魏微微，孟凡石，張世英，魏亞青

(佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003)

Ki-67與RAB5A在胃癌中的表達①

魏微微，孟凡石，張世英，魏亞青

(佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討胃癌中Ki-67與RAB5A在胃黏液腺癌中的表達情況，從分子水平探討Ki-67和RAB5A與胃黏液腺癌分化程度以及浸潤轉(zhuǎn)移的相關性，為胃黏液腺癌的早期診斷和治療提供一種更加敏感和可靠的依據(jù)。方法：應用過氧化物酶標記鏈霉卵白素法(S-P法)來檢測18例印戒細胞癌和42例胃黏液腺癌、22例正常胃黏膜組織中Ki-67和RAB5A蛋白的表達水平及之間的相關性。通過免疫組織化學檢測并結(jié)合患者的性別年齡、腫瘤組織浸潤分化程淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腹膜種植等情況對胃黏液腺癌以及癌旁3.0cm組織和正常組織進行綜合分析。結(jié)果：Ki-67和RAB5A免疫反應陽性細胞為棕黃色，多數(shù)存在于細胞質(zhì)或細胞膜。按照臨床病理分析結(jié)果表明：Ki-67和RAB5A的表達與侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜種植有著密切的關系,而與性別、年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)。侵及漿膜組Ki-67和RAB5A蛋白的陽性表達率分別為89.8%和95.9%，而未侵及漿膜組織Ki-67和RAB5A蛋白的陽性表達率分別為64.3%和57.1%，比較結(jié)果有顯著性差異(P<0.01)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Ki-67與RAB5A蛋白的陽性表達率分別為87.9%和90.9%，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Ki-67與RAB5A蛋白的陽性率為66.7%和63.7%，兩者比較結(jié)果差異顯著(P<0.05)；有腹膜種植的Ki-67和RAB5A蛋白的陽性分別為79.3%和86.2%差異較明顯(P<0.05)，無腹膜種植情況Ki-67和RAB5A蛋白的陽性分別為77.4%和70.9%，差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論：Ki-67和RAB5A可能與胃黏液腺癌的發(fā)生和發(fā)展有密切的關系；胃黏液癌中存在Ki-67和RAB5A表達上調(diào)，臨床上可以通過檢測Ki-67和RAB5A提高胃粘液腺癌早期診斷和早期治療的敏感性。

Ki-67；RAB5A；胃癌；免疫組化

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤中的一種，居全世界腫瘤發(fā)病率和癌癥死亡率的第二位[1]，因胃癌死亡每年大約有70萬人，中國則占其中的42%，嚴重危害到了人類的生活健康。近年來，胃癌的發(fā)病率逐年遞增，采用手術治療、化療、放療以及其他輔助療法效果均不理想。胃黏液腺癌(MucinousGastricCarcinoma，MGC)具有非常強的局部浸潤性，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴散，特別是容易種植轉(zhuǎn)移到腹腔各個器官，是胃癌之中比較少見的病理分型之一[2]。因此，對研究MGC浸潤轉(zhuǎn)移機制和MGC早期診斷治療研究具有重要意義。

MGC的侵襲轉(zhuǎn)移涉及到腫瘤細胞與宿主細胞之間的一系列的相互作用以及某些基因的異常表達，并同時受多種細胞因子的影響和調(diào)控，同時伴有細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的降解，使腫瘤細胞與細胞間黏附松解而解脫出來，通過溶蛋白過程進人周圍的ECM，再進入血管和淋巴管，是一個分為多階段的、多步驟的復雜生物學過程[5，6]。目前，從單一因素抑制胃癌黏液腺癌細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移難以取得理想療效，Ki-67和RAB5A在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的過程中具有協(xié)同效應[7，8]。本研究采用免疫組化S-P法檢測胃黏液腺癌及其癌旁3.0cm組織和正常胃黏膜組織中Ki-67、RAB5A的表達水平，探討二者聯(lián)合因素對胃黏液腺癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的機制，尋求抑制胃癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移提供一種可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和標本制作

收集佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普外科手術切除胃黏液腺癌標本60例其中含有18例印戒細胞癌和22例正常胃黏膜組織的，時間為2012-12～2013-12期間住院患者。選取目標部位用100mmol/L的福爾馬林溶液固定24h后對組織塊進行修整，然后依次放入AF液、酒精、松節(jié)油、浸蠟后再進行包埋處理，修整蠟塊后備用。

1.2 主要試劑及設備

鼠抗人Ki-67單克隆抗體、兔抗人RAB5A單克隆抗體、SPN免疫組化試劑盒、RM-2135型石蠟切片機、BX51型電子顯微鏡、W21-600型電熱恒溫水浴箱、QP-BZ切片漂烘溫控儀等。

1.3 實驗方法

1 蠟塊切片制備2二甲苯脫蠟、梯度酒精、PBS沖洗3阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性4熱修復抗原5加10%正常山羊血清(PBS稀釋)6加適當比例PBS稀釋的一抗7加生物素標記的二抗(1%BSA-PBS1:300稀釋)8加辣根酶標記鏈酶卵白素9DAB顯色，顯微鏡下觀察統(tǒng)一控制顯色時間10蘇木精復染：脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判斷

Ki-67和RAB5A免疫反應陽性細胞為棕黃色，主要存在于細胞質(zhì)或細胞膜。每張切片選擇8個目標高倍視野，根據(jù)Ki-67陽性細胞數(shù)占視野中總細胞數(shù)的百分比分為3級：無陽性著色或陽性細胞數(shù)<10%為陰性(一)；陽性細胞數(shù)在10%～50%為陽性(+)；陽性細胞數(shù)>50%為強陽性()。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行χ2，P<0.05為有明顯差異，P<0.01為有極顯著差異Ki-67、RAB5A之間的相關性用Spearman等級相關分析。

2 結(jié)果

2.1 胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織中Ki-67的表達

Ki-67蛋白陽性染色多數(shù)定位在細胞膜和細胞質(zhì)上，鏡下觀察呈黃色或黃褐色顆粒。Ki-67蛋白主要表達于胃黏液癌細胞胞質(zhì)中。Ki-67在胃癌組織的陽性表達率顯著高于癌旁組織和黏膜組織(P<0.01)。而在癌旁組織和正常黏膜組織中的Ki-67表達均無顯著差異(P>0.05)。Ki-67表達在印戒細胞癌的表達明顯高于黏液癌中的表達，見表1。

表1 胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織中Ki-67的表達

＊與正常組比較P<0.01；▲與癌旁組比較P<0.01。

表2 Ki-67在胃TWIK液癌的表達與臨床病理因素的關系

2.2Ki-67在胃黏液癌的表達與臨床病理因素的關系

Ki-67的表達在胃黏液腺癌的患者中與其性別、年齡、腫瘤大小無關系(P>0.05)，但與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜種植與Ki-67蛋白的表達有緊密關系，見表2。

2.3 胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織中RAB5A的表達

位于細胞漿或細胞膜上RAB5A主要呈陽性染色，鏡下可見呈黃色或黃褐色顆粒，表達呈陽性。在胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織RAB5A的表達，見表3。

表3 胃黏液癌、癌旁組織及正常黏膜組織中RAB5A的表達

＊與正常組比較P<0.01；▲與癌旁組比較P<0.01。

2.4RAB5A在胃黏液癌的表達與臨床病理因素的關系

RAB5A在胃黏液癌中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小都沒有關系(P>0.05)，但與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜種植情況與RAB5A蛋白的表達有緊密關系。RAB5A蛋白的陽性表達率浸及漿膜組織95.9% 、未及漿膜組織57.1%，兩者差異極顯著(P<0.01)；RAB5A蛋白的陽性表達率有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移89.8% 、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63.7%，兩者差異比較顯著(P<0.01)；RAB5A蛋白的陽性表達率有腹膜種植情況86.2% 、無腹膜種植情況70.9%，兩者差異顯著(P<0.05)，見表4。

表4 RAB5A在胃黏液癌的表達與臨床病理因素的關系

2.5Ki-67和RAB5A在胃黏液癌的表達與臨床病理因素的關系

表5 Ki-67、RAB5A表達水平與胃黏液腺癌臨床病理特征的關系

從表5可以看出Ki-67和RAB5A在胃黏液腺癌的表達有所差別，在胃黏液癌中Ki-67和RAB5A的陽性表達率分別為76.2%和85.8%，兩者比較有明顯差異(P<0.05)，RAB5A的陽性表達，對侵及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有腹膜種植情況的胃黏液癌的表達要明顯高于Ki-67的陽性表達。Ki-67的陽性表達，對未侵及漿膜、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無腹膜種植情況的胃黏液癌的表達要明顯高于RAB5A的陽性表達。因此，可以通過檢測Ki-67和RAB5A的蛋白表達提高胃黏液腺癌診斷。

圖1 胃癌組織中Ki-67的表達(SABC 200×)

圖2 胃癌組織中RAB5A的表達(SABC200×)

3 討論

胃黏液癌伴有黏液分泌增多，具有癌性的黏液容易溶解周圍間質(zhì)成分，是胃黏液胃癌侵襲性高的主要原因[9，10]。據(jù)實驗結(jié)果分析表明：在胃黏液癌和印戒細胞癌中Ki-67表達有顯著差異，印戒細胞癌中的表達高于胃黏液癌，這就說明了Ki-67可能是腫瘤分化差的重要標志[14]之一，在未浸及漿膜的胃黏液癌中Ki-67的表達則低于浸潤到漿膜層的表達，這也說明了Ki-67可能與腫瘤的浸潤深度密切有關。而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中Ki-67表達且高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11]，同時說明了Ki-67可能是腫瘤轉(zhuǎn)移進展的標志之一。 腫瘤轉(zhuǎn)移是多步驟而又復雜的過程，腫瘤細胞要發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]首先必須具有破壞周圍基質(zhì)及脈管基底膜屏障的能力。Ki-67作為MMPs家族中的重要成員，是一種促進腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的蛋白水解酶。Ki-67作為降解基膜和細胞外基質(zhì)主要結(jié)構(gòu)的關鍵酶[16]，對惡性腫瘤的發(fā)展起著決定性的作用。Ki-67是在腫瘤組織間質(zhì)細胞中合成的，Ki-67的表達量的增加[3～4]，使基膜和細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)被降解破壞，為腫瘤細胞的移動提供了條件。

據(jù)研究報道表明，在正常胃黏膜組織、癌旁組織及胃黏液癌組織中RAB5A的表達呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢，由此結(jié)果可以得出在胃黏液腺癌的發(fā)生、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[12，13]情況以及腹膜種植情況等都可能與RAB5A的表達增長密切關系。據(jù)實驗結(jié)果分析提示在胃黏液癌和印戒細胞癌中RAB5A表達有顯著性差異，印戒細胞癌中的表達顯著高于胃黏液癌，這就表明RAB5A可能是腫瘤分化差的重要標志之一。在未浸及漿膜的胃黏液癌中RAB5A的表達低于浸潤到漿膜層的表達，這說明了RAB5A可能與腫瘤的浸潤深度有著密切關系。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中RAB5A表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明了RAB5A可能是腫瘤轉(zhuǎn)移進展的標志。

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The research of Ki - 67 and RAB5A expressions in gastric cancer

WEIWei-wei，MENGFan-shi，ZHANGShi-ying，WEIYa-qing

(Clinical School of Medicine, Jiamusi University，Jiamusi 154003,China)

Objective: To study the expression of Ki-67 and RAB5A in mucinous gastric carcinoma. The correlation among Ki-67 and RAB5A and lymph node metastasis in invasive depth and degree of differentiation infiltration of mucinous gastric carcinoma were tested from molecular level, which provides a more sensitive and reliable basis for the early diagnosis and treatment of mucinous gastric carcinoma. Methods: S-P immunohistochemical technique is used to examine the expression and relation of Ki-67 and RAB5A in 42 cases of mucous gastric carcinoma, 18 cases of a signet-ring cell carcinoma and 22 cases of normal gastric tissues. The mucinous gastric carcinoma, 3.0cm adjacent tissue and normal tissues were comprehensively analyzed by immunohistochemical detection combined with gender, age, tumor size, lymph node metastasis in invasive depth, the differentiation of tumor infiltration, and distant metastasis of mucinous gastric carcinoma. Results: The color of the immune positive products of Ki-67 and RAB5A was buffy and mostly located in cytoplasm or plasmalemma. Clinical pathologic analysis results showed that the expressions of Ki-67and RAB5A had no significant differences in age, sex, and the size of tumor (P>0.05).Thelymphnodemetastasisininvasivedepthandthedegreeofdifferentiationhavesignificantdifferencesbetweenmucinousgastriccarcinomaandsignet-ringcellcarcinoma.TherateofpositiveexpressionofKi-67andRAB5Ainserosastratumwas90.1%and96.7%.Butthepositiveexpressionsoutofserosastratumwere64.3%and57.1%.TheexpressionsofKi-67andRAB5Awerehigheringastriccarcinomawithlymphnodemetastasisthanthosewithoutlymphnodemetastasis.Therateofpositiveexpressionwere87.9% , 90.9%and66.7%, 63.7%respectively(P<0.05).TheexpressionofKi-67andRAB5Awere79.3%and86.2%ingastriccarcinomawithPeritonealplanting,andtherateofpositiveexpressionwere77.4%and70.0%,respectively(P<0.05).Ki-67andRAB5AhadnosignificantdifferencesinnoPeritonealplanting(P>0.05).Conclusion: Ki-67 and RAB5A have close relations with the emergency and development of mucous gastric carcinoma. It is raised that there are Ki-67 and RAB5A expressions in gastric carcinoma, which can improve the sensitiveness of stomach mucus gland cancer diagnosing in early days and early treatment through measuring Ki-67 and RAB5A.

Ki-67; RAB5A; mucous gastric carcinoma; immunohistochemistry

魏微微(1980～)男，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，住院醫(yī)師。

R

A

1008-0104(2015)02-0118-04

2014-10-26)