李小萍，汪 敏，趙 楊，丁勝利，李洪連，馬宗斌(.河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河南 鄭州 45000； .河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 45000)

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棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因的分離及敲除載體的構(gòu)建

李小萍1，汪 敏1，趙 楊1，丁勝利1，李洪連1，馬宗斌2
(1.河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450002)

利用分生孢子蘸根法篩選棉花黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體庫，獲得了1個致病力減弱的突變體V546，該突變體在PDA平板上不產(chǎn)生微菌核。利用hiTAIL-PCR技術(shù)，獲得了突變體V546 T-DNA插入的側(cè)端序列。序列比對分析表明，該突變體T-DNA插入位點在大麗輪枝菌基因VDAG_07282.1的編碼區(qū)。

棉花黃萎?。淮篼愝喼?；致病相關(guān)基因；側(cè)端序列；敲除載體

棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)上最重要的病害之一，幾乎遍及全球各主要棉區(qū)，造成嚴重的經(jīng)濟損失[1,2]。大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)是引起棉花黃萎病的主要原因。棉花黃萎病菌作為典型的土傳性病原真菌，該病原菌致病機理復(fù)雜。目前，對其致病機理的研究主要存在堵塞學說[3]和毒素學說[4,5]2種觀點。隨著大麗輪枝菌基因組序列的完成，黃萎病菌致病分子機理及微菌核形成機理的研究取得一定進展[6]。研究表明，真菌里一些保守的信號傳導(dǎo)途徑如cAMP依賴的蛋白激酶A途徑、促分裂原蛋白激酶途徑(MAPK)、感受營養(yǎng)信號的SNF途徑和小GTPase Rac1等，與黃萎病菌的致病力或微菌核的形成有關(guān)[7-11]。TZIMA等[7,8]利用同源重組技術(shù)敲除了大麗輪枝菌cAMP依賴的蛋白激酶A基因VdPKAC1(VerticilliumPKA catalytic subunit)，發(fā)現(xiàn)其與致病性有關(guān)， 而蔗糖非發(fā)酵的蛋白激酶VdSNF1基因(Verticilliumsucrose nonfermenting 1 gene)敲除突變體表現(xiàn)為致病力顯著下降，且細胞壁降解酶活性顯著降低。RAUYAREE等[9]成功敲除了MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的VMK1(VerticilliumMAP Kinase 1)基因，VMK1突變體表現(xiàn)出明顯的致病性下降，且影響微菌核的形成。TIAN[10]研究表明，小GTPase VdRac1與P21活化激酶Cla4(p21 activated kinase Cla4)調(diào)節(jié)黃萎病菌菌絲的極性生長和致病力。敲除后發(fā)現(xiàn)突變體毒性降低，致病力明顯減弱。SANTHANAM[11]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子VdSeg1 是大麗輪枝菌致病性重要的調(diào)控因子，Seg1突變體完全喪失對番茄的致病力。利用正向遺傳學途徑，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建黃萎病菌T-DNA插入突變體庫，篩選致病力減弱或微菌核形成缺陷的突變體，進而分離并鑒定致病相關(guān)基因或微菌核形成相關(guān)基因的功能，是黃萎病菌功能基因組學研究的一種有效途徑。利用該策略，ZHANG[12]篩選黃萎病菌T-DNA插入突變體庫，鑒定VdPR3基因參與菌落生長、微菌核形成、胞外酶活性和毒素的形成。TIAN[13]研究發(fā)現(xiàn)黃萎病菌VdMsb基因與微菌核的形成和毒性有關(guān)，該基因敲除體產(chǎn)孢能力明顯下降。近年來，盡管國內(nèi)外有關(guān)黃萎病菌致病機理研究取得一定進展，但同其他植物病原真菌相比，其致病機理的研究相對滯后。本研究從T-DNA插入突變體庫中篩選出1個T-DNA插入微菌核形成能力喪失且致病力減弱的突變體，利用hiTAIL-PCR方法擴增其側(cè)端序列，構(gòu)建了該基因的敲除載體，為研究該致病基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與質(zhì)粒 供試菌株為河南農(nóng)業(yè)大學植物病理學實驗室前期保存的強致病力落葉型棉花黃萎病菌FGH2菌株及構(gòu)建的黃萎病菌FGH2T-DNA插入轉(zhuǎn)化子菌株[14]；致病基因敲除載體構(gòu)建所用質(zhì)粒為pKOV21，由中國農(nóng)業(yè)大學彭友良教授提供；pMD19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α由河南農(nóng)業(yè)大學植物病理學實驗室自備。

1.1.2 主要試劑與材料 Premix Taq，T4 DNA Ligase和限制性內(nèi)切酶均購自Taraka公司；DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；Ampicillin購自北京索萊寶公司；質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體的致病力測定 致病力測定采用分生孢子懸浮液蘸根法。致病力測定所用的棉花品種為感黃萎病品種銀山1號。將供試棉種催芽，在溫室中進行育苗。將黃萎病菌單孢分離并活化后，將黃萎病菌分生孢子1.0×106個·mL-1涂布在PDA平板上。6 d后，收集待測的棉花黃萎病菌T-DNA 插入突變體和野生型菌株FGH2分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)其濃度至1.0×107個·mL-1。待棉苗長至2片真葉時，挑選根系生長良好的植株進行浸根40 min接種后，移栽至裝有無菌土的紙杯中，25 ℃下培養(yǎng)。每個菌株接種10株棉苗，3次重復(fù)。接種30 d后，按照石磊巖等[15]棉花苗期分級標準進行病情調(diào)查。

棉花苗期葉片分級標準為： 0 級：健株，無癥狀； 1 級：1～2 片子葉發(fā)??； 2 級：1 片真葉發(fā)??； 3 級：2 片以上真葉發(fā)病或脫落僅剩心葉； 4 級：植株生長點或全株枯死。

1.2.2 黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體微菌核形成能力測定及菌落形態(tài)觀察 將篩選獲得的致病力減弱的黃萎病菌T-DNA 插入突變體和野生型菌株FGH2接種于PDA培養(yǎng)基平板上，暗培養(yǎng)1周后，用直徑0.7 cm的打孔器在菌落的邊緣處選取菌餅，置于PDA平板中心，暗培養(yǎng)15 d后對其進行菌落形態(tài)的觀察和分類。根據(jù)突變體的菌落形態(tài)[16]和黑色微菌核的有無將其分為菌核型、菌絲型和中間型3種類型。

1.2.3 黃萎病菌T-DNA插入突變體側(cè)翼序列的獲得 將待測突變體菌株和野生型菌株FGH2接種于Czapek液體培養(yǎng)基中，150 r·min-1培養(yǎng)6 d，收集菌絲，采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。采用hiTAIL-PCR法擴增突變體T-DNA插入位點側(cè)端序列，試驗參照LIU等[17]的方法進行。所用隨機引物序列和特異性引物序列如表1。

1.2.4 PCR產(chǎn)物連接、測序和序列分析 將第3輪PCR產(chǎn)物切膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，藍白斑挑取陽性克隆，以AC1和RB-2b為引物進行測序。獲得的突變體T-DNA插入位點右側(cè)序列與美國BROAD研究所(http://www.broad.mit. edu/)公布的大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌(V.albo-atrum)VaMs.102的基因組序列進行比對分析。

表1 hiTAIL-PCR擴增引物列表Table 1 Primers list used for hiTAIL-PCR

注：LAD1-LAD4 是簡并引物；RB-0b-RB-2b是特異性嵌套引物。M=A/C，R=A/G，W=A/T，S=G/C，Y=C/T，K=G/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T。

Note: LAD1-LAD4 are longer arbitrary degenerate; RB-0b-RB-2b are specific nested primers. M=A/C，R=A/G，W=A/T，S=G/C，Y=C/T，K=G/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T.

1.2.5 黃萎病菌致病相關(guān)基因敲除載體的構(gòu)建

1.2.5.1 黃萎病菌致病相關(guān)基因VDAG_07282.1及上、下游序列的獲得 擴增目標基因上、下游特異引物的設(shè)計：從大麗輪枝菌VDLs.17基因組數(shù)據(jù)庫中，選取基因VDAG_07282.1編碼區(qū)的上、下游1 200 bp的序列，利用 DNAman 軟件設(shè)計擴增基因VDAG_07282.1上、下游序列的引物，并在上、下游引物上加上合適的酶切位點(表2)。

目標基因上、下游序列的獲得：以黃萎病菌FGH2基因組DNA為模板，分別以引物546UP/F和546UP/R擴增基因VDAG_07282.1的上游片段，以引物546DOWN/F和546DOWN/R擴增基因VDAG_07282.1下游片段。擴增體系為：基因組DNA 1 μL，546UP/F(546DOWN/F)1 μL，546UP/R(546DOWN/R)1 μL，Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5.2 中間載體的構(gòu)建 將擴增的上下游PCR產(chǎn)物，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行純化。純化后的上游片段及質(zhì)粒pKOV21用限制性內(nèi)切酶BamHI 30 ℃下酶切12 h后，再加入限制性內(nèi)切酶EcoRI 37 ℃酶切9 h，酶切后回收酶切產(chǎn)物，并通過T4連接酶將上游片段連接到pKOV21上，連接產(chǎn)物命名為p546UPKOV21。

表2 構(gòu)建敲除載體所用引物及引入的酶切位點Table 2 The primers used for a knockout vector and the enzymes introduced from primers

注：下劃線處為酶切位點，波浪線處為保護堿基。

Note:The underline line is for enzyme loci, while the wavy lines are protecting base.

利用潮霉素基因設(shè)計特異引物，用于構(gòu)建載體的檢測(表2)。將p546UPKOV21連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行藍白斑挑選，挑取白色菌落在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖培5～6 h，以546UP/F和HYG/R為引物進行陽性菌液PCR篩選。用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，對構(gòu)建的中間載體p546UPKOV21用BamHI和EcoRI進行雙酶切驗證。

1.2.5.3 敲除載體的構(gòu)建 將下游片段與p546UPKOV21同時用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI 在37 ℃下雙酶切，將酶切產(chǎn)物純化后，利用T4連接酶連接，得到p546KOV21，即為敲除載體。將p546KOV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行藍白斑挑選。挑取白色菌落在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖培5～6 h，以546UP/F和546DOWN/R為引物進行陽性菌液PCR篩選，并將獲得的陽性克隆加甘油保存到-80 ℃。用試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，使用HindIII和KpnI在37 ℃進一步進行雙酶切驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃萎病菌T-DNA 插入轉(zhuǎn)化體的致病力測定

對100個黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化體和野生型菌株利用分生孢子懸浮液浸根接種，測定轉(zhuǎn)化體與野生型的致病性差異。結(jié)果表明,野生型黃萎病菌FGH2在接種12 d后葉片出現(xiàn)典型癥狀，21 d后病情嚴重，30 d大多數(shù)植株葉片脫落成光桿，表現(xiàn)為典型的落葉型癥狀(表3)。大多數(shù)轉(zhuǎn)化體致病力未發(fā)生顯著變化，7%的轉(zhuǎn)化體致病力降低，而轉(zhuǎn)化體V546致病力顯著降低(表3)。同野生型菌株FGH2相比，V546 12 d開始出現(xiàn)典型的黃萎病癥狀，但病情擴展較慢，30 d后僅表現(xiàn)為下部葉片黃化(圖1)。

表3 黃萎病菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子接種銀山1號致病性測定結(jié)果 Table 3 Pathogenicity assays of V.dahliae FGH2 and T-DNA Transformants on cotton Yinshan 1 post inoculation 30 days

圖1 黃萎病菌突變體V546接種30 d癥狀Fig.1 Disease symptoms of cotton plants Yinshan 1 post inoculation 30 days with V.dahliae FGH2 and mutant V546

2.2 棉花黃萎病菌突變體生物學篩選

將致病力顯著減弱的黃萎病菌突變體V546菌餅置于PDA上培養(yǎng)15 d后，突變體V546菌落平鋪，氣生菌絲較少、白色，沒有黑色微菌核產(chǎn)生(圖2)。

2.3 T-DNA插入突變體V546側(cè)端序列擴增

采用hiTAIL-PCR方法擴增突變體V546 T-DNA插入位點的側(cè)端序列。將第2輪和第3輪的擴增的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳圖譜分析，對第2,3輪的條帶大小做比較，理論上第3輪的條帶比第2輪小約70 bp，為本研究所需要的特異性條帶(圖3)。

圖2 野生型FGH2和突變體V546在PDA平板上培養(yǎng)15 d后菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology of FGH2 and mutant V546 grown on PDA plate for 15 days

注： 1.第2輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物；2.第3輪hiTAIL-PCR產(chǎn)物。

Note:1.The secondary hiTAIL-PCR products; 2.The tertiary hiTAIL-PCR products.

圖3 大麗輪枝菌突變體T-DNA側(cè)翼序列 hiTAIL-PCR第2步和第3步產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳
Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns ofV.dahliaemutants T-DNA flanking sequence secondary and tertiary hiTAIL-PCR products.

2.4 黃萎病菌突變體V546T-DNA插入側(cè)翼序列的分析

將擴增的目標片段連接到pMD19-T載體上，經(jīng)PCR篩選后，選擇陽性克隆，送華大基因生物公司測序，測序結(jié)果見圖4。圖4中下劃線序列為T-DNA右側(cè)臂序列。

注：波浪線處為載體序列，下劃線處為比對序列。 Note: The wavy lines indicated vector’s sequence,underline line as gene’s sequence.

將獲得的T-DNA側(cè)翼序列與大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌VaMs.102基因組序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴增得到突變體V546 T-DNA插入位點右側(cè)翼序列大小為112 bp，T-DNA插入位點位于V.dahliaeVdLs.17 菌株的5號染色體16重疊群的289 278 bp處，位于基因VDAG_07282.1的外顯子上(圖5)，該基因編碼一個未知功能蛋白。

圖5 VDAG_07282.1基因的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Gene structure of VDAG_07282.1

2.5 目標基因上下游序列的獲得

以黃萎病菌野生型菌株FGH2基因組DNA為模板，以引物546UP/F和546UP/R擴增出基因VDAG_07282.1的上游片段，大小為1 003 bp。以引物546DOWN/F和546DOWN/R擴增出其下游片段，大小為1 006 bp(圖6)。

2.6 中間載體p546UPKOV21 的構(gòu)建及菌液PCR篩選和酶切驗證

將目標基因的上游片段和質(zhì)粒pKOV21用BamHI和EcoRI雙酶切后用T4連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物p546UPKOV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落搖菌，以546UP/F和HYG/R為引物進行菌液PCR驗證，結(jié)果得到的條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖7)。同時用BamHI和EcoRI進行酶切驗證重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同(圖8)，表明目標基因上游片段已成功連接到pKOV21上。

注：M.DL2000；1.基因上游片段；2.基因下游片段。Note: M.DL2000;1.Gene segments of upstream;2.Gene fragment of the downstream.

注： M.DL10000；1.陰性對照；2～11.p546UPKOV21。 Note: M.DL10000;1.Negative control; 2～11.p546KOV21.

注： M.DL5000；1.BamH I酶切；2.EcoR I酶切；3.雙酶切。Note: M.DL5000;1.BamH I Enzyme digestion results; 2.EcoR I Enzyme digestion results; 3.Double enzyme digestion results.

2.7 敲除載體p546KOV21的構(gòu)建及菌液PCR篩選和酶切驗證

將構(gòu)建的中間載體和目標基因的下游片段同時用HindIII和KpnI進行酶切，然后用T4連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物p546KOV21轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機挑取白色菌落搖菌以546UP/F和546DOWN/R為引物進行菌液PCR驗證，結(jié)果得到的條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖9)。進一步提取陽性菌落重組質(zhì)粒DNA，利用HindIII和KpnI 進行酶切驗證，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相同(圖10)。以上結(jié)果表明基因下游片段已成功連接到p546UPKOV21(圖11)上，線性化后可用于后續(xù)的目標基因敲除轉(zhuǎn)化實驗。

注： M.DL10000；1～11.p546KOV21；12.陰性對照。Note: M.DL10000;1～11.p546KOV21;12.Negative control.

注： M.DL10000；1.Hind III酶切；2.Kpn I酶切；3.雙酶切。Note: M.DL10000; 1.Hind III Enzyme digestion results; 2.Kpn I Enzyme digestion results; 3.Double enzyme digestion results.

圖11 基因敲除載體p546KOV21Fig.11 Gene replacement vector p546KOV21

3 結(jié)論與討論

目前，種植抗病品種是防治植物病害的一種有效措施，但是生產(chǎn)上尚缺乏高抗棉花黃萎病品種[18]。由于田間棉花黃萎病菌是一個致病力高度分化的群體，且致病力容易變異，出現(xiàn)強致病力的類型，以及棉花品種抗病性的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致中國主要產(chǎn)棉區(qū)棉花黃萎病普遍發(fā)生[19]。深入研究黃萎病菌致病及微菌核形成的分子機理，鑒定出控制致病性的關(guān)鍵基因，有助于揭示其致病機制，為防治棉花黃萎病菌新型殺菌劑的設(shè)計和篩選提供候選靶標。

本研究對實驗室構(gòu)建的T-DNA插入轉(zhuǎn)化體庫進行篩選，獲得了1個黃萎病菌突變體V546，該突變體致病力明顯減弱且微菌核形成能力喪失。進一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體T-DNA插入在大麗輪枝菌基因組基因VDAG_07282.1編碼區(qū)，該基因編碼一個未知功能的蛋白。本研究構(gòu)建了該基因的敲除載體，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。在構(gòu)建目標基因敲除載體時，質(zhì)粒pKOV21同時帶有新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，這樣后續(xù)進行黃萎病菌轉(zhuǎn)化時，可以以潮霉素作為陽性篩選標記，篩選出潮霉素陽性的轉(zhuǎn)化子。對篩選的陽性轉(zhuǎn)化子，進一步在新霉素抗性平板上篩選，排除假陽性的異位插入轉(zhuǎn)化子，這樣可以極大提高對目標基因敲除突變體篩選的效率[20]。

[1] 簡桂良，盧美光，仇家山，等．棉花黃萎病防治策略[J]．中國植保導(dǎo)刊，2004，24(4)：30-31．

[2] 徐榮旗，汪佳妮，陳捷胤，等．棉花黃萎病菌 T-DNA 插入突變體表型特征和側(cè)翼序列分析[J]．中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(3)：489-496.

[3] 丁笑生，于廣麗．棉花黃萎病及其抗病育種的研究[J]．生物技術(shù)，2005，15(1)：96-97．

[4] FRADIN E F，THOMMA B P ．Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused byV.dahliaeandV.albo-atrum[J]．Molecular Plant Pathology，2006，7(2)：71-86．

[5] WANG J Y，CAI Y， GOU J Y，et al．VdNEP, an elicitor fromVerticilliumdahliae, induces cotton plant wilting[J]．Applied and environmental microbiology，2004，70(8)：4989-4995．

[6] KLOSTERMAN S J，SUBBARAO K V，KANG S，et al．Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens[J]．PLoS Pathogens，2011，7(7)：e1002137．

[7] TZIMA A K，PAPLOMATAS E J，RAUYAREE P，et al．Roles of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase A in virulence and development of the soilborne plant pathogenVerticilliumdahliae[J]．Fungal Genetics and Biology，2010，47(1)：406-415．

[8] TZIMA A K，PAPLOMATAS E J，RAUYAREE P，et al．VdSNF1, the sucrose nonfermenting protein kinase gene ofVerticilliumdahliae, is required for virulence and expression of genes involved in cell-wall degradation[J]．Molecular plant-microbe interactions，2011，24(1)：129-142．

[9] RAUYAREE P，OSPINA-GIRALDO M D，KANG S，et al．Mutations inVMK1, a mitogen-activated protein kinase gene, affect microsclerotia formation and pathogenicity inVerticilliumdahliae[J]．Current genetics，2005，48(2)：109-116．

[10]TIAN H，ZHOU L，GUO W，et al．Small GTPase Rac1 and its interaction partner Cla4 regulate polarized growth and pathogenicity inVerticilliumdahliae[J]． Fungal Genetics and Biology，2015，74：21-31．

[11]SANTHANAM P，THOMMA B P ．VerticilliumdahliaeSge1 differentially regulates expression of candidate effector genes[J]．Molecular Plant-Microbe Interactions，2013，26(2)：249-256．

[12]ZHANG Y L，LI Z F，F(xiàn)ENG Z L，et al．Isolation and functional analysis of the pathogenicity-related gene VdPR3 fromVerticilliumdahliaeon cotton[J]．Current genetics，2015,61：1-12.

[13]TIAN L，XU J，ZHOU L，et al．VdMsb regulates virulence and microsclerotia production in the fungal plant pathogenVerticilliumdahliae[J]．Gene，2014，550(2)：238-244．

[14]谷素靜，汪 敏，桑 茜，等．棉花黃萎病菌 T-DNA 插入突變體庫的構(gòu)建及致病缺陷突變體篩選[J]．河南農(nóng)業(yè)科學，2014，43(1)：69-73．

[15]石磊巖，王 波，文 學．我國棉花黃萎病菌類型分化及培養(yǎng)特性研究[J]．植物保護學報，1993，20(3)：247-252．

[16]宋曉軒，朱荷琴，郭金城．安陽菌系致病力分化研究[J]．中國農(nóng)業(yè)科學，1997，30(1)：13-18．

[17]LIU Y G，CHEN Y L．High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]．Biotechniques，2007，43: 649-656．

[18]宋學貞，楊國正．棉花抗黃萎病育種研究進展[J]．中國農(nóng)學通報，2013，29(21)：16-22．

[19]林 玲，張 昕，鄧 晟．棉花黃萎病研究進展[J]．棉花學報，2014，26(3):260-267．

[20]LIANG L，LI J，CHENG L，et al．A high efficiency gene disruption strategy using a positive-negative split selection marker and electroporation forFusariumoxysporum[J]．Microbiological research，2014，169(11)：835-843．

(責任編輯：蔣國良)

Isolation of the pathogenicity-related gene fromVerticilliumdahliaeand construction of knockout vector in cotton

LI Xiaoping1, WANG Min1, ZHAO Yang1, DING Shengli1, LI Honglian1, MA Zongbin2
(1.College of Plant Protection, Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China;2.Agronomy College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002，China)

The pathogenicity ofV.dahliaeT-DNA transformants on the cotton variety Yinshan 1 seeding was tested by dipping roots withV.dahliaespore suspension,and a pathogenicity defective mutant V546 was obtained,indicating microsclerotia development defectively on PDA.The T-DNA insertional flanking sequence of mutant V546 was isolated by hiTAIL-PCR，which was integrated in theV.dahliaegeneVDAG_07282.1 coding sequence by genome sequence alignment.

verticillium wilt of cotton;Verticilliumdahliae; pathogenicity-related gene; flanking sequence; knockout vector

2015-05-10

國家自然科學基金項目(30700520)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科技專項(201503109)；河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目(14A210025)；河南省棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助(S2013-07-G04)

李小萍(1988-)，女，河南鶴壁人，碩士研究生，從事植物病原真菌生物學方面的研究。

汪 敏(1974-)，男，河南新縣人，副教授，博士。

1000-2340(2015)06-0787-07

S435.6

A