賈 薇，胡立華，張沛怡

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150036)

Germlin1與NT-proBNP在肝硬化進(jìn)展過程中的表達(dá)①

賈 薇1，胡立華2，張沛怡2

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150036)

目的：研究Germlin1及NT-proBNP在慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)以及兩者在不同程度肝硬化中的表達(dá)與變化，分析兩者在肝硬化進(jìn)展過程中的作用。方法：分別采用免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè)Germlin1、免疫熒光定量法檢測(cè)NT-proBNP在正常肝臟組織、慢性乙型肝炎以及乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)，以及兩者在肝硬化不同Child-Pugh分級(jí)中的表達(dá)。結(jié)果： Gremlin1及NT-proBNP在正常肝臟組織中的表達(dá)率分別為16.7%、26.7%，在慢性乙型肝炎中的表達(dá)率分別為49.0%、40.8%，在乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)率分別為67.8%、59.3%，差異具有顯著性(P<0.01)；Germlin1在肝硬化Child-PughA、B、C級(jí)中的表達(dá)率分別為38.5%、70.0%、84.0%，三者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NT-proBNP在肝硬化Child-PughA、B、C級(jí)中的表達(dá)率分別為38.5%、50.0%、76.9%，三者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Gremlin1及NT-proBNP之間也呈正相關(guān)。結(jié)論：Gremlin1及NT-proBNP在肝硬化中的表達(dá)顯著增高，且Gremlin1是重要的促肝纖維化因子。Gremlin1及NT-proBNP對(duì)肝纖維化的診斷及預(yù)后判斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

Gremlin1;NT-proBNP;肝纖維化;免疫組化;免疫熒光定量法

Gremlin1屬于BMP拮抗劑家族的成員。慢性肝損傷后的炎癥修復(fù)過程激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)信號(hào)，TGF-βsmad信號(hào)通路活性受到骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)負(fù)向調(diào)節(jié)作用，而TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)gremlin1的表達(dá)起到正向調(diào)控的作用。炎癥時(shí)TGF-β信號(hào)異常增強(qiáng)，上調(diào)gremlin1基因表達(dá)，反饋性的抑制BMPs的功能，并由此進(jìn)一步強(qiáng)化TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而對(duì)纖維化的形成起到加速作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Gremlin1與多種纖維化疾病及腫瘤有關(guān)[1，2]。

B型利鈉肽又稱為腦利鈉肽(B-typenatriureticpeptide，Brainnatriureticpeptide，BNP)，是利鈉肽家族成員之一。具有拮抗肝硬化引起血流動(dòng)力學(xué)及神經(jīng)內(nèi)分泌功能改變的作用。氨基端腦鈉肽前體(NT-proBNP) 是一種前激素原BNP。最近的研究報(bào)道稱NT-proBNP在丙肝病毒感染患者中呈高表達(dá)，其表達(dá)程度與肝纖維化程度成正比[3，4]。因此本研究旨在通過檢測(cè)Gremlin1及NT-proBNP在慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)以及兩者在不同程度肝硬化中的表達(dá)與變化，探討兩者在肝硬化進(jìn)展過程中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 標(biāo)本來源及實(shí)驗(yàn)分組

收集黑龍江省醫(yī)院消化內(nèi)科2012-12～2014-03經(jīng)臨床和肝活檢病理切片確診為慢性乙型肝炎的患者49例、乙型肝炎后肝硬化的患者59例。其中59例乙型肝炎后肝硬化患者按ChildPugh分級(jí)法依次分成ChildPughA級(jí)13例,B級(jí)20例,C級(jí)26例。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組30例，均為無病毒性肝炎及肝硬化等肝臟疾病史，而因肝外傷而行肝臟切除術(shù)患者的肝組織或者由于僅有肝臟血清酶學(xué)改變而行肝穿刺后病理正常的肝臟組織。每例患者均在入院后第二天空腹抽取肘靜脈血1.5mL，置于已經(jīng)加入乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na)溶液的試管中。全部病例必須排除心衰患者。

1.2 主要試劑

Gremlin1抗體、PBS緩沖液、乙二胺四乙酸鈉 (EDTA-Na) 溶液、EDTA抗原修復(fù)液、通用SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。NT-proBNP試劑盒購自美國(guó)ADL公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1Gremlin1檢測(cè)

取肝活檢組織標(biāo)本置于10%甲醛中固定24h，石蠟包埋，制成5μm切片。采用免疫組化SP法檢測(cè)Gremlin1的表達(dá)情況。對(duì)照：以肝癌組織作為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照操作說明，抗原修復(fù)用EDTA抗原修復(fù)液直接煮沸抗原修復(fù)。

2.2 血漿NT-proBNP濃度測(cè)定

早晨空腹抽取肘靜脈血約1.5mL,置于已經(jīng)加入乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na)溶液的試管中,在4h內(nèi)送檢。在TriageMeterPlus全自動(dòng)測(cè)定儀上使用免疫熒光定量法測(cè)定。

2.3 結(jié)果判定

Gremlin1陽性細(xì)胞染色為胞漿出現(xiàn)棕黃色-黃色均勻顆粒。觀察10個(gè)高倍視野計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示( 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))。將陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的結(jié)果分為四個(gè)等級(jí)，≥25%為(-)，25%～50%為(+)，50%～75%為()，> 75%為()。

NT-proBNP血漿濃度的參考范圍在0～125pg/mL。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示有顯著差異性。

3 結(jié)果

3.1Gremlin1在不同肝臟組織中的表達(dá)

Gremlin1表達(dá)的蛋白定位于陽性表達(dá)的細(xì)胞胞漿，呈棕黃色-黃色顆粒，在正常肝臟組織中的表達(dá)率為16.7%(5/30)，在慢性乙型肝炎中的表達(dá)率為49.0%(24/49)，在乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)率為67.8%(40/59)。Gremlin1在三組病例中的表達(dá)具有顯著差異性(χ2=20.828，P=0.000)，見表1、圖1。

3.2NT-proBNP在不同肝臟組織中的表達(dá)

在無肝臟相關(guān)疾病患者血漿NT-proBNP水平平均值為(49.32±7.8)pg/mL、慢性乙型肝炎患者血漿NT-proBNP水平平均值為(85.3±15.23)pg/mL、乙型肝炎后肝硬化患者血漿NT-proBNP水平平均值為(254.48±695.43)pg/mL，表達(dá)率分別為26.7%(8/30)、40.8%(20/49)、59.3%(35/59)，三者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.264，P<0.05)，見表2。

表1 Gremlin1在不同肝臟組織中的表達(dá)及陽性率

圖1 Gremlin1在正常肝臟組織(A)、慢性乙型肝炎(B)及乙型肝炎后肝硬化(C)中的表達(dá)(×400)

組別nPositive(%)χ2P對(duì)照組308(26．7)慢性乙型肝炎4920(40．8)9．264<0．05乙型肝炎后肝硬化5935(59．3)

3.3Gremlin1及NT-proBNP在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分級(jí)中的表達(dá)

Gremlin1在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分級(jí)中的表達(dá)率分別為Child-PughA38.5%(5/13)、Child-PughB70.0%(14/20)、Child-PughC84.0%(21/26)，三者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.173，P<0.05)；血漿NT-proBNP水平在不同ChildPugh分級(jí)間依次增高，其中Child-PughA級(jí)者NT-proBNP均值為(35.48±2.18)pg/mL、Child-PughB級(jí)者NT-proBNP均值為(159.32±10.50)pg/mL、Child-PughC級(jí)者NT-proBNP均值為(413.81±26.75)pg/mL，其表達(dá)率分別為38.5%(5/13)、50.0%(10/20)、76.9%(20/26)，三者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=,6.402，P<0.05)，見表3。

表3 Gremlin1及NT-proBNP在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分級(jí)中的表達(dá)及陽性率

3.4 59例乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1與NT-proBNP表達(dá)的關(guān)系

59例乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1有40例表達(dá)陽性，其中28例NT-proBNP表達(dá)，占70%；另外24例NT-proBNP表達(dá)陰性的乙型肝炎后肝硬化中，12例Gremlin1表達(dá)，占50%。兩者之間具有關(guān)聯(lián)性(χ2=5.869，P<0.05)，并可見二者呈正相關(guān)，見表4。

表4 乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1、NT-proBNP表達(dá)的相關(guān)性

4 討論

肝纖維化是多種慢性肝病所共有的病理改變，是機(jī)體對(duì)各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)[5],是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段[6]。各種常見的致病因子包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、遺傳和代謝疾病、化學(xué)毒物或藥物、肝臟淤血、脂肪肝、寄生蟲病等[7]。在這些致病因素的作用下，靜止期的肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)被激活，同時(shí)增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣母細(xì)胞(Myofibroblast，MF)，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellarmatrix，ECM)。細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失去動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟過度沉積而引起肝纖維化。

Gremlin1基因首先從爪蟾中樞神經(jīng)脊中克隆出來，其編碼的蛋白質(zhì)有三種，分別是gremlin1、gremlin2和gremlin3。其中g(shù)remlin1是一種結(jié)構(gòu)高度保守的分泌型蛋白，定位于染色體 15q13-q15[8，9]，屬于BMP拮抗劑家族的成員。Gremlin1不僅存在于胚胎時(shí)期，也存在于成年動(dòng)物個(gè)體。人體多種組織包括腦、卵巢、大腸以及病理過程中的肝臟、肺組織等都有Germlin1 的表達(dá)，Gremlin1 可能在器官、體征的形成和組織分化中起重要的作用[10]。有充分的依據(jù)表明，Gremlin1是糖尿病腎纖維化主要的促進(jìn)因子[11]，在肺纖維化過程中也起著重要的促進(jìn)作用[12]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Gremlin1與多種纖維化疾病及腫瘤有關(guān)[1，2]。研究表明Gremlin1 也與肝纖維化有關(guān)，是重要的肝纖維化促進(jìn)因子。本研究結(jié)果顯示Gremlin1在正常肝臟組織中的表達(dá)率為16.7%(5/30)，在慢性乙型肝炎中的表達(dá)率為49.0%(24/49)，在乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)率為67.8%(40/59)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有差異性(P<0.01)。Gremlin1的陽性表達(dá)率在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分級(jí)間呈依次增高。檢測(cè)Gremlin1可能對(duì)慢性乙型肝炎向肝纖維化、肝硬化乃至肝癌演變過程的研究具有較高價(jià)值。

B型利鈉肽又稱為腦利鈉肽(B-typenatriureticpeptide，Brainnatriureticpeptide，BNP)，是利鈉肽家族成員之一。在心肺、骨髓、腦等組織中廣泛分布，尤其在心臟中的含量最高。主要由心室肌細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。肝硬化患者處于系統(tǒng)循環(huán)高動(dòng)力狀態(tài)，有潛在誘發(fā)心功能不全的可能。BNP具有擴(kuò)張血管，降低血壓，拮抗腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，促進(jìn)尿鈉排泄、減少水鈉潴留等作用, 從而減輕心臟負(fù)荷,糾正心力衰竭。國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道肝硬化時(shí)血漿BNP水平增高[13]。氨基端腦鈉肽前體(NT-proBNP) 是一種前激素原BNP。NT-pro-BNP較長(zhǎng)的半衰期使其成為反映心室應(yīng)激狀態(tài)的一個(gè)更精確的指標(biāo),是使用最廣泛的心衰生物標(biāo)志物[14]。最近的研究報(bào)道稱NT-proBNP在丙肝病毒感染患者中呈高表達(dá)，其表達(dá)程度與肝纖維化程度成正比[3，4]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NT-proBNP在正常對(duì)照組、慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化表達(dá)率分別為26.7%(8/30)、40.8%(20/49)、59.3%(35/59)，三者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分級(jí)間呈依次增高表達(dá)。表明了NT-proBNP可能參與了肝纖維化的進(jìn)展。

Gremlin1與NT-proBNP可能共同促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心室重塑。肝硬化患者處于系統(tǒng)循環(huán)高動(dòng)力狀態(tài)，有潛在誘發(fā)心功能不全的可能。BNP具有拮抗肝硬化引起血流動(dòng)力學(xué)及神經(jīng)內(nèi)分泌功能改變的作用。TGF-β1是重要的促纖維化因子，可誘導(dǎo)心肌纖維化，導(dǎo)致心室重塑，因此NT-proBNP可能是通過TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與Gremlin1共同促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在59例乙型肝炎后肝硬化標(biāo)本中，Gremlin1陽性表達(dá)40例，NT-proBNP陽性表達(dá)35例，共同陽性表達(dá)28例，共同陰性12例。二者在乙型肝炎后肝硬化中的表達(dá)具有正相關(guān)性，并且在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分級(jí)間均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。提示兩者在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到協(xié)同作用， 兩種因子的聯(lián)合檢測(cè)可能為臨床診治提供更為敏感的無創(chuàng)診斷標(biāo)志，并且采取切實(shí)可行的抗肝纖維化治療，進(jìn)而達(dá)到治療肝硬化、預(yù)防肝癌發(fā)生的可能。

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The expression of Germlin1 and NT-proBNP in the development of liver cirrhosis

JIAWei1,HULi-hua2,ZHANGPei-yi2

(1.The Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;2.The Department of Gastroenterology, the Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150036, China)

Objective: To research the expressions of Germlin1 and NT-proBNP in chronic hepatitis B and hepatitis B cirrhosis, and their expressions and changes in different degrees of liver cirrhosis; and to analysis their roles in the development of liver cirrhosis. Methods: Germlin1 was detected by using the method of immunohistochemical SP staining, and NT-proBNP’s expressions in normal liver tissue, chronic hepatitis B and hepatitis B cirrhosis together with their expressions in different Child-Pugh’s classification of liver cirrhosis were detected by using the method of the Immunofluorescence quantification. Results: The expression rates of Gremlin1 and NT-proBNP in normal liver tissue was 16.7%、26.7%, 49.0%、40.8% in chronic hepatitis B, 67.8%、59.3% in Hepatitis B cirrhosis. The difference was significant(P<0.01).TheexpressionratesofGremlin1inlivercirrhosisChild-PughA,B,C-levelwere38.5%, 70.0%, 84.0%,andtheywerestatisticallysignificantbycomparison(P<0.05).TheexpressionratesofNT-proBNPinlivercirrhosisChild-PughA,B,C-levelwere38.5%, 50.0%, 76.9%,andtheywerestatisticallysignificantbycomparison(P<0.05).Gremlin1andNT-proBNPwerepositivecorrelation. Conclusion: The expressions of Gremlin1 and NT-proBNP in liver cirrhosis increased significantly, and Gremlin1 was an important factor of promote hepatic fibrosis. Gremlin1 and NT-proBNP displayed the potential value in the diagnosis and prognosis of liver fibrosis.

Gremlin1; NT-proBNP; liver Fibrosis; immunohistochemistry; immunofluorescence quantification

賈薇(1987～)女，黑龍江大興安嶺人，在讀碩士研究生，醫(yī)師。

張沛怡(1958～)女，黑龍江哈爾濱人，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:zhangpeiyi@hotmail.com。

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A

1008-0104(2015)02-0128-03

2014-11-20)