程度要顯著高于對(duì)照組。同時(shí)，從圖5C的肝臟HE染色圖也發(fā)現(xiàn)暴露組家兔的肝細(xì)胞中發(fā)生了明顯的糖原蓄積現(xiàn)象，肝細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的白色沉積，并且在靠近中央靜脈的區(qū)域尤為明顯。圖5D進(jìn)一步顯示了通過(guò)PAS染色后糖原蓄積的情況，可發(fā)現(xiàn)暴露組家兔肝臟中的PAS染色程度(紫色部分)更為明顯，該結(jié)果通過(guò)圖5E的3人隨機(jī)打分評(píng)估方式得到了進(jìn)一步證實(shí)，表明暴露組家兔肝臟對(duì)糖原的蓄積程度要顯著高于對(duì)照組。

2.5 肝臟中相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)

經(jīng)400 μg·kg-1體重的BPA暴露12周后，WHHL家兔肝臟中和脂類及糖類代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平如圖6所示，結(jié)果顯示CEBPA、SREBP1、PPARα、GRP94、MTTP和ATF4基因的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均發(fā)生了顯著的上調(diào)。

圖4 BPA暴露12周后，(A)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化蘇木精-伊紅(HE)染色圖 (B)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化損傷面積統(tǒng)計(jì)，黑色短橫線代表平均值 (C)心肌細(xì)胞HE染色圖，黑色箭頭顯示心肌細(xì)胞中發(fā)生的脂肪蓄積 (D)心肌細(xì)胞損傷區(qū)域面積統(tǒng)計(jì)，黑色短橫線代表平均值注：對(duì)照組，n=5；暴露組，n=6。Fig. 4 Exposure to BPA for 12 weeks, (A) the HE staining of atherosclerosis of coronary artery (B) the lesion areas of atherosclerosis, the black small line represents the mean value (C) the HE staining of cardiac muscle cell, black arrow shows lipid accumulation in the cardiac muscle cell (D) the lesion areas of cardiac muscle cell, the black small line represents the mean valueNote: Control, n=5; exposure group, n=6.

圖6 BPA暴露12周后，肝臟中若干與脂類和糖類代謝相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)變化Fig. 6 Exposure to BPA for 12 weeks, the mRNA expression of some genes related to lipid and glucose metabolism in the liver

3 討論(Discussion)

3.1 BPA暴露濃度的選擇

本研究選取BPA的暴露濃度為400 μg·kg-1主要有以下兩方面原因：首先，BPA的暴露無(wú)處不在，人類攝入BPA存在多種途徑。雖然有研究根據(jù)尿液中BPA的含量推算出人體每天經(jīng)口攝入BPA的量約為1 μg·kg-1，但目前還沒(méi)有研究能準(zhǔn)確估算出人體每天通過(guò)多種途徑(包括經(jīng)口、呼吸及皮膚接觸)攝入BPA的總量[1]。一項(xiàng)最新研究利用恒河猴和CD-1小鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)400 μg·kg-1BPA暴露后的24 h期間，它們血清中BPA的含量在1 h達(dá)到最大值，之后發(fā)生下降，在24 h后基本回到了起始值，并且整個(gè)濃度的變化范圍均處于正常人體含量水平之內(nèi)(如表2所示)，BPA在它們血液中的動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程和人體中也十分相似，據(jù)此推測(cè)人體日常通過(guò)多種途徑攝入BPA的總量很可能在400 μg·kg-1左右[24-25]。其次，我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中也初步發(fā)現(xiàn)經(jīng)400 μg·kg-1BPA暴露后的24 h期間，日本大耳白兔和WHHL家兔血清中BPA的含量變化范圍和動(dòng)力學(xué)過(guò)程均接近于恒河猴、CD-1小鼠及正常人體水平(如表2所示)。因此，本研究選用的這個(gè)暴露濃度存在一定的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 BPA對(duì)血糖和血脂代謝的影響

BPA暴露8周后，WHHL家兔出現(xiàn)了一定的胰島素抵抗現(xiàn)象，胰島素的主要功能是促進(jìn)組織細(xì)胞對(duì)血漿中葡萄糖的攝取和利用，從而維持血糖濃度的穩(wěn)定[27]。胰島素抵抗則是由于外周組織(肌肉、脂肪和肝臟)細(xì)胞中的胰島素受體對(duì)胰島素響應(yīng)的敏感性降低，從而無(wú)法有效地利用胰島素來(lái)對(duì)血糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致高血糖癥。胰島中的β-細(xì)胞是分泌胰島素的主要場(chǎng)所，由于胰島素抵抗，胰腺β細(xì)胞不得不分泌更多的胰島素進(jìn)行工作，從而造成高胰島素血癥，增加了患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[28]。因此，本研究在BPA暴露12周后，發(fā)現(xiàn)WHHL家兔血漿中的葡萄糖和胰島素含量均發(fā)生了顯著上升，其原因可能和BPA促進(jìn)了胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)。

此外，脂肪酶在脂肪的消化、轉(zhuǎn)移和利用方面起著重要作用，胰島功能受損，胰島素抵抗，以及脂代謝紊亂都是導(dǎo)致血液中脂肪酶含量上升的重要原因[29]，因此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WHHL家兔血漿中脂肪酶含量升高可能和上述原因存在一定的關(guān)聯(lián)。同時(shí)，胰島素抵抗和血脂代謝紊亂也存在密切的聯(lián)系，高密度脂蛋白(HDL)主要功能是去除組織細(xì)胞和血液中的脂肪和膽固醇，將其運(yùn)載到肝臟中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和排除，其含量的降低將引起血脂代謝異常，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)生[30]。相反，低密度脂蛋白(LDL)則主要將脂肪和膽固醇轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外液(包括血液)中，其含量升高將造成脂肪和膽固醇在組織和血管內(nèi)壁發(fā)生堆積，從而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化和其他代謝綜合征等疾病的發(fā)生[30]。游離脂肪酸(NEFA)含量的升高和脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能失調(diào)有關(guān)，同時(shí)肝臟和甲狀腺功能受損也會(huì)造成其含量發(fā)生改變[31]。因此，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WHHL家兔血液中上述指標(biāo)的改變，表明BPA可促進(jìn)血脂代謝異常，誘發(fā)高脂血癥和相關(guān)代謝疾病的發(fā)生。Wei等[10]的研

表2 經(jīng)BPA暴露后的24 h期間各生物血清中BPA的含量水平

注：a 標(biāo)注表示此處均為自由態(tài)的BPA。

Note：a the BPA hereby refers to unconjugated BPA.

究也證實(shí)了大鼠圍產(chǎn)期暴露于低劑量的BPA，并在斷乳后投喂高脂高糖飲食，可導(dǎo)致子代血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白顯著升高，同時(shí)高密度脂蛋白水平顯著降低。本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)WHHL家兔其他血脂指標(biāo)發(fā)生改變，如總膽固醇和甘油三酯，這一方面可能是由于在WHHL家兔中上述血脂指標(biāo)的本底值較高，要引起變化較為困難；另一方面則是由于暴露時(shí)間較短，在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們將延長(zhǎng)暴露時(shí)間，從而進(jìn)一步觀察上述指標(biāo)的變化。

3.3 BPA對(duì)心臟中脂類代謝的影響

利用WHHL家兔模型我們首先關(guān)注BPA對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的影響，動(dòng)脈粥樣硬化是由于脂肪類物質(zhì)(如膽固醇)在血管內(nèi)壁富集造成動(dòng)脈壁增厚的現(xiàn)象。最新的一項(xiàng)研究通過(guò)給ApoE基因敲除小鼠投喂50 μg·kg-1體重的BPA外加高脂和高膽固醇飲食，經(jīng)過(guò)12周的持續(xù)暴露后發(fā)現(xiàn)，BPA促使主動(dòng)脈動(dòng)脈硬化的損傷面積增長(zhǎng)了1.7倍(P= 0.03)[32]。但在本實(shí)驗(yàn)中，我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BPA暴露后對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的損傷面積造成顯著的影響，這可能還是和BPA的暴露時(shí)間較短有關(guān)。先前的研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)給普通家兔投喂高脂飲食長(zhǎng)達(dá)22周，暴露組的主動(dòng)脈粥樣硬化損傷面積顯著增加，但巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的損傷面積卻沒(méi)有發(fā)生顯著的改變[22]。因此，適當(dāng)延長(zhǎng)暴露時(shí)間是我們將來(lái)的實(shí)驗(yàn)亟需改進(jìn)的重要問(wèn)題。

盡管如此，本研究還是發(fā)現(xiàn)了BPA對(duì)WHHL家兔的心肌細(xì)胞造成了損害，包括心肌細(xì)胞腫脹及脂肪蓄積。脂肪在非脂肪(肝臟、骨骼肌、心臟和腎臟等)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生富集，是機(jī)體脂類代謝異常和脂肪變性的重要表現(xiàn)，并且已有研究證實(shí)脂肪在心肌細(xì)胞中發(fā)生富集和心臟功能障礙及心力衰竭存在關(guān)聯(lián)，這也是導(dǎo)致糖尿病型心肌病的重要原因[33]。因此，在本研究中所發(fā)現(xiàn)的暴露組WHHL家兔的心率發(fā)生改變則很可能和上述心肌細(xì)胞的受損密切相關(guān)。

3.4 BPA對(duì)肝臟中糖類和脂類代謝的影響

肝臟在協(xié)調(diào)機(jī)體糖類和脂類代謝平衡方面起著重要作用，其可通過(guò)儲(chǔ)存或降解肝糖原的方式來(lái)維持血糖的穩(wěn)定。在本實(shí)驗(yàn)解剖前家兔均處于空腹?fàn)顟B(tài)，肝臟將通過(guò)糖原分解和糖質(zhì)新生的方式來(lái)補(bǔ)充血液中葡萄糖的含量，但我們發(fā)現(xiàn)暴露組的家兔由于胰島素抵抗效應(yīng)而使血液中的葡糖糖無(wú)法被肝臟等組織有效轉(zhuǎn)化和利用，因此，和對(duì)照組相比，其肝糖原的分解率也將有所下降，從而造成肝糖原的蓄積量顯著提高[34]。糖原蓄積可促進(jìn)肝臟中的過(guò)氧化物酶體增殖，脂肪酸的合成增加、膽固醇和甘油三酯蓄積，從而誘導(dǎo)脂肪肝的生成[35]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血液中游離脂肪酸含量的升高，有研究表明這將增加脂肪酸向肝臟的遷移和蓄積，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和脂肪肝的生成，并且加速肝細(xì)胞的凋亡[36]。此外，胰島素抵抗常伴隨著炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從免疫和脂肪細(xì)胞釋放的各類調(diào)節(jié)因子也將對(duì)肝臟造成損害，誘發(fā)脂肪肝及其他各類肝臟疾病的發(fā)生[36]。Marmugi等對(duì)CD1雄鼠連續(xù)28 d進(jìn)行不同劑量的BPA飲食暴露后發(fā)現(xiàn)，低劑量的BPA(5～500 μg·kg-1·d-1)可導(dǎo)致肝臟組織中與脂質(zhì)合成有關(guān)的基因mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，脂肪酸的合成增加，膽固醇和甘油三酯蓄積而誘發(fā)脂肪肝[37]。與上述結(jié)果類似，本研究也發(fā)現(xiàn)BPA促使肝臟中和脂類代謝(CEBPA、SREBP1、PPARα)，糖類代謝(GRP94、ATF4)及氧化應(yīng)激(SOD)相關(guān)的基因發(fā)生了顯著上調(diào)，表明BPA可能主要是通過(guò)上述分子機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)脂肪肝及糖原蓄積現(xiàn)象的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明選擇在劑量上具有一定現(xiàn)實(shí)意義的BPA暴露可促進(jìn)WHHL家兔發(fā)生脂類和糖類代謝異常，其毒性效應(yīng)可能和胰島素抵抗及相關(guān)基因的表達(dá)異常密切相關(guān)。這為我們將來(lái)采取有效措施進(jìn)一步控制BPA，特別是在醫(yī)療設(shè)備中的使用，以減少高脂血癥等易感人群的暴露，提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

[1] Vandenberg L N, Chahoud I, Heindel J J, et al. Urinary, circulating, and tissue biomonitoring studies indicate widespread exposure to bisphenol A [J]. Environmental Health Perspective, 2010, 118(8): 1055-1070

[2] Calafat A M, Ye X, Wong L Y, et al. Exposure of the US population to bisphenol A and 4-tertiary-octylphenol: 2003-2004 [J]. Environmental Health Perspective, 2008, 116(1): 39-44

[3] He Y, Miao M, Herrinton L J, et al. Bisphenol A levels in blood and urine in a Chinese population and the personal factors affecting the levels [J]. Environmental Research, 2009, 109(5): 629-633

[4] Walsh B. The perils of plastic [J]. Time, 2010, 175(14): 44-54

[5] Melzer D, Osborne N J, Henley W E, et al. Urinary bisphenol A concentration and risk of future coronary artery disease in apparently healthy men and women [J]. Circulation, 2012, 125(12): 1482-1490

[6] Bae S, Kim J H, Lim Y H, et al. Associations of bisphenol A exposure with heart rate variability and blood pressure novelty and significance [J]. Hypertension, 2012, 60(3): 786-793

[7] Trasande L, Attina T M, Blustein J. Association between urinary bisphenol A concentration and obesity prevalence in children and adolescents [J]. Journal of the American Medical Association, 2012, 308(11): 1113-1121

[8] Rochester J R. Bisphenol A and human health: A review of the literature [J]. Reproductive Toxicology, 2013, 42: 132-155

[9] Alonso-Magdalena P, Vieira E, Soriano S, et al. Bisphenol A exposure during pregnancy disrupts glucose homeostasis in mothers and adult male offspring [J]. Environmetal Health Perspective, 2010, 118(9): 1243-1250

[10] Wei J, Lin Y, Li Y, et al. Perinatal exposure to bisphenol A at reference dose predisposes offspring to metabolic syndrome in adult rats on a high-fat diet [J]. Endocrinology, 2011, 152(8): 3049-3061

[11] Yan S, Song W, Chen Y, et al. Low-dose bisphenol A and estrogen increase ventricular arrhythmias following ischemia-reperfusion in female rat hearts [J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 56: 75-80

[12] Fan J, Watanabe T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models [J]. Pharmacology & Therapeutics, 2003, 99(3): 261-282

[13] Seok J, Warren H S, Cuenca A G, et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013, 110(9): 3507-3512

[14] Hugo E R, Brandebourg T D, Woo J G, et al. Bisphenol A at environmentally relevant doses inhibits adiponectin release from human adipose tissue explants and adipocytes [J]. Environmental Health Perspective, 2008, 116(12): 1642-1647

[15] Vassilopoulos S, Esk C, Hoshino S, et al. A role for the CHC22 clathrin heavy-chain isoform in human glucose metabolism [J]. Science, 2009, 324(5931): 1192-1196

[16] Marrie R A, Yu B N, Leung S, et al. Rising prevalence of vascular comorbidities in multiple sclerosis: Validation of administrative definitions for diabetes, hypertension, and hyperlipidemia [J]. Multiple Sclerosis (Houndmills, Basingstoke, England), 2012, 18(9): 1310-1319

[17] Repas T B, Tanner J R. Preventing early cardiovascular death in patients with familial hypercholesterolemia [J]. The Journal of the American Osteopathic Association, 2014, 114(2): 99-108

[18] Gan S I, Edwards A L, Symonds C J, et al. Hypertriglyceridemia-induced pancreatitis: A case-based review [J]. World Journal of Gastroenterology, 2006, 12(44): 7197-7202

[19] Arnold S V, Rich M. Hyperlipidemia in older adults [J]. Clinics in Geriatric Medicine, 2009, 25: 591-606

[20] Vandentorren S, Zeman F, Morin L, et al. Bisphenol-A and phthalates contamination of urine samples by catheters in the Elfe pilot study: Implications for large-scale biomonitoring studies [J]. Environmental Research, 2011, 111(6): 761-764

[21] Shiomi M, Fan J. Unstable coronary plaques and cardiac events in myocardial infarction-prone Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits: Questions and quandaries [J]. Current Opinion in Lipidology, 2008, 19(6): 631-636

[22] Waqar A B, Koike T, Yu Y, et al. High-fat diet without excess calories induces metabolic disorders and enhances atherosclerosis in rabbits [J]. Atherosclerosis, 2010, 213(1): 148-155

[23] Fang C, Wu X, Huang Q, et al. PFOS elicits transcriptional responses of the ER, AHR and PPAR pathways in Oryzias melastigma in a stage-specific manner [J]. Aquatic Toxicology, 2012, 106: 9-19

[24] Taylor J A, Vom Saal F S, Welshons W V, et al. Similarity of bisphenol A pharmacokinetics in rhesus monkeys and mice: Relevance for human exposure [J]. Environmental Health Perspective, 2011, 119(4): 422-430

[25] Vandenberg L N, Hauser R, Marcus M, et al. Human exposure to bisphenol A (BPA) [J]. Reproductive Toxicology, 2007, 24(2): 139-177

[26] Fang C, Ning B, Waqar A B, et al. Bisphenol A exposure enhances atherosclerosis in WHHL rabbits [J]. PLOS One, 2014, 9(10): e110977

[27] Bornfeldt K E, Tabas I. Insulin resistance, hyperglycemia, and atherosclerosis [J]. Cell Metabolism, 2011, 14(5): 575-585

[28] Samuel V T, Shulman G I. Mechanisms for insulin resistance: Common threads and missing links [J]. Cell, 2012, 148(5): 852-871

[29] Miksztowicz V, Lucero D, Zago V, et al. Hepatic lipase activity is increased in non-alcoholic fatty liver disease beyond insulin resistance [J]. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 2012, 28(6): 535-541

[30] Barter P, Gotto A M, LaRosa J C, et al. HDL cholesterol, very low levels of LDL cholesterol, and cardiovascular events [J]. The New England Journal of Medicine, 2007, 357(13): 1301-1310

[31] Carlsson M, Wessman Y, Almgren P, et al. High levels of nonesterified fatty acids are associated with increased familial risk of cardiovascular disease [J]. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2000, 20(6): 1588-1594

[32] Kim M J, Moon M K, Kang G H, et al. Chronic exposure to bisphenol A can accelerate atherosclerosis in high-fat-fed apolipoprotein E knockout mice [J]. Cardiovascular Toxicology, 2013: 1-9

[33] van Herpen N A, Schrauwen-Hinderling V B. Lipid accumulation in non-adipose tissue and lipotoxicity [J]. Physiology & Behavior, 2008, 94(2): 231-241

[34] Gribble F M, Ashcroft F M. Sulfonylurea sensitivity of adenosine triphosphate-sensitive potassium channels fromcells and extrapancreatic tissues [J]. Metabolism, 2000, 49(10): 3-6

[35] Tao L, Wang W, Li L, et al. Effect of dibromoacetic acid on DNA methylation, glycogen accumulation, and peroxisome proliferation in mouse and rat liver [J]. Toxicological Sciences, 2004, 82(1): 62-69

[36] Bugianesi E, Moscatiello S, Ciaravella M F, et al. Insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Current Pharmaceutical Design, 2010, 16(17): 1941-1951

[37] Marmugi A, Ducheix S, Lasserre F, et al. Low doses of bisphenol A induce gene expression related to lipid synthesis and trigger triglyceride accumulation in adult mouse liver [J]. Hepatology, 2012, 55(2): 395-407

◆

The Effects of Bisphenol A (BPA) Exposure on the Glucose and Lipid Metabolism in WHHL Rabbit

Fang Chao1, Ning Bo2, Fan Jianglin1,2, Dong Sijun1,*

1. Key Lab of Urban Environment and Health, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China 2. Department of Molecular Pathology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering, University of Yamanashi, Yamanashi 409-3898, Japan

31 March 2014 accepted 15 June 2014

In order to use an animal model that is more close to humans to study whether BPA exposure can accelerate the disorders of lipid and glucose metabolism in the setting of hyperlipidemia and explore the underlying toxic mechanisms. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit was selected and exposed to 400 μg·kg-1body weight BPA for 12 weeks by oral gavage. At 8 weeks, the fasting plasma glucose, insulin and lipid levels were detected. The intravenous insulin tolerance test (IVITT) was performed. At 12 weeks, the fasting plasma glucose, insulin and lipid levels were also detected, and the blood pressure and heart rate were analyzed as well. Then all the rabbits were anatomized. The pathological examination of lipid and glycogen accumulation in the heart and liver were observed through hematoxylin-eosin (HE) and periodic acid-schiff (PAS) staining. Meanwhile, the genes expression closely related to lipid and glucose metabolism was analyzed in the liver. Results showed that BPA accelerated insulin resistance in the WHHL rabbit after BPA exposure for 8 weeks, resulting in the increased of fasting plasma glucose and insulin levels at 12 weeks, and the change of some blood lipid levels (HDL-C, LDL-C and NEFA). At 12 weeks, the extent of coronary atherosclerosis lesions was not increased obviously. However, the hypertrophy of cardiac muscle cell was detected and lipid accumulation was observed in the cytoplasm, leading to arrhythmia. The liver weight was increased accompanied by lipid and glycogen accumulation in the hepatocyte. The related genes expression was up-regulated significantly. These results indicated that continuous exposure to BPA can accelerate the disorders of glucose and lipid metabolism in the WHHL rabbit, which may be associated with the insulin resistance and abnormal expression of related genes.

bisphenol A (BPA); WHHL rabbit; metabolic disorders; lipid and glucose accumulation; insulin resistance; genes expression

國(guó)家自然科學(xué)基金(21207127, 21277137, 21477124, 41390240)，寧波市自然科學(xué)基金(2013A610179)，中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金(KLUEH-S-201303)

方超(1984-)，男，博士，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail: cfang@iue.ac.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: sjdong@iue.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20140331001

2014-03-31 錄用日期：2014-06-15

1673-5897(2015)1-252-11

X171.5

A

董四君(1966—)，男，博士，研究員，研究方向?yàn)榄h(huán)境分子毒理、環(huán)境防衛(wèi)醫(yī)學(xué)和天然活性物質(zhì)在健康領(lǐng)域的應(yīng)用，發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇。

方超, 寧博, 范江霖, 等. 雙酚A(BPA)暴露對(duì)WHHL家兔糖類和脂類代謝的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(1): 252-262

Fang C, Ning B, Fan J L, et al. The effects of Bisphenol A (BPA) exposure on the glucose and lipid metabolism in WHHL rabbit [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 252-262 (in Chinese)