阮麗萍， 劉 健， 葛 瑤， 萬 磊， 王亞黎， 葉文芳

1安徽中醫(yī)藥大學研究生部，合肥 230038

2安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科，合肥 230031

骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨PI3K／Akt－mTOR及Beclin－1自噬通路的表達及相關(guān)性分析＊

阮麗萍1， 劉 健2△， 葛 瑤2， 萬 磊2， 王亞黎1， 葉文芳1

1安徽中醫(yī)藥大學研究生部，合肥 230038

2安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科，合肥 230031

目的 觀察骨關(guān)節(jié)炎（OA）大鼠軟骨自噬基因（Atg5、Atg7、Atg12）以及自噬相關(guān)蛋白mTOR、Beclin－1、PI3K、Akt、LC3－Ⅱ的表達，并分析其與IL－4、IL－10、IL－1β、TNF－α的相關(guān)性。方法 20只大鼠隨機分為正常組和模型組，每組各10只。模型組大鼠采用關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶（Papain）和L－半胱氨酸（L－cystine）方法制成骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型。以光鏡對大鼠軟骨進行Mankin標準評分，以電鏡觀察OA大鼠軟骨中自噬小體的形態(tài)及數(shù)目；采用熒光定量PCR檢測軟骨Atg5、Atg7、Atg12的表達，采用免疫印跡法（Western blot）檢測軟骨m TOR、Beclin－1、PI3K、Akt、LC3－Ⅱ的表達，采用ELISA法檢測血清細胞因子IL－4、IL－10、IL－1β、TNF－α水平。結(jié)果 與正常組大鼠比較，OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分明顯升高（P＜0.01）；Atg5在軟骨中降低（P＜0.01），并與IL－4、IL－10呈正相關(guān)（均P＜0.01），與IL－1β、TNF－α呈負相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；Atg7在軟骨中降低（P＜0.01）；m TOR在軟骨中升高（P＜0.05），PI3K、Akt在軟骨中均升高（均P＜0.01），并與IL－4、IL－10呈負相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），與IL－1β、TNF－α呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；LC3－Ⅱ、Beclin－1在軟骨中降低，與IL－4、IL－10呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），與IL－1β、TNF－α呈負相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 OA大鼠軟骨在Mankin評分升高的同時，出現(xiàn)Atg5及Atg7表達的降低，PI3K／Akt－m TOR通路上調(diào)，Beclin－1下調(diào)，自噬受抑制，此過程可能參與OA軟骨病變。

骨關(guān)節(jié)炎； 自噬通路； 細胞因子

骨關(guān)節(jié)炎一直被認為是一種退行性疾病，常見于老年人，多累及膝、髖等負重關(guān)節(jié)，以疼痛、僵硬、功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，呈慢性進展，常嚴重影響患者生活質(zhì)量，總患病率為15.6%～17.5%［12］。

目前研究認為，骨關(guān)節(jié)炎是力學與生物學因素共同作用的結(jié)果，主要涉及的機制是關(guān)節(jié)軟骨、細胞外基質(zhì)、軟骨下骨的合成和降解紊亂。在生理狀態(tài)下，軟骨細胞的分解代謝和合成代謝處于平衡狀態(tài)，維持軟骨細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性，而細胞因子可以維持軟骨細胞這種平衡，也可以破壞這種平衡［3］。IL－1β、TNF－α與IL－4、IL－10是兩對經(jīng)典的炎性細胞因子，對其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的研究相對較為成熟。自噬是機體的一種穩(wěn)態(tài)機制，主要通過吞噬細胞內(nèi)受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，釋放原料，以供新的能量和新的物質(zhì)的生成。自噬在免疫和炎癥以及抵抗微生物感染中起著至關(guān)重要的作用［45］。本研究旨在通過觀察骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨中Atg、自噬相關(guān)蛋白的表達以及外周血IL－1β、TNF－α、IL－4、IL－10的變化，并進行相關(guān)性分析，從而初步探討自噬在骨關(guān)節(jié)炎中與免疫反應的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級（SPF）雄性Wistar大鼠20只，鼠齡5～6月，體質(zhì)量（200.0±25.5）g，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK（皖）2011－002。隨機分為正常組和模型組，每組各10只。清潔級標準飼養(yǎng)，供試前常規(guī)飼養(yǎng)7 d，24 h明暗周期為12 h／12 h，觀察無異常者入組實驗。

1.2 實驗材料

木瓜蛋白酶、L－半胱氨酸（美國MERK公司，批號:MB3052；MB4036）；IL－4、IL－10、IL－1β、TNF－α ELISA試劑盒（上海源葉生物，批號:1307184R，1307415R，1306714R，1305176R）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號:15596－026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司，批號:00145205）；引物及探針合成（美國Invitrogen公司）；LC3－Ⅱ（美國SANTA生物技術(shù)公司，批號:Sc－271625）；Beclin－1（Abcam生物技術(shù)公司，批號:ab62472）；PI3K（美國Bioworld生物技術(shù)公司，批號:bs－3006）；p－Akt1／2／3（美國Bioworld生物技術(shù)公司，批號:BS1810）；mTOR（美國Bioworld生物技術(shù)公司，批號:bs－3611）。

1.3 實驗設(shè)備

酶標儀（雷杜:RT6000）；洗板機（美國Bio－TEK公司，型號:ELX50）；PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司，型號:K960）；電泳儀（Tanon EPS 300型）；高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司JW－3021 HR）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Thermo PIKOREAL 96）；組織石蠟包埋機（德國LEICA公司，型號:A130395）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號:BX41）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi Limited公司，型號:JEM－1230）；切片機（瑞典，型號:LKB－NOVA型）。

1.4 實驗方法

1.4.1 膝骨關(guān)節(jié)炎模型復制 方法參見文獻［6］，向模型組大鼠右膝關(guān)節(jié)注射4%木瓜蛋白酶溶液與0.03 mol／L的L－半胱氨酸溶液混合液20μL，于第3、7天加強，制成骨關(guān)節(jié)炎模型。

1.4.2 病理觀察 造模第49天，處死動物，切開右膝關(guān)節(jié)，大體觀察關(guān)節(jié)有無積液，軟骨表面情況、光澤及光滑度。取3～6塊脛骨內(nèi)側(cè)、脛骨外側(cè)處標本。所取標本全部以10%中性甲醛溶液固定72 h，于10%硝酸混合液（10%硝酸＋10%中性甲醛＋60%雙蒸水）中脫鈣48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片。蘇木精－伊紅（HE）染色后，根據(jù)Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標準［7］進行分級評定。

1.4.3 ELISA法檢測OA大鼠外周血IL－4、IL－10、IL－1β、TNF－α 具體流程如下:①向已包被有特異抗體的塑料板凹孔內(nèi)加50μL血清；②加50μL生物素標記的第二抗體，室溫下孵育1～2 h，用洗板機洗3次；③加10μL鏈親合素標記的辣根過氧化物酶，室溫下孵育0.5～1 h，用洗板機洗3次；④加100μL終止液，室溫下孵育0.5～1 h；⑤用酶標儀測量吸光度，換算為抗原的含量。

1.4.4 實時熒光定量PCR法檢測軟骨自噬相關(guān)基因 提取RNA，RT反應:①在0.2 m L EP管中，加入總RNA（質(zhì)量為3μg）、10μmol／L Oligo（d T）1 μL、DEPC水補足至12μL，輕輕混勻、點動離心；②PCR儀上65℃加熱5 min，立即冰浴3 min；③在上述EP管中加入5×反應緩沖液4.0μL、10 mmol／L d NTP Mix 2μL、核糖核酸酶抑制劑1μL、TMMMu LV反轉(zhuǎn)錄酶1μL；④42℃60 min，70℃5 min；⑤取出上述反應液，即為cDNA，－80℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR反應:取出上述反應液1μL作為熒光定量的模板，反應體系如下:2×實時定量熒光PCR預混物5μL；正向引物，10μmol／L 1μL；反向引物，10μmol／L 1μL；模板DNA 1μL；核糖核酸酶游離水2μL，反應總體積為10μL。反應條件如下:95℃5 min（步驟一），95℃10 s（步驟二）；60℃30 s（步驟三）。步驟二和三40個循環(huán)。各引物的序列及長度見表1。

本次實驗所使用的分析方法為:相對定量分析，所采用的指標為:2－ΔΔCt。

表1 Atg引物序列與預擴增長度Table 1 Pre－amplification primer sequence and length of Atg

1.4.5 Western blot檢測軟骨m TOR、Beclin－1、PI3K、Akt、LC3－Ⅱ 具體實驗步驟如下:組織勻漿，提取蛋白質(zhì)，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗二抗孵育參考說明書，室溫封閉2 h。加入洗滌液（TBST），每次洗滌10 min，共洗滌3次。蛋白檢測:參考相關(guān)說明書，使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。采用Image J軟件進行分析。

1.4.6 透射電鏡觀察軟骨細胞自噬情況 ①取軟骨組織1 mm3大小。固定于2.5%戊二醛（4℃）4～6 h；②PBS（p H7.2）洗2～12 h；③將組織后固定于1%鋨酸1 h；④30%、50%乙醇脫水各15 min；⑤70%醋酸鈾乙醇飽和液中6～12 h；⑥80%、95%乙醇脫水各15 min；⑦無水乙醇×2次40 min；⑧環(huán)氧丙烷30 min；⑨環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹脂1∶1（2 h）；⑩環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹脂1∶2（1 h）；?浸環(huán)氧樹脂（Epon812）2 h；?環(huán)氧樹脂包埋，后入45℃烤箱中12 h；? 65℃烤箱中48 h；?取出包埋好的組織進行超薄切片（片厚70 nm）；?將切好的片子水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液中30 min；?雙蒸水洗3次（15 min）；?入枸櫞酸鉛染液15 min；?雙蒸水洗3次（10 min）；?透射電鏡觀察攝片。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，連續(xù)性變量用ˉx±s表示，樣本符合正態(tài)分布，正常組和模型組組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

模型復制18 h后，模型組大鼠右膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，局部伴有潰爛，明顯跛行，右下肢不著地，自發(fā)活動減少，進食量減少；9～12 d后，腫脹消退，潰爛愈合，步態(tài)基本恢復正常，活動頻次較前增多。22～25 d可于右膝關(guān)節(jié)捫及骨贅形成。正常組無上述癥狀。

2.2 光鏡下病理表現(xiàn)

OA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變，正常組未見明顯關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，HE染色骨層清晰，表面光滑，軟骨細胞分布均勻，未見簇集，潮線完整。模型組軟骨層破壞，表面粗糙不規(guī)則，可見裂隙；扁平軟骨細胞減少，排列紊亂，部分可見壞死崩解細胞；潮線斷裂、紊亂。根據(jù)Mankin評分標準對關(guān)節(jié)軟骨進行評分，正常組為（0.80±0.42），模型組為（7.70± 0.94）。與正常組相比，模型組Mankin評分明顯升高（P＜0.01），見圖1。

圖1 大鼠軟骨HE染色Fig.1 HE staining of cartilage of OA rats

2.3 電鏡下自噬泡及細胞亞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)

正常組細胞形態(tài)良好，細胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，集中于靠核區(qū)域，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜較清晰，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的細胞器，并可見豐富的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體；模型組可見細胞器減少，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡變性，線粒體腫脹，雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體極少，見圖2。

圖2 電鏡下自噬泡及細胞亞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)Fig.2 Autophagy and cell substructure under the electron microscope

2.4 OA大鼠軟骨中Atg、自噬蛋白及外周血細胞因子的變化

與正常組相比，模型組大鼠外周血中IL－4、IL－10水平降低、IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05或P＜0.01），Atg5、Atg7表達降低（P＜0.01），Atg12水平升高但差異無統(tǒng)計學意義；PI3K、Akt、m TOR水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；Beclin－1及LC3－Ⅱ表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01），見表2，圖3。

表2 OA大鼠軟骨中Atg、自噬蛋白及外周血IL－4、IL－10、IL－1β、TNF－α水平的變化（ˉx±s）Table 2 Changes of Atg and autophagy protein in cartilage and IL－4，IL－10，TNF－αand IL－1βin peripheral blood in OA rats（ˉx±s）

圖3 軟骨自噬蛋白免疫印跡圖Fig.3 Immunoblots of autophagy protein of cartilage

2.5 OA大鼠Atg、自噬蛋白及外周血細胞因子的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示:IL－4、IL－10與Atg5、Atg7，LC3－Ⅱ、Beclin－1呈正相關(guān)，與Akt、PI3K、m TOR呈負相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；IL－1β與Atg5呈負相關(guān)（P＜0.05），與Akt、m TOR呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）；TNF－α與Atg5呈負相關(guān)（P＜0.01），與LC3－Ⅱ呈負相關(guān)（P＜0.05），與Akt、PI3 K、m TOR呈正相關(guān)（均P＜0.01），見表3。

表3 OA大鼠軟骨Atg及自噬蛋白與外周血IL－4、IL－10、IL－1β、TNF－α的相關(guān)性分析（r）Table 3 Correlation analysis of Atg，autophagy protein in cartilage with IL－4，IL－10，IL－1βand TNF－αin peripheral blood of OA rats（r）

3 討論

本次實驗結(jié)果顯示，在OA大鼠中，存在細胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡，主要表現(xiàn)為IL－1β、TNF－α的升高和IL－4、IL－10的降低。OA關(guān)節(jié)軟骨被破壞的核心是細胞外基質(zhì)的降解超過了合成［8］。IL－1β、TNF－α在OA的病理機制中歸屬于分解類的細胞因子。IL－1β及其受體在OA患者的關(guān)節(jié)液中是升高的［910］。它還可以通過調(diào)節(jié)NO通道、Fas通道、三磷酸肌醇激酶通道［1113］來誘導或抑制軟骨細胞的增殖及凋亡通道來調(diào)節(jié)軟骨細胞的合成和降解。而TNF－α參與了OA的滑膜組織變性、炎癥反應和自身免疫應答3個病理生理過程，在OA患者中水平顯著高于常人，而關(guān)節(jié)液水平高于血清，其作用地位僅次于IL－1β［1415］。通過體外培養(yǎng)軟骨細胞體系檢測到TNF－α可下調(diào)OA軟骨細胞蛋白聚糖mRNA的表達，而蛋白聚糖是軟骨外基質(zhì)的主要成分之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，白細胞介素－4（IL－4）在軟骨代謝過程中起重要的軟骨保護作用［16］。IL－10作為抑炎細胞因子，在OA中的水平是降低的。

本次研究中我們發(fā)現(xiàn)Atg5、Atg7在軟骨中均降低，Atg12無顯著改變。m TOR、PI3K、Akt在軟骨中均升高（P＜0.05或P＜0.01），LC3－Ⅱ、Beclin－1在軟骨中降低，自噬的PI3K／Akt－m TOR通路是上調(diào)的，而Beclin－1通路的表達是下調(diào)的，說明在骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨中自噬處于明顯的抑制狀態(tài)。

在生理狀態(tài)下，自噬具有十分重要作用，但過分激活的自噬對機體是一種損傷［17］。自噬在免疫和炎癥以及抵抗微生物感染中起著至關(guān)重要的作用，其參與到機體免疫中并促進了炎癥性疾病的發(fā)展［1820］。Atg8、Atg12構(gòu)成兩種泛素樣系統(tǒng)促進囊泡的遷移。Atg12結(jié)合系統(tǒng)和LC3－Ⅱ修飾作用下逐漸包裹自噬底物形成自噬體［21］。Atg12、Atg5、與Atg7主要參與形成前自噬體結(jié)構(gòu)，參與自噬膜的延長。LC3－Ⅱ是自噬體的標志分子，通常起監(jiān)控自噬的作用。在細胞內(nèi)微生物的免疫反應中，TNF－α能激活細胞自噬，IL－4能抑制細胞自噬，進而控制胞內(nèi)微生物的傳播［22］。m TOR是雷帕霉素（rapamycin）的靶分子，它是細胞自噬上游通路的匯合點，是調(diào)節(jié)自噬的兩個復合體之一［2324］，m TOR是自噬的主要抑制信號，其機制是磷酸化Atg13，使之不能與Atg1結(jié)合形成自噬體，同時，促使核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的黏附而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脫落形成自噬體膜［2526］。PI3K／Akt細胞存活信號通路是調(diào)控m TOR的兩條上游通路之一。對PI3K的抑制，能很大程度上阻斷其下游信號通路Akt和m TOR。在T、B淋巴細胞中，Akt是被PI3K激活的下游信號。Akt能直接激活m TOR。Beclin－1是酵母Atg6的同源體，是一個多功能蛋白，是自噬主要的正調(diào)節(jié)因子。饑餓誘導JNK活化，使Bcl－2磷酸化，從而釋放Beclin－1激活自噬［2728］。Beclin－1表達增強可作為評價自噬水平升高的重要指標。

細胞因子對自噬的調(diào)控不是某一個單獨細胞因子的作用，而是整個細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡的作用。自噬的調(diào)控受到Th1（TNF－α）型細胞因子與Th2型細胞因子（IL－4、IL－10）比例的調(diào)控，當兩者之比升高時，可表現(xiàn)出對自噬的抑制［29］。在OA大鼠中，分解性的細胞因子IL－1β、TNF－α的升高和合成性的細胞因子IL－4、IL－10的降低，致使Th1／Th2升高，從而抑制了軟骨的自噬水平，進一步導致細胞適應外界環(huán)境和自身防御反應的能力降低，損傷的細胞結(jié)構(gòu)及大量氧自由基等活性氧化合物不能有效地被清除，細胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，加速細胞老化。

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（2014－12－01 收稿）

Expression of Autophagy Pathway PI3K／Akt－mTOR and Beclin－1 and Correlation Analysis in Osteoarthritis Rats

Ruan Liping1，Liu Jian2△，Ge Yao2et al
1The Graduate Department，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China
2Department of Rheumatology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230031，China

Objective To observe the expression of autophagy genes（Atg5，Atg7，Atg12）and autophagy related proteins，Beclin－1 m TOR，PI3K，and Akt，LC3－Ⅱin cartilage of OA rats，and analyze its correlation with IL－4，IL－10，TNF－αand IL－1β.Methods Twenty rats were randomly divided into normal control group（NC）and model control group（MC）（n＝10 each group）.In MC group，osteoarthritis rat model was established by articular cavity injection of Papain and L－cysteine.Cartilage of the rats was evaluated by Mankin standard score under light microscopy.Autophagosome form and number in OA rats cartilage were observed with electron microscope.Expression of Atg5，Atg7 and Atg12 in cartilage was detected with Real－time PCR；Beclin－1，mTOR，PI3K，LC3－Ⅱand Akt in cartilage were detected with Western blot.Serum cytokines IL－4，IL－10，TNF－αand IL－1βwere determined by ELISA.Results As compared with normal group，Mankin score of cartilage of OA rats was increased significantly（P＜0.01）；Atg5 in cartilage was significantly reduced（P＜0.01），and was positively correlated with IL－4 and IL－10（P＜0.01），but was negatively correlated with TNF－αand IL－1β（P＜0.05 or P＜0.01）；Atg7 in cartilage was significantly decreased（P＜0.01）；m TOR in cartilage was significantly increased（P＜0.05）；PI3K and Akt in cartilage were significantly increased（both P＜0.01），and were negatively correlated with IL－4 and IL－10（P＜0.05 or P＜0.01），but were positively correlated with TNF－αand IL－1β（P＜0.05 or P＜0.01）；LC3－Ⅱand Beclin－1 were reduced in cartilage，and positively correlated with IL－4 and IL－10（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion At the same time with the increase of Mankin score in OA rats，the expression of Atg5 and Atg7 is reduced，expression of Atg12 increased，PI3K／Akt－m TOR pathway is up－regulated while Beclin－1 is down－regulated，and autophagy is suppressed，which may participate in the pathological changes of OA rats cartilage.

osteoarthritis； autophagy pathways； cytokines

R684.3

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.012

＊國家自然科學基金資助項目（No.81173211）；國家中醫(yī)藥重點學科中醫(yī)痹病學建設(shè)項目（No.國中醫(yī)藥發(fā)［2009］30號）；安徽省科技廳科研計劃項目（No.09－020304046）

阮麗萍，女，1982年生，碩士研究生，E－mail:18255188560＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:liujianahzy＠126.com