劉慧東，李錦蓮，武冬梅

(1. 黑龍江省開拓輻射技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

裂解溫度對(duì)培養(yǎng)板中MCF-7細(xì)胞質(zhì)電化學(xué)信號(hào)的影響①

劉慧東1，李錦蓮2，武冬梅2

(1. 黑龍江省開拓輻射技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究裂解溫度對(duì)培養(yǎng)板中MCF-7細(xì)胞質(zhì)電化學(xué)信號(hào)的影響。方法：循環(huán)伏安法研究裂解溫度對(duì)兩種裂解方式獲得的細(xì)胞質(zhì)電化學(xué)信號(hào)的影響。結(jié)果：50℃為水浴加熱裂解法的最佳溫度，而60℃為烘箱加熱裂解細(xì)胞法的最佳溫度，且50℃為水浴加熱裂解法獲得的細(xì)胞質(zhì)電流強(qiáng)度明顯大于60℃為烘箱加熱裂解法獲得的細(xì)胞質(zhì)電流強(qiáng)度。結(jié)論：50℃水浴加熱裂解法可以作為24孔板中細(xì)胞進(jìn)行電化學(xué)檢測的最佳裂解條件。

電化學(xué)；裂解溫度；MCF-7細(xì)胞

近年來世界上掀起了抗腫瘤藥的開發(fā)熱潮，開發(fā)抗腫瘤藥以及篩選天然的抗腫瘤藥成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)[1～3]，與此同時(shí)，開發(fā)簡捷可行的抗腫瘤藥敏試驗(yàn)方法也成為人們研究的熱點(diǎn)[4～6]。本文以MCF-7細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，研究了細(xì)胞裂解溫度對(duì)24孔培養(yǎng)板中MCF-7細(xì)胞質(zhì)電化學(xué)信號(hào)的影響，為抗腫瘤藥敏電化學(xué)試驗(yàn)方法的建立奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

LK2005恒電位儀，天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；HH.CP-T型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；人乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7，東北林業(yè)大學(xué)贈(zèng)送；優(yōu)級(jí)胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素和青霉素，Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

MCF-7細(xì)胞加適量DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%鏈霉素和1%青霉素)，置37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，均勻接種在8個(gè)24孔板中的B2，B3，B4孔中，每孔補(bǔ)足1mLDMEM培養(yǎng)基，其余孔穴填1mL無菌PBS，培養(yǎng)24h后，用PBS清洗3次，加入適量的pH7.4PBS，分別在40，50，60，70℃下裂解30min，進(jìn)行電化學(xué)檢測。

1.3 電化學(xué)測定條件

三電極體系作為電化學(xué)測試系統(tǒng)：多壁碳納米管和離子液體復(fù)合修飾玻碳電極為工作電極(MWNTs-IL/GCE)，Ag/AgCl絲為參比電極，Pt絲為輔助電極。

循環(huán)伏安掃描范圍為0.0～+1.0V，掃速為0.05V·s-1。除特殊說明外，測定均在室溫條件下進(jìn)行，測定前需要在電位+0.3V下富集360s。每次電化學(xué)測定結(jié)束后，電極均在pH7.4PBS溶液中循環(huán)伏安掃描5圈，即得重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好的更新電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 24孔培養(yǎng)板中MCF-7細(xì)胞質(zhì)的電化學(xué)行為

圖1 24孔板內(nèi)MCF-7細(xì)胞質(zhì)的循環(huán)伏安圖(a)7.4 PBS；(b)24孔板中MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞接種濃度：3.0×105 cells·mL-1

利用電化學(xué)法研究培養(yǎng)于24孔板內(nèi)的MCF-7細(xì)胞，其接種濃度為3.0×105cells·mL-1，在培養(yǎng)18h后，進(jìn)行電化學(xué)檢測，檢測結(jié)果見圖1。MCF-7細(xì)胞質(zhì)(圖1-b)在+0.585V處呈現(xiàn)一個(gè)尖銳的陽極峰，即PeakⅠ，在+0.919V出現(xiàn)一個(gè)陽極肩峰，即PeakⅡ。因?yàn)镻eakⅡ接近高電位窗，受電化學(xué)檢測基線的影響，檢測靈敏度下降，而且24孔板每孔細(xì)胞數(shù)目僅為5×105個(gè)，電化學(xué)檢測的細(xì)胞樣品濃度較低，信號(hào)峰不明顯，因此，不適合用雙信號(hào)電化學(xué)法研究24孔板中MCF-7細(xì)胞質(zhì)的伏安行為，在后續(xù)的研究中，僅PeakⅠ的變化被討論。

2.2 裂解溫度對(duì)24孔培養(yǎng)板中MCF-7細(xì)胞質(zhì)的影響

圖2 加熱裂解溫度對(duì)MCF-7細(xì)胞質(zhì)峰電流PeakⅠ的影響(a)水浴加熱裂解細(xì)胞法；(b)烘箱加熱裂解細(xì)胞法

細(xì)胞加熱裂解是破碎細(xì)胞獲得細(xì)胞質(zhì)的手段之一，而加熱溫度的選擇，對(duì)細(xì)胞質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)有強(qiáng)烈的影響，不同的裂解方式，電化學(xué)信號(hào)受溫度的影響不同。圖2是裂解溫度對(duì)MCF-7細(xì)胞質(zhì)峰電流的影響。在40～50℃內(nèi)，水浴加熱裂解獲得的MCF-7細(xì)胞質(zhì)(圖2-a)的Ip值隨加熱溫度的增加而升高；在50～70℃內(nèi)，Ip值隨加熱溫度的增加而降低；在50℃時(shí)，達(dá)到最大Ip值，故而50℃為水浴加熱裂解法的最佳溫度；在40～60℃內(nèi)，烘箱加熱裂解MCF-7細(xì)胞質(zhì)(圖2-b)的Ip值隨加熱溫度的增加而升高；在60～70℃內(nèi)，Ip值隨加熱溫度的增加而降低；在60℃時(shí)，達(dá)到最大Ip值，故而60℃為烘箱加熱裂解細(xì)胞法的最佳溫度。在40～50℃內(nèi)，水浴加熱裂解法獲得的電化學(xué)信號(hào)明顯強(qiáng)于烘箱加熱裂解法，因此，可以采用水浴加熱裂解法獲得細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行電化學(xué)研究。

3 結(jié)論

不同細(xì)胞裂解方式獲得的細(xì)胞質(zhì)，電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度受溫度的影響不同。在50℃時(shí)，水浴加熱裂解法獲得細(xì)胞質(zhì)檢測到最大電流強(qiáng)度，此條件可以作為24孔板中細(xì)胞進(jìn)行電化學(xué)檢測的最佳裂解條件。

[1]KatariaT,RawatS,SinhaSN,etal.Intensitymodulatedradiotherapyinabdominalmalignancies:ourexperienceinreducingthedosetonormalstructuresascomparedtothegrosstumor[J].CancerResTher, 2006, 2(4): 161-165

[2]TlstyTD,CoussensLM.Tumorstromaandregulationofcancerdevelopment[J].AnnuRevPathol, 2006, 1: 119-150

[3]MarthyaA,PatinharayilG,PuthezethK,etal.Multicentricepithelioidangiosarcomaofthespine:acasereportofararebonetumor[J].Spine, 2007, 7(6): 716-719

[4]武冬梅,胡玲,劉繼光,等.基于MCF-7細(xì)胞質(zhì)伏安行為的電化學(xué)抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)研究[J]. 藥物分析雜志,2011,31(5): 857-861

[5]Wudongmei,Fuguanglei,HuL,etal.StudiesontheoriginofthevoltammetricresponseofthePC-3cellsuspension[J].Talanta，2009, 78(2): 602-607

[6]JTWang,XELi,YZhang,etal.VoltammetricbehavioroftheMCF-7cellcytoplasmandtheeffectoftaxolonvoltammetricresponse,AnalyticalBiochemistry[J].2009,394(2):229-236

Study of influence of cracking temperature on the electrochemical signal of MCF-7 cytoplasm in culture plate

LIUHui-dong1,LIJin-lian2,WUDong-mei2

(1.Heilongjiang Kaituo Radiation Technology Development Company, Harbin 150001, China；2. College of Pharmacy of Jiamusi University，Jiamusi 154007, China)

Objective: To Study the influence of cracking temperature on the electrochemical signal of MCF-7 cytoplasm in culture plate. Methods: cyclic voltammetry is adopted to detect the influence of cracking temperature on the electrochemical signal. Results: The optimum temperature of pyrolysis by Water bath was 50℃ and by bake oven was 60℃.The current of pyrolysis by Water bath was stronger than that by bake oven. Conclusion: The optimum temperature of cell pyrolysis for cell electrochemical detection was 50℃ Water bath.

electrochemistry; pyrolysis temperature; MCF-7 cell

黑龍江省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12511542。

劉慧東(1963～)女，黑龍江哈爾濱人，大專，工程師。

武冬梅(1967～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail:dmwu@jmsu.edu.cn。

R

A

1008-0104(2015)01-0010-02

2014-10-10)