王小全，艾迎春

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

丹參注射液對于急性胰腺炎大鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影響①

王小全，艾迎春

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過對急性胰腺炎大鼠用丹參注射液時血清中NF-κB、TNF-α、IL-6的影響，從而探討丹參對急性胰腺炎的治療的療效及機理。方法：45只清潔的雄性Wistar大鼠被隨機分成為3組：即空白對照組(假手術(shù)組)、疾病模型組(AP組)和藥物治療組(丹參組)。在3h、6h、12h時在各組分別取5只大鼠，采用ELISA法測定并比較大鼠血清中的TNF-α、IL-6及采用WESTERN blotting檢測胰腺組織NF-κBp65蛋白。結(jié)果：將模型組與對照組(假手術(shù)組)比較,TNF-α、IL-6的水平增高,胰腺組織NF-κB蛋白也升高(P<0.05);而治療組(丹參組)上述指標(biāo)與模型組相比均有下降(P<0.05)。結(jié)論：丹參注射液可能通過抑制AP大鼠NF-κB蛋白，從而降低血清中TNF-α、IL-6的濃度水平，控制AP炎癥，從而對急性胰腺炎的治療發(fā)揮作用。

NF-κB;TNF-α;IL-6;AP; 丹參注射液

急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是胰酶提前激活造成胰腺及周圍組織消化所引起的急性炎癥性疾病。其特點為病情嚴(yán)重，死亡率高，至今仍無突破性的治療。常見的致死原因包括全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)，等等，這是不能用傳統(tǒng)的胰腺自身消化理論充分解釋。急性胰腺炎時有炎細胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8)等升高,而且其升高的幅度與急性胰腺炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[1]。且它已經(jīng)通過近幾年的一系列實驗，證明了對局部和全身組織損害相關(guān)的幾種炎癥介質(zhì)(如IL-1，IL-6，TNF-α，等)，而核轉(zhuǎn)錄因子-κB是和這些炎癥介質(zhì)激活有關(guān)的[2]。NF-κB是一種DNA結(jié)合蛋白，在各種炎性及免疫反應(yīng)中，是通過調(diào)節(jié)細胞因子和黏附分子的基因而表達[3]，具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，可參與AP炎性因子的調(diào)控，主要調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6和IL-8等。而丹參注射液的作用可以改善外周循環(huán)、加快微循環(huán)血流速度、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等。

本實驗是采取通過采取逆行胰膽管注射4%的?；悄懰徕c制備成AP模型，分別在3h、6h、12h時進行檢測AP模型組及丹參注射液治療組大鼠血清中的腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)及胰腺組織中的核轉(zhuǎn)錄-κB蛋白水平的變化。探討丹參注射液對急性胰腺炎大鼠的NF-κB表達的影響及TNF-α、IL-6的影響，驗證丹參注射液是否能通過抑制AP大鼠NF-κB蛋白，降低血清中TNF-α、IL-6的濃度水平，控制AP炎癥反應(yīng)，從而對急性胰腺炎的治療發(fā)揮作用。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組

選取45只清潔健康的Wistar大鼠,雄性,體重200～250g,采用統(tǒng)計學(xué)方法將其隨機均分為3組,即空白對照組(假手術(shù)組), 疾病模型組(AP組)和藥物治療組(丹參組)，每組各15只。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立急性胰腺大鼠模型

Wistar大鼠被適應(yīng)性喂養(yǎng)7d,在進行術(shù)前的12h只喂水即禁食不禁水。

對照組只行開腹，對胰腺組織只進行輕柔處理。 模型組，采取由Aho等[4]提出的誘導(dǎo)急性胰腺炎的方法：將4%的牛黃膽酸鈉逆行膽胰管注射。術(shù)前采用10%水合氯醛溶液(0.4mL/100g)進行腹腔注射麻醉，麻醉后，將大鼠在實驗臺上處于仰臥位，并且四肢被固定于實驗臺上，開始準(zhǔn)備：備皮，消毒，鋪巾。在中上腹部即胃區(qū)行正中切開，開腹后沿胃的幽門向下找十二指腸，從而找到胰膽管，將胰膽管進入十二指腸處暴露出來，在胰膽管開口對側(cè)腸壁上用穿刺針行穿刺，進入腸腔后，在使穿刺針穿入胰膽管內(nèi)，再將膽胰管上下端閉合，注入4%?；悄懰徕c(0.1mL/100g)制備AP模型(注射速度0.2mL/min)，持續(xù)3min后，可觀察到胰腺組織的改變即水腫、充血、壞死等，然后使膽胰管恢復(fù)暢通，拔穿刺針，指壓穿刺點，檢查有無漏膽，在進行器官復(fù)位，關(guān)腹后將切口包扎并固定。

治療組，AP制模成功后給予丹參注射液以8g/kg經(jīng)尾靜脈注射。

1.2．2 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo)

各組于3、6、12h時間點各取5只大鼠(1)經(jīng)心臟采血，分離血清后，采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠血清中TNF-α、IL-6。(2)采集胰腺組織NF-κBp65 蛋白表達的分析(Westernblotting檢測)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

造模后分別在3h、6h、12h時，與對照組對比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平與對照組均明顯增高(P<0.01)；與模型組對比，治療組各時間點的大鼠血清中的TNF-α、IL-6水平及胰腺組織中NF-κBp65蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，但并未恢復(fù)到正常水平。見表1～3。

分 組TNF-α 3h 6h 12h對照組(假手術(shù)組)81．40±8．3683．13±7．0186．58±7．65模型組(AP組)218．77±21．23?258．60±21．28?315．41±25．39?治療組(丹參組)189．00±15．05△227．57±18．04△278．54±24．97△

與對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

分 組IL-6 3h 6h 12h對照組(假手術(shù)組)124．45±10．16132．49±11．24139．56±10．50模型組(AP組)188．52±15．93?219．93±17．76?369．47±17．59?治療組(丹參組)163．70±12．68△193．41±15．85△340．07±17．87△

與對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

分 組NF-κB 3h 6h 12h對照組(假手術(shù)組)0．68±0．060．72±0．060．78±0．07模型組(AP組)0．88±0．08?1．04±0．08?1．30±0．11?治療組(丹參組)0．77±0．06△0．91±0．07△1．12±0．10△

與對照組比較*P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

3 討論

丹參為中藥,其性味較苦,微寒,其功效具有活血祛瘀,涼血消癰等作用，是我國的傳統(tǒng)中藥。據(jù)有關(guān)研究均提示，丹參中的成分具有改善外周循環(huán)、加快微循環(huán)血流速度、增加毛細血管網(wǎng)、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、提高低壓條件下肌肉的耐缺氧能力及改善缺血再灌注損傷等作用[5，6]。丹參成分當(dāng)中含有多種抗菌、抗炎成分，而隱丹參酮是丹參的主要成分，且抗菌、抗炎效果也較突出。其對葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型鏈球菌變形桿菌等表現(xiàn)出較強的抑菌作用，而對炎癥引起的腫脹、感染引起的腫脹均具有一定功效，能使腹膜炎的炎癥滲出明顯減少，抑制白細胞游走，從而使中性粒細胞的趨化性明顯降低。而丹參注射液是中藥制劑，丹參酮、丹參素為主要成分，還有多種物質(zhì)成分，其作用主要表現(xiàn)在對活血化瘀、降低血黏稠度及促進和改善微循環(huán)中，從而對炎癥的恢復(fù)有一定的作用[7]。

急性胰腺炎是常見的消化系疾病，目前的發(fā)病機制仍不清楚，導(dǎo)致缺乏適當(dāng)?shù)闹委烝P的治療策略。最關(guān)鍵的一點是胰腺壞死的發(fā)展，往往會發(fā)展為全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，10%～30%近似的死亡率，在重癥急性胰腺炎的大多數(shù)形式的死亡是由于感染和多器官功能障礙綜合征(MODS)。傳統(tǒng)的如胰腺自身消化理論或微循環(huán)障礙理論不能令人滿意地解釋SIRS、MODS的發(fā)生，甚至死亡。然而，最近提出的炎癥介質(zhì)理論為急性胰腺炎的研究提供了新的線索[8]。 正是在這一理論解釋說，在早期階段急性胰腺炎，異常激活胰酶破壞鄰近胰腺細胞，導(dǎo)致局部炎性細胞浸潤。激活的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、胰腺腺泡細胞產(chǎn)生和釋放炎性細胞因子[9]。炎性細胞因子的升高程度與AP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而正是這些炎性細胞因子的導(dǎo)致SIRS和MODS的發(fā)生。目前比較公認的炎性細胞因子有TNF-α和白細胞家族成員(IL-6、10、18)等[10]。急性胰腺炎的炎癥刺激使受累組織和網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一系列的細胞因子,其主要的促炎因子為TNF-α和IL-6,起重要作用表現(xiàn)在炎癥反應(yīng)和器官損害中[11]。NF-κB是一個具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白質(zhì)，可以參與許多炎癥因子的調(diào)節(jié)作用[12]，有5種NF-κB/Rel家族成員在哺乳動物的細胞中：分別是RelA(p65)、RelB、原癌基因c-Rel、NF-κB1(p50/p105)和NF-κB2(p52/p100)[13]。TNF-α和IL-6是受NF-κB的調(diào)節(jié)的，NF-κB是通過所在的NF-κB對TNF-α及IL-6啟動的結(jié)合位點進行調(diào)節(jié)的[14]。經(jīng)研究，活化的NF-κB能導(dǎo)致細胞因子表達增加，如TNF-α，IL-6，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[15]。本實驗結(jié)果表明，模型組(AP組)是造模后3h、6h、12h血中TNF-α、IL-6水平及NF-κB的表達增高且與正常對照組比較，具有差異性意義(P<0.01)，治療組(丹參組)是造模后給予丹參注射液治療后可明顯低于模型組中的大鼠血清中TNF-α、IL-6的水平及NF-κB的表達，具有差異性意義(P<0.05)，提示丹參注射液可能通過抑制AP大鼠NF-κB的活性，從而降低血清中TNF-α、IL-6的濃度水平，控制AP炎癥反應(yīng)，從而對急性胰腺炎的治療發(fā)揮作用。

本研究表明：丹參注射液對急性胰腺炎的治療有一定的作用，其作用機制可能通過抑制AP大鼠NF-κB蛋白，從而降低血清中TNF-α、IL-6的水平，控制AP的炎癥反應(yīng)，其具體機制尚有待進一步研究。

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The effect of Salvia miltiorrhiza injection on NF-kappa B,TNF-α, IL-6 in the serum of rats with acute pancreatitis

WANGXiao-quan，AIYing-chun

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To study the effect of Salvia miltiorrhiza injectionon NF-kB, TNF-α,IL-6 in the serum of rats with acute panc-reatitis,and to explore the effect and mechanism of Salvia miltiorrhiza injection in the treatment of acute pancreatitis. Methods: Wistar rats were randomly divided into three groups: control group(sham group),model group(group AP) and treatment group(group Salvia miltiorrhiza),with 15 in each group.Five rats in each group were selected in 3h, 6h and 12h respectively. The TNF-α,IL-6 in their serum were observed and compared by using the method of ELISA.The NF-kBp65 proteins in pancreatictissue were detected by using Western blotting method. Results:Compared with control group(sham group),the levels of TNF-α,IL-6 in model group(group AP)were increased,and NF-kB expression in pancreatic tissue were increased(P<0.05).Theaboveindexesoftherapygroup(groupSalviamiltiorrhiza)weredecreasedcomparedwiththemodelgroup(P<0.05). Conclusion: Salvia miltiorrhiza injection may reduce the concentration of TNF-α,IL-6 in serum,and control AP inflammation by the inhibition of AP rats NF- kB, which plays a role in treatment on acute pancreatitis.

NF-κB；TNF-α；IL-6；AP；Salvia miltiorrhiza injection

佳木斯大學(xué)科研生科技創(chuàng)新項目，編號：LM2014-014。

王小全(1987～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

艾迎春(1960～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:41006735@qq.com。

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A

1008-0104(2015)01-0058-03

2014-11-19)