張敏，沈建明

(1.湖北省醫(yī)學(xué)會(huì)，武漢 430071；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科，十堰 442000)

依達(dá)拉奉減輕大鼠腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激與凋亡作用

張敏1，沈建明2

(1.湖北省醫(yī)學(xué)會(huì)，武漢 430071；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科，十堰 442000)

目的 觀察依達(dá)拉奉對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將傳代培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)分為對(duì)照組、模型對(duì)照組(50 μmol·mL-1順鉑)、給藥組A(50 μmol·mL-1順鉑+10 μmol·mL-1依達(dá)拉奉)、給藥組B(50 μmol·mL-1順鉑+20 μmol·mL-1依達(dá)拉奉)和給藥組C(50 μmol·mL-1順鉑+40 μmol·mL-1依達(dá)拉奉)，檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、活性氧(ROS)水平、細(xì)胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)以及Caspase-3活性。結(jié)果 順鉑刺激NRK-52E細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力下降，MDA含量和ROS水平升高，SOD活性下降，細(xì)胞凋亡增加，Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)增多，Caspase-3活性升高。依達(dá)拉奉可以提高細(xì)胞增殖能力，降低MDA含量，降低ROS水平，增強(qiáng)SOD活性，減少細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bax蛋白和 mRNA表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 蛋白和mRNA表達(dá)，降低Caspase-3活性(P<0.05)。結(jié)論 依達(dá)拉奉通過減輕氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡而減輕順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷。

依達(dá)拉奉；順鉑；損傷，腎；氧化應(yīng)激；凋亡，細(xì)胞

順鉑是臨床常用化學(xué)治療(化療)藥物，由于其對(duì)癌細(xì)胞缺乏選擇性，而且進(jìn)入機(jī)體后主要通過腎臟排泄，所以其腎毒性明顯。如何防治順鉑造成的腎損傷是亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑造成腎損傷的病理生理過程中，腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡具有重要作用[1]。作為氧自由基清除藥，依達(dá)拉奉可以減輕急性腦梗死患者發(fā)生急性腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)[2]。筆者在本研究中通過體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，在應(yīng)用順鉑造成細(xì)胞損傷的同時(shí)予以依達(dá)拉奉干預(yù)，以觀察依達(dá)拉奉對(duì)順鉑誘導(dǎo)大鼠腎小管細(xì)胞損傷的影響并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；依達(dá)拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，批號(hào)：80-131111)，順鉑(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20100123)，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM，批號(hào)：11965-092)和胎牛血清(批號(hào)：120921)購自美國Gibco公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號(hào)：20121217)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號(hào)：20121215)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)熒光探針氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯[5-(and-b)-chloromethyl-2',7'-dichorodihydrofluorescein diacetate, acetylester,CM-H2DCFDA，批號(hào)：D12058]購自Molecular Probes公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20121013)購自南京凱基公司，兔抗大鼠Bax、Bcl-2單克隆抗體(批號(hào)：SC7780，BA1437)購自北京中山生物技術(shù)公司，RNA提取試劑Trizol(批號(hào)：1175563)購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(批號(hào)：998697)購自杭州博日公司，PCR引物由上海英駿生物公司合成，Caspase-3活性試劑盒(批號(hào)：20120815)購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 NRK-52E細(xì)胞用培養(yǎng)液于含5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，0.25%胰蛋白酶消化，1：3傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)，改用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使其同步化。取對(duì)數(shù)生長期NRK-52E細(xì)胞分為5組：對(duì)照組、模型對(duì)照組(順鉑50 μmol·mL-1)、給藥組A(順鉑50 μmol·mL-1+依達(dá)拉奉10 μmol·mL-1)、給藥組B(順鉑50 μmol·mL-1+依達(dá)拉奉20 μmol·mL-1)、給藥組C(順鉑50 μmol·mL-1+依達(dá)拉奉40 μmol·mL-1)。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，順鉑和依達(dá)拉奉劑量參考文獻(xiàn)[3-4]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 按上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，培養(yǎng)板每孔加四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium salt，MTT，5 mg·mL-1)工作液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)100 μL，振蕩混勻10 min。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長490 nm處各孔吸光度(A值)，各組細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.3.2 細(xì)胞MDA含量和SOD活性檢測(cè) 按上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h，0.25%胰酶消化細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗3次，加細(xì)胞裂解液100 μL裂解細(xì)胞，4 000 r·min-1離心，取上清液，Brad ford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，按試劑盒說明書操作，化學(xué)比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 按上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h后，滴加CM-H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min，吸除染液，PBS洗滌細(xì)胞3次，應(yīng)用FLUOstar熒光定量儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，用以反映ROS水平。

1.3.4 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 按上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h，取細(xì)胞1 mL(細(xì)胞密度1×109個(gè)·L-1)，800 r·min-1、4 ℃離心后，棄去上清液。預(yù)冷PBS漂洗，將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中。加入AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μL混勻，篩網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 按上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，破碎后樣品經(jīng)低溫離心，取上清液測(cè)定蛋白含量，Western blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)；β-actin內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光，膠片顯影定影，Quatity One軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 按上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量及純度。引物設(shè)計(jì)參照Premier 6.0設(shè)計(jì)，β-actin上游引物5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物5′- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段227 bp。Bax上游引物5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′，下游引物5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段135 bp。Bcl-2上游引物5′-CCTGGCATC-TTCTCCTT-3′，下游引物5′-ACATCTCCCTGTTGACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段355 bp。退火溫度分別為58，55.1和49.7 ℃，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算目的基因與內(nèi)參照基因A值的比值。

1.3.7 細(xì)胞Caspase-3活性檢測(cè) 上述分組加入處理因素培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，破碎后樣品經(jīng)低溫離心，取上清液測(cè)定蛋白含量，與P硝基苯胺反應(yīng)，比色法在波長405 nm處測(cè)A值表示Caspase-3活性。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖能力的影響 模型對(duì)照組細(xì)胞生長抑制率(46.27±9.76)%。與模型對(duì)照組比較，給藥組A、給藥組B和給藥組C細(xì)胞生長抑制率[分別為(34.33±8.34)%，(23.88±5.73)%和(13.43±6.16)%]均降低(F=18.20，P<0.05)。

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)NRK-52E細(xì)胞MDA含量和SOD活性的影響 對(duì)照組以蛋白質(zhì)為單位的MDA含量為(6.24±1.33) nmol·mg-1，模型對(duì)照組MDA含量[(12.79±2.73) nmol·mg-1]較對(duì)照組高；給藥組A、給藥組B和給藥組C MDA含量[分別為(11.05±1.71)、(9.93±1.91)和(8.25±1.88)nmol·mg-1]均較模型對(duì)照組低(F=8.26，P<0.05)。對(duì)照組以蛋白質(zhì)為單位的SOD活性(74.62±5.83)U·mg-1，模型對(duì)照組SOD活性[(43.52±6.94)U·mg-1]較對(duì)照組低；給藥組A、給藥組B和給藥組C SOD活性[分別為(52.38±7.75)，(60.26±6.74)、(65.67±7.32)U·mg-1]均較模型對(duì)照組高(P<0.05)。

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)NRK-52E細(xì)胞ROS水平的影響 對(duì)照組熒光強(qiáng)度為(3.1±0.6)，模型對(duì)照組熒光強(qiáng)度(13.6±2.1)較對(duì)照組升高，給藥組A、給藥組B和給藥組C的熒光強(qiáng)度[分別為(11.5±2.0)，(8.9±1.8)，(7.1±1.5)]均較模型對(duì)照組低(P<0.05)。

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(6.33±0.38)%，模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡率[(38.41±1.59)%]較對(duì)照組高，給藥組A、給藥組B和給藥組C細(xì)胞凋亡率[分別為(32.17±1.65)%，(27.63±1.56)%和(21.58±1.32)%]均較模型對(duì)照組降低(P<0.05)(圖1)。

2.5 依達(dá)拉奉對(duì)NRK-52E細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組Bax蛋白和mRNA的表達(dá)分別為 0.21±0.04，0.46±0.05；模型對(duì)照組Bax蛋白(0.89±0.23)和mRNA(1.96±0.56)表達(dá)均較對(duì)照組增加；給藥組A、給藥組B和給藥組C的Bax蛋白[分別為(0.77±0.10)，(0.53±0.08)，(0.43±0.07)]和mRNA[分別為(1.70±0.33)，(1.46±0.24)，(0.89±0.13)]表達(dá)均較模型對(duì)照組低(F=23.71，18.99，P<0.05)；對(duì)照組Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)分別為(0.29±0.08)，(0.54±0.03)，模型對(duì)照組Bcl-2蛋白(0.39±0.09)和mRNA(0.70±0.09)均較對(duì)照組增加；給藥組A、給藥組B和給藥組C的Bcl-2蛋白[分別為(0.52±0.11)，(0.63±0.12)，(0.74±0.17)]和mRNA[分別為(0.89±0.15)，(1.22±0.17)，(1.48±0.29)]均較模型對(duì)照組高(F=15.57，23.52，P<0.05)(圖2，圖3)。

2.6 依達(dá)拉奉對(duì)NRK-52E細(xì)胞Caspase-3活性的影響 對(duì)照組Caspase-3活性為(0.07±0.03)，模型對(duì)照組Caspase-3活性(0.51±0.11)較對(duì)照組高，給藥組A、給藥組B和給藥組C的Caspase-3活性[分別為(0.40±0.09)，(0.32±0.08)和(0.24±0.07)]均較模型對(duì)照組低(P<0.05)。

3 討論

順鉑是一種鉑類抗癌藥物，對(duì)部分腫瘤有較好療效[5]。但在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，因順鉑化療而導(dǎo)致腎損害的發(fā)生率高達(dá)20%～30%[6]，順鉑對(duì)腎臟的損傷主要表現(xiàn)在腎小管損傷。與QI等[3]報(bào)道相似，本研究將大鼠NRK-52E細(xì)胞和順鉑一同培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)NRK-52E細(xì)胞增殖能力降低，也說明順鉑可以引起腎小管上皮細(xì)胞損傷。

病理情況下，順鉑可以損害線粒體呼吸鏈的正常電子傳遞，導(dǎo)致ROS生成過多，進(jìn)而引起更加劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重細(xì)胞損傷。國外研究顯示，在順鉑腎損傷大鼠模型中，腎組織SOD活性降低，MDA含量升高[7]，將順鉑和豬腎小管上皮細(xì)胞一起培養(yǎng)，細(xì)胞ROS水平明顯升高[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，順鉑可以引起大鼠NRK-52E細(xì)胞MDA含量升高，SOD活性下降，ROS水平升高，進(jìn)一步說明氧化應(yīng)激參與順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷。研究顯示，順鉑可以引起人腎小管上皮細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-3活性升高，細(xì)胞凋亡顯著[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)順鉑引起NRK-52E細(xì)胞凋亡增多，Bax和Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)增加，caspase-3活性增強(qiáng)。

依達(dá)拉奉是目前常用于治療腦梗死的自由基清除藥[10]，在過氧化氫誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞損傷模型里，依達(dá)拉奉可以具有拮抗氧化應(yīng)激、降低ROS水平、下調(diào)Bax表達(dá)、上調(diào)Bcl表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡、減輕細(xì)胞損傷的作用[11]。本研究給予依達(dá)拉奉干預(yù)后，大鼠NRK-52E細(xì)胞增殖能力升高，說明依達(dá)拉奉可以減輕順鉑造成的腎小管上皮細(xì)胞損傷。同時(shí)給藥組腎小管上皮細(xì)胞MDA含量降低、SOD活性增強(qiáng)、ROS水平下降，說明依達(dá)拉奉可以減輕順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)；而給藥組腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少，Bax 蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白和 mRNA表達(dá)上調(diào)，Caspase-3活性減弱，證明依達(dá)拉奉通過下調(diào)促凋亡基因表達(dá)和上調(diào)抗凋亡基因表達(dá)，抑制Caspase-3活化，進(jìn)而抑制順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。而國外研究也證實(shí)，通過抑制氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，可以減輕順鉑造成的腎小管上皮細(xì)胞損傷[12-13]。

圖1 5組NRK-52E細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果

圖2 5組NRK-52E細(xì)胞Bax與Bcl-2蛋白表達(dá)情況

Fig.2 Protein expression of Bax and Bcl-2 in five groups of NRK-52E cells

圖3 5組NRK-52E細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)情況

Fig.3 mRNA expression of Bax and Bcl-2 in five groups of NRK-52E cells

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依達(dá)拉奉可通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.007

Protection of Edararone on Oxidative Stress and Apoptosis 40 Renal Tubular EpithelialCells in Rats

ZHANG Min1， SHEN Jianming2

(1.HubeiMedicalAssociation，Wuhan430071，China；2.DepartmentofNephrology，RenminHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

Objective To investigate the protective effect and its mechanism of edaravone against rat renal tubular epithelial cell injury induced by cisplatin. Methods The rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E) were divided into the control， model control (50 μmol·mL-1cisplatin), group A (50 μmol·mL-1cisplatin plus 10 μmol·mL-1edaravone), B (50 μmol·mL-1cisplatin plus 20 μmol·mL-1edaravone), and C (50 μmol·mL-1cisplatin plus 40 μmol·mL-1edaravone).The cell proliferation ability, content of malondialdehyde, activity of superoxide dismutase(SOD), level of reactive oxygen species(ROS), rate of apoptosis, express of protein and mRNA of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 activation of cell were detected. Results The proliferation and SOD activity in NRK-52E cells declined, malondialdehyde and ROS were elevated upon being co-cultured with cisplatin.Moreover, the rate of apoptosis, express of protein and mRNA of Bax and Bcl-2, and Caspase-3 activation of cells were upregulated compared to the control group.However, edaravone stimulated cell proliferation, SOD activity and protein and mRNA of Bcl-2 and lowered content of malondialdehyde, level of ROS, rate of apoptosis, express of Bax protein and mRNA and Caspase-3 activation of cell(P<0.05). Conclusion Edaravone can alleviate rat renal tubular epithelial cell injury induced by cisplatin, via inhibiting oxidative stress and down-regulating cell apoptosis.

Edaravone；Cisplatin；Injury,renal；Oxidative stress；Apoptosis, cell

2014-09-19

2014-10-22

張敏(1976-)，女，湖北十堰人，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤疾病研究。E-mail：zhminhb@sina.com。

沈建明(1975-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腎臟病專業(yè)研究。E-mail：shmushjm@hotmail.com。

R692.5；R969

A

1004-0781(2015)07-0875-04