聶 磊，王海燕，李春玉，鄒艷紅，王 禹，遲瑛嬌，王 影,趙塔娜，趙冬梅

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦對(duì)癲癇大鼠海馬組織中GFAP及5-HT2A受體表達(dá)的影響①

聶 磊，王海燕，李春玉，鄒艷紅，王 禹，遲瑛嬌，王 影,趙塔娜，趙冬梅

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過建立氯化鋰-匹羅卡品(Li-PILO)誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型，觀察左乙拉西坦(LEV)對(duì)癲癇大鼠海馬組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及5-羥色胺2A(5-HT2A)受體動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明左乙拉西坦的抗癲癇機(jī)制。方法：108只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：生理鹽水組(NS)24只、左乙拉西坦對(duì)照組(LEV)24只、模型組(Li-PILO)30只、模型組+左乙拉西坦組(Li-PILO+LEV)30只，分別給予LEV組和Li-PILO+LEV組大鼠LEV200mg/kg每日1次灌胃，連續(xù)28d。采用RT-PCR方法分別在第7天、第14天、第28天動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠海馬組織中GFAP和5-HT2A受體的表達(dá)。結(jié)果：(1)各組大鼠海馬組織中GFAP表達(dá)水平：與NS組比較，Li-PILO組大鼠海馬組織中GFAP在第7天、第14天、第28天表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)升高更明顯；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組GFAP表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。(2)各組大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達(dá)水平：LEV對(duì)照組與NS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NS組比較Li-PILO組在第7天時(shí)表達(dá)水平降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)降低水平越明顯，即在第14天、第28天5-HT2A受體表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7天、第14天、第28天表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：LVE的抗癲癇作用可能與通過上調(diào)5HT-2A受體的表達(dá)及抑制GFAP的表達(dá)有關(guān)，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

左乙拉西坦；癲癇；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；5-羥色胺2A受體；氯化鋰-匹羅卡品

癲癇是兒童時(shí)期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是腦部的一種慢性疾患，特點(diǎn)是大腦神經(jīng)元反復(fù)發(fā)作性異常放電而引起相應(yīng)的突發(fā)性和一過性腦功能障礙。反復(fù)、持續(xù)的癲癇發(fā)作會(huì)導(dǎo)致患兒的認(rèn)知功能受影響，嚴(yán)重者還有腦水腫和顱內(nèi)壓增高的表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)持久性神經(jīng)精神障礙，從而影響患兒的生活質(zhì)量[1,2]。然而許多抗癲癇藥物會(huì)使患兒的認(rèn)知功能受到不同程度的損害。因此需要尋求一種既有抗癲癇作用又有腦保護(hù)作用的抗癲癇藥物，與其他抗癲癇藥物抗癲癇機(jī)制不同，其他抗癲癇藥物是通過增加腦中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)r-氨基丁酸(GABA)的含量而發(fā)揮抗癲癇作用。而左乙拉西坦抗癲癇機(jī)制獨(dú)特，通過與中樞神經(jīng)元突觸囊泡蛋白結(jié)合而達(dá)到抗癲癇作用。突觸囊泡蛋白主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸囊泡的外分泌的作用，突觸囊泡蛋白基因破壞可導(dǎo)致嚴(yán)重的抽搐和過早死亡。左乙拉西坦(LVE)與突觸囊泡蛋白有很高的結(jié)合能力，結(jié)合后可以與抑制神經(jīng)元異常放電，從而發(fā)揮抗癲癇的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)LVE對(duì)于治療多種癲癇發(fā)作類型有顯著效果并有改善認(rèn)知功能的作用[4]。本課題通過建立氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，初步探討LVE對(duì)癲癇大鼠海馬組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和5-羥色胺2A(5-HT2A)受體表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組[5]

清潔級(jí)的Wistar大鼠108只(由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重約為80～100g，隨機(jī)分為4組。即生理鹽水組(NS)24只、左乙拉西坦組(LEV)24只、模型組(Li-PILO)30只、模型組+左乙拉西坦組(Li-PILO+LEV)30只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和癲癇模型建立

氯化鋰和皮羅卡品(Sigma公司)，左乙拉西坦(UCBS.A.Belgim公司)，RT-PCR試劑盒和引物合成(北京華邁科生物技術(shù)有限公司)。動(dòng)物模型的建立過程參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]并稍有改進(jìn)，將Li-PILO組及Li-PILO+LEV組大鼠先腹腔注射氯化鋰120mg/kg，20h后，再腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，以拮抗外周膽堿能反應(yīng)，30min后再次腹腔注射皮羅卡品80mg/kg，并觀察大鼠的行為。大鼠的癲癇發(fā)作分級(jí)參照RACINE分級(jí)：0級(jí)—無反應(yīng)或抽搐停止；Ⅰ級(jí)—面部抽動(dòng)、咀嚼；Ⅱ級(jí)—面部抽動(dòng)、咀嚼、點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)—面部抽動(dòng)、咀嚼、點(diǎn)頭、前肢或后肢抽動(dòng)；Ⅳ級(jí)—面部抽動(dòng)、咀嚼、點(diǎn)頭、前肢或后肢抽動(dòng)、多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直；Ⅴ級(jí)—全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。在大鼠癲癇發(fā)作30min后，立即腹腔注射地西泮(10mg/kg)終止癲癇發(fā)作。Li-PILO+LEV組在成功建立模型后的4h給予LVE200mg/kg，每日1次，連續(xù)28d，動(dòng)態(tài)觀察并分別于第7天、第14天、第28天提取海馬組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3RT-PCR法檢測(cè)大鼠海馬組織中GFAP和5-HT2A受體的表達(dá)

模型建立28d后，4組大鼠給予10%水合氯醛(0.1mL/kg)麻醉后固定， 斷頭取出海馬組織并立即放在液氮中保存。 海馬組織勻漿后， 加入Trizol液提取mRNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，

將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行Real-timePCR循環(huán)。從NCBI庫(kù)中搜索到GFAP和5-HT2A受體應(yīng)用Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列：GFAP上游：5’GGATGTGATGTGAGGTGTGC3’，下游：5’CCTCGG-GATCTTTTCCTTTC3’；5-HT2A上游：5’GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT3’，下游：5’TGCAGGATTCTTTGCAGATG3’；內(nèi)參GAPDH上游：5’TGCTTCACCACCTTCTTGA3’，下游：5’TCACCATCTTCCAGGAGCG3。擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 觀察大鼠行為學(xué)表現(xiàn)

NS組和LEV組無癲癇發(fā)作。匹羅卡品腹腔注射約5～10min后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，表現(xiàn)為面部抽動(dòng)、點(diǎn)頭、洗臉、前肢陣攣、跌倒、以至全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作，其中Li-PILO組和Li-PILO+LEV組共有9只大鼠抽搐后死亡，癲癇發(fā)作30min后立即給予地西泮(10mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作，在大鼠成功建立模型后，Li-PILO組和Li-PILO+LEV組大鼠表現(xiàn)出易激惹，并可觀察到Ⅰ～Ⅳ級(jí)的癲癇發(fā)作。

2.2 各組大鼠海馬組織中GFAP的表達(dá)

與NS組比較，Li-PILO組大鼠海馬組織中GFAP在第7天、第14天、第28天表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)GFAP表達(dá)水平升高更明顯；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組GFAP表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；LEV組與NS組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 海馬組織中GFAP的相對(duì)表達(dá)量的比較

注：#與NS組比較，P<0.05；*與Li-PILO組比較，P<0.05。

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組

2.3 各組大鼠海馬組織中5HT-2A受體的表達(dá)

NS組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)5-HT2A受體表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與NS組比較，Li-PILO組在第7天時(shí)大鼠海馬組織中5-HT2A受體表達(dá)水平降低，且隨時(shí)間延長(zhǎng)5-HT2A受體表達(dá)水

平明顯降低，即在第14天、第28天5-HT2A受體表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與Li-PILO組比較，Li-PILO+LEV組5-HT2A受體在第7天、第14天、第28天表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表2、圖2。

A：Li-PILO+LEV組；B：Li-PILO組；C：NS組；D：LEV組

分組 第7天 第14天 第28天NS組GFAP0．662±0．1750．678±0．1640．698±0．188LEV組0．638±0．185△0．696±0．212△0．681±0．172△Li-PILO組0．473±0．235#0．338±0．242#0．215±0．086#Li-PILO+LEV組0．526±0．164?0．412±0．139?0．378+0．123?F值 11．27 19．54 33．62P <0．05 <0．05 <0．05

注：#與NS組比較，P<0.05；*與Li-PILO組比較，P<0.05。

3 討論

癲癇是小兒時(shí)期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其特點(diǎn)是自發(fā)、慢性、短暫、反復(fù)發(fā)作。癲癇可引起患兒的人格障礙、記憶力減退、智力低下等表現(xiàn)，尤其是在患兒的發(fā)育早期影響較大[7]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是一種中間絲蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形細(xì)胞[8]。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，有研究證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠釋放谷氨酸，細(xì)胞外谷氨酸攝取80%～90%是通過星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)。GFAP作為細(xì)胞骨架蛋白家族成員之一，在調(diào)節(jié)星形細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及穩(wěn)定神經(jīng)突觸形成過程中起到重要的作用。有研究報(bào)道，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或刺激時(shí)，腦組織中GFAP表達(dá)上調(diào)[9]。蘭莉等[10]通過用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，大鼠癲癇發(fā)作后GFAP星型膠質(zhì)細(xì)胞增多。GarciaAD等[11]研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后大鼠海馬組織中GFAP表達(dá)明顯升高。姜春玲等[12]報(bào)道，紅藻氨酸(KA)癲癇大鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)兩種調(diào)控GFAP基因表達(dá)的結(jié)合蛋白在致癇后的第1天時(shí)表達(dá)升高，3周時(shí)升高更顯著，至3個(gè)月時(shí)仍有較高表達(dá)。目前關(guān)于左乙拉西坦(LVE)對(duì)GFAP表達(dá)的影響，何繪敏等[13]研究報(bào)道，LVE可以抑制大鼠海馬組織中GFAP表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，癲癇發(fā)作后海馬組織中GFAP表達(dá)水平顯著升高，且隨著癲癇發(fā)作時(shí)間的延長(zhǎng)，GFAP表達(dá)水平升高越顯著，應(yīng)用LVE治療后GFAP的表達(dá)水平明顯降低。由此可知，癲癇發(fā)作能夠使GFAP星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，而LVE可以明顯抑制其增生，從而達(dá)到抗癲癇作用。

5-羥色胺(5-HT)是一種吲哚衍生物，是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其主要的作用有參與記憶和學(xué)習(xí)、情緒、食欲、體溫調(diào)節(jié)、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行為、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和抑郁以及肌肉收縮等生理功能[14]。5-HT2A受體是5-HT受體的亞型之一。有研究報(bào)道5-HT2A受體與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，BergKA等[15]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)腦組織中5-HT2A受體數(shù)目明顯減少。然而目前關(guān)于5-HT2A受體與癲癇的關(guān)系國(guó)內(nèi)外暫無報(bào)道，而關(guān)于5-HT與癲癇的關(guān)系報(bào)道很多，5-HT在含有抑制性遞質(zhì)γ氨基丁酸的神經(jīng)元上表達(dá)，從而激活γ氨基丁酸，間接地發(fā)揮其抗癲癇作用。通過本課題研究我們發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠5-HT2A受體表達(dá)水平顯著降低，尤其在第28天時(shí)降低更為顯著，而治療組5-HT2A受體表達(dá)水平明顯升高，提示5-HT2A受體與癲癇有密切的關(guān)系，LVE的抗癲癇機(jī)制可能是通過升高5-HT2A的表達(dá)而發(fā)揮其抗癲癇作用。

綜上所述，GFAP和5-HT2A受體與癲癇有密切的關(guān)系，都參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。LVE的抗癲癇作用可能與通過上調(diào)5HT-2A受體的表達(dá)及抑制GFAP的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題，編號(hào)：2013-230。

聶磊(1977～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

鄒艷紅(1978～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：zyh19784120@163.com。

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1008-0104(2015)02-0026-03

2015-02-02)