夏磊磊,王先進,許天源,秦 亮,張 祥,朱照偉,張小華,鐘 山,張敏光,沈周俊

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海 200025)

·基礎研究·

雄激素聯(lián)合5型磷酸二酯酶抑制劑治療大鼠糖尿病性勃起功能障礙的研究

夏磊磊,王先進,許天源,秦 亮,張 祥,朱照偉,張小華,鐘 山,張敏光,沈周俊

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海 200025)

目的 建立糖尿病性勃起功能障礙(DMED)大鼠模型，評價雄激素聯(lián)合5型磷酸二酯酶抑制劑對DMED的治療作用。 方法 通過鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法建立DMED大鼠模型，造模成功4周后隨機分為4組：DM組、DM補充睪酮組、DM補充西地那非組、DM補充睪酮聯(lián)合西地那非組，正常大鼠作為對照組。給藥6周后通過電刺激海綿體神經誘發(fā)勃起的方法測定各組大鼠的勃起功能，ELISA法測定各組大鼠的血清睪酮水平，HE染色和masson染色評價各組陰莖海綿體形態(tài)學改變，Western blot和免疫組織化學檢測內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達。 結果 DM大鼠較正常大鼠勃起功能顯著下降，睪酮水平明顯降低，eNOS表達降低，陰莖海綿體間質纖維化程度增加而平滑肌成分減少。睪酮補充治療和長期西地那非治療均可改善DMED大鼠的勃起功能和改善DMED大鼠陰莖的纖維化程度，睪酮和長期西地那非聯(lián)合治療改善效果最明顯。 結論 DM大鼠的勃起功能明顯降低，DMED發(fā)生的部分原因可能與雄激素水平降低有關，雄激素聯(lián)合長期5型磷酸二酯酶抑制劑可明顯改善DMED大鼠的勃起功能和陰莖纖維化程度。

糖尿?。徊鸸δ苷系K；雄激素；磷酸二酯酶抑制劑

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是世界范圍內的常見病，國內流行病學調查預計中國成人(大于18歲)DM患病率為11.6%，DM前期所占比例為50.1%[1]。DM是引起勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)的最重要器質性疾病，有報道表明DM患者ED的發(fā)生率為非DM患者的3倍(分別為49.3%和 15.6%)[2]。糖尿病性勃起功能障礙(diabetes mellitus erectile dysfunction，DMED)發(fā)病機制復雜，其中主要涉及因素包括內皮細胞損傷、神經病變、大血管病變、小血管病變以及雄激素水平的降低等[3]。

ED的一線治療藥物為5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5, PDE5)抑制劑，如西地那非、他達拉非等。與非DM性ED相比，DMED對PDE5抑制劑敏感性相對較差，部分原因可能與DM導致雄激素水平降低有關[4]。此外，臨床試驗及相關研究對于雄激素治療DMED的報道結果不一致[5-6]。雖然也有一些動物研究表明長期小劑量PDE5抑制劑可改善DMED，但聯(lián)合雄激素和長期PDE5抑制劑治療的研究仍然較少[7-8]。本研究首先建立DMED大鼠模型，并在此模型基礎上探討雄激素聯(lián)合長期PDE5抑制劑對DMED大鼠勃起功能的治療作用，進而為臨床用藥提供一定指導。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及試劑 SPF級8周齡雄性SD大鼠100只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院實驗醫(yī)學研究中心清潔級動物房獨立通氣籠盒系統(tǒng)，室溫20 ℃～25 ℃，相對濕度40%～60%，光照和黑暗每12 h改變1次，標準飼料，自由飲水、攝食，常規(guī)飼養(yǎng)觀察1周無異常后進行實驗。實驗鼠進入研究前由交配實驗證實均有正常性功能。實驗經過動物保護和使用委員會批準。

鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)購自于美國Sigma公司，溶液配制方法為1 g STZ在冰浴中溶解于100 mL的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L, pH 4.5)中，配成10 mg/mL終濃度，避光保存，即配即用。血糖儀及試紙購自羅氏公司。雄激素選用十一酸睪酮(testosterone undecanoate, T)注射液：250 mg/2 mL，購于浙江仙琚制藥股份有限公司(批號：國藥準字H10900063)。PDE5抑制劑西地那非(sildenafil, S)，購于美國輝瑞公司。大鼠睪酮ELISA試劑盒購于西塘生物科技公司。內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體購于美國Santa Cruz生物科技有限公司(批號：sc-654)。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型的建立及判斷 100只SD雄性大鼠隨機分為正常組(n=20)和造模組(n=80)。造模組禁食8～12 h后，腹腔一次性注射STZ(50 mg/kg)誘導DM模型，正常組注射相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液。在STZ注射后4 d用便攜式血糖儀檢測血糖，任意時間血糖>16.67 mmol/L為DM成模標準，剔除未達標準的大鼠(n=6)。

1.2.2 分組及給藥 造模4周后，將DM大鼠重新隨機分組。最終74只DM成模大鼠和20只正常大鼠分為5組，分別為正常組N(n=20)、DM組(n=19)、DM+T給藥組(n=18)、DM+S給藥組(n=18)、DM+T+S給藥組(n=19)。分組完成后DM+T、DM+S、DM+T+S組給藥治療：其中S為灌胃給藥，每天1次，給藥量為5 mg/(kg·d)，持續(xù)6周；T為肌肉注射給藥，2周1次，給藥量為100 mg/(kg·次)，持續(xù)6周；所有未灌胃大鼠每天灌胃與S等量生理鹽水，所有未肌肉注射大鼠2周肌肉注射與T等量生理鹽水。

1.2.3 大鼠勃起功能的測定 參考本課題組既往的研究方法[9-10]。電刺激法測定勃起功能的主要過程為：①平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)測定：戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸部正中切口，暴露并切開左側頸總動脈置入PE10管，直接法持續(xù)監(jiān)測大鼠MAP；②陰莖海綿體內壓(intracavernous pressure, ICP)測定：陰莖包皮縱行切口，左右兩側陰莖海綿體均置入22號針頭，分別用于測定ICP和藥物注射。上述PE10管和22號針頭均通過PE50管與壓力換能器相連，管內充滿肝素鈉注射液(250 U/mL)，與壓力換能器相連的MPA2000多通道生物信號分析系統(tǒng)用于記錄MAP和ICP；③海綿體神經(cavernous nerve, CN)電刺激：下腹部正中切口，于前列腺右側葉前外側表面暴露右側CN，鉑金雙極電極鉤起右側CN，連接于電刺激器，對CN進行電刺激。電刺激參數電壓、波寬、頻率分別設置為：5 V、2 ms、25 Hz，每次刺激持續(xù)時間30～60 s；④結果記錄：電刺激CN前的ICP記錄為“基礎ICP”(bICP)，相應的MAP記錄為“基礎MAP”(bMAP)，計算(bICP /bMAP)×100%代表陰莖海綿體靜息狀態(tài)。電刺激CN誘發(fā)的ICP最大值記錄為“最大ICP”(mICP)，相應的MAP記錄為“最大MAP”(mMAP)，計算(mICP /mMAP)×100%代表大鼠的勃起功能。本研究中每間隔5 min電刺激1次，共3次，結果取3次平均值作為每組大鼠的勃起功能值。

1.2.4 大鼠血清睪酮水平的測定 各組大鼠勃起功能測定結束后，心臟采血6～10 mL，3 000 r/min離心10 min取血清，按大鼠睪酮ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠的血清睪酮濃度。

1.2.5 大鼠陰莖海綿體形態(tài)學檢測 各組大鼠取部分陰莖組織，冷生理鹽水洗凈，10% Bouin氏液溶液固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片厚4～5 μm，行HE染色和masson染色。HE染色和masson染色后光鏡下觀察，masson染色中，膠原纖維、黏液、軟骨呈綠色，肌纖維、纖維素和紅細胞染紅色，細胞核染藍黑色。

1.2.6 大鼠陰莖海綿體eNOS表達水平檢測 各組大鼠取部分陰莖海綿體組織，冷生理鹽水洗凈，液氮凍存。使用Western blot技術檢測eNOS蛋白的表達，eNOS抗體的濃度為1∶200，以GAPDH作為內參。取前述切片行免疫組織化學檢測eNOS表達，eNOS抗體的濃度為1∶50。

2 結 果

2.1 各組大鼠體重、陰莖重量、血糖及睪酮水平的比較 見表1。N組最終體重較初始體重增加，DM、DM+T、DM+S、DM+T+S組最終體重均較初始體重降低；DM、DM+T、DM+S、DM+T+S組最終體重與N組相比均有明顯差異(P均<0.01)。DM、DM+S組陰莖重量均較N組明顯降低(P均<0.01)；DM+T、DM+T+S組陰莖重量與N組無明顯差異(P分別為0.404、0.278)。DM、DM+T、DM+S、DM+T+S組血糖均較N組血糖明顯升高(P均<0.01)，DM、DM+T、DM+S、DM+T+S組間血糖無明顯差異(P=0.772)。DM、DM+S組睪酮水平均較N組明顯降低(P均<0.01)；補充T顯著升高血清睪酮水平，DM+T、DM+T+S組睪酮水平均較N組有一定升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P分別為0.290、0.389)；DM+T、DM+T+S組睪酮水平均較DM組有升高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)；DM+T、DM+T+S組睪酮水平均較DM+S組有升高，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。

表1 各組大鼠體重、血糖、陰莖重量及睪酮水平測定結果 ±s)

N：正常組；DM：糖尿病組；T：十一酸睪酮；S：西地那非。與正常組比較，*P<0.01；與DM組比較，△P<0.01；與DM+S組比較，#P<0.01。

2.2 各組大鼠勃起功能的比較 見圖1。實驗終點時，DM大鼠勃起功能較正常對照大鼠顯著下降(P<0.01)；DM+T、DM+S和DM+T+S組大鼠勃起功能較DM組大鼠均明顯提高(P均<0.01)；DM+T和DM+S組大鼠勃起功能均低于正常組大鼠(P均<0.01)，DM+T+S組大鼠勃起功能與正常大鼠相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.594)；5組間整體方差分析結果表明組間勃起功能差異顯著(P<0.01)。

2.3 各組大鼠陰莖海綿體形態(tài)學檢測結果 見圖2。HE染色和masson染色結果顯示：正常組大鼠海綿體血竇分布規(guī)則、均勻，海綿體平滑肌(masson染色為紅色)豐富、排列規(guī)則；DM組大鼠陰莖較小，血竇數量減少、體積變小，間質成分(masson染色為綠色)增多；DM+T+S組大鼠接近正常；DM+T組和DM+S組大鼠情況介于正常組和DM組之間。

圖1 各組勃起功能的比較

N：正常組；DM：糖尿?。籘：十一酸睪酮；S：西地那非；**P<0.01。

圖2 各組陰莖海綿體HE染色和masson染色結果

注：A1～E1：HE染色；A2～E2：masson染色；A1、A2：正常組；B1、B2：糖尿病組；C1、C2：糖尿病+睪酮組；D1、D2：糖尿病+西地那非組；E1、E2：糖尿病+睪酮+西地那非組；標尺=500 μm(×40)。

2.4 各組大鼠陰莖海綿體eNOS表達水平結果 結果見圖3、圖4。Western blot和免疫組織化學結果顯示：與正常大鼠相比，DM和DM+S組大鼠陰莖海綿體eNOS表達量明顯降低，DM+T組出現一定程度的改善，聯(lián)合使用睪酮和西地那非組改善最明顯，接近正常大鼠。

圖3 各組eNOS表達免疫組織化學結果圖

A：正常組；B：糖尿病組；C：糖尿病+睪酮組；D：糖尿病+西地那非組；E：糖尿病+睪酮+西地那非組。**P<0.01。

圖4 各組Western blot結果

3 討 論

本研究通過建立大鼠DM模型驗證了DM大鼠的勃起功能顯著下降，DM大鼠的陰莖纖維化程度增加，并發(fā)現雄激素和長期PDE5抑制劑治療均可以不同程度地改善DMED大鼠的勃起功能和陰莖纖維化程度，而雄激素聯(lián)合PDE5抑制劑改善效果更明顯。DM造模采用STZ腹腔注射方法，STZ誘導的1型DM模型廣泛應用于科學研究，腹腔注射數天后血糖即出現明顯升高然后保持相對穩(wěn)定。本研究模型采取50 mg/kg的STZ濃度，效果較好，未出現大鼠死亡的情況，其中有6只未成模剔除研究，總體成模率較高。我們的結果表明STZ誘導的DM大鼠勃起功能較正常大鼠顯著降低， STZ誘導的DM模型本身即可以認為是一種DMED模型[7]。正因如此，我們采取在實驗終點直接使用標準的電刺激法測定各組大鼠的勃起功能，電刺激法測定動物的勃起功能在國外應用較多，但在國內采用相對較少，這可能是由于該方法存在一定的技術難點，尤其是在分離海綿體神經和確立電刺激參數方面較難掌握。我們并沒有采用阿撲嗎啡實驗進行大鼠勃起功能的測定或篩選，因為阿撲嗎啡實驗具有一定的主觀性，易受環(huán)境因素的影響。

DM導致ED的機制復雜，其中研究的主要焦點為神經性因素和血管性因素，DM導致雄激素水平的降低也可能是發(fā)病原因之一[4, 11]。本研究結果表明STZ誘導的DM大鼠相對正常大鼠血清睪酮濃度明顯下降，但是睪酮下降的原因可能并不單純與血糖升高有關。STZ毒性較大，有研究表明STZ可能對睪丸Sertoli細胞具有直接損害作用，但是短期內對產生雄激素的Leydig細胞可能并無作用[12]。還有研究表明在胰島素依賴性DM中，雄激素的缺乏可能與缺少胰島素對Leydig細胞的直接刺激有關，同時胰島素缺乏導致卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)的降低進而影響到下游性腺內分泌功能[13-14]。盡管雄激素降低原因還有待進一步闡明，但明確的是雄激素在維持陰莖海綿體勃起功能時具有重要作用，其中主要的作用靶點包括信號遞質一氧化氮(nitric oxide, NO)、關鍵酶eNOS及PDE5[15]。我們的結果也間接表明了eNOS的表達可能受雄激素調控。此外，雄激素在維持陰莖海綿體結構方面具有重要作用，雄激素水平的降低可導致海綿體平滑肌細胞凋亡增加、細胞外基質和成纖維細胞的聚集[16]。本研究發(fā)現DM大鼠的血清睪酮濃度明顯降低，而相應DM大鼠的陰莖海綿體平滑肌成分減少，纖維組織增多，纖維化程度增高；補充雄激素后(DM+T和DM+T+S組)大鼠陰莖的纖維化程度降低。臨床上，雄激素補充治療也在一定情況下應用于ED，尤其是伴有性腺功能低下的患者[17]。HACKETT等[6]報道的最大樣本的隨機對照臨床試驗表明，2型DM患者使用雄激素治療30周后，治療組相對安慰劑組勃起功能評分更高。但是最新的一項臨床試驗認為使用雄激素治療2型DM患者并不能改善勃起功能[5]。兩項臨床試驗對于雄激素治療DMED結果不同，可能的原因是2型DM本身伴發(fā)的疾病很多，如肥胖、高血壓、高脂血癥甚至精神心理疾病如抑郁等，這些因素均會對勃起功能產生一定影響，進而影響試驗結果[5-6]。我們的結果發(fā)現，DM大鼠補充雄激素后勃起功能明顯改善，但仍不能達到正常大鼠的水平。此外，本實驗結果表明雄激素補充治療本身對血糖無明顯影響?？赡茉蛟谟赟TZ誘導DM的機理在于破壞胰島細胞導致胰島素絕對缺乏，而睪酮并不能恢復胰島素水平或修復胰島細胞。這與有關臨床試驗報道睪酮補充可改善2型DM的血糖有一定差異，2型DM的主要問題在于胰島素抵抗[6, 18-19]。

PDE5抑制劑被認為是藥物治療ED的首選，也廣泛應用于DMED的治療。但是臨床試驗表明DMED對PDE5抑制劑的反應性相對非DM引起的ED較差[20]。我們的研究結果也證實這一點，單純使用PDE5抑制劑組與聯(lián)合使用PDE5抑制劑和雄激素組相比，勃起功能改善的程度較低。PDE5抑制劑最主要的使用方式為按需使用，但是越來越多的臨床研究表明長期小劑量PDE5抑制劑對于ED的治療效果好，尤其適合難治性ED，包括DMED、嚴重血管性ED、根治性前列腺切除后ED等[21-26]。臨床研究表明雄激素補充治療可在一定程度恢復DM患者對PDE5抑制劑的敏感性[27]。從實驗結果可以看出，雄激素和長期PDE5抑制劑均可以不同程度地改善DMED，而雄激素聯(lián)合PDE5抑制劑改善效果最明顯，可見雄激素和PDE5抑制劑有一定的協(xié)同作用。可能的原因在于雄激素的降低會導致勃起的關鍵酶eNOS和PDE5表達水平降低，補充雄激素一方面可直接改善勃起功能，另一方面增加PDE5的表達進而提高PDE5抑制劑的敏感性[28]。此外，雄激素具有的抗凋亡、抗炎、抗氧化應激效應和改善血管功能可能也起一定作用[29-31]。

值得指出，本研究屬于動物實驗研究，臨床應用的可能性仍然需要仔細斟酌。第一，臨床上對于DMED的治療首先需要控制好血糖，在血糖控制良好的基礎上若DMED改善不明顯，才考慮下一步的藥物治療。第二，本實驗模型為1型DM模型，而臨床上主要為2型DM，2型DM伴發(fā)疾病很多，如肥胖、高脂血癥、高血壓等，上述伴發(fā)疾病本身就可以導致ED的發(fā)生，因此對于其他因素的干預也很重要。第三，雄激素在ED中的應用本身爭議就較大，尤其是老年患者使用雄激素可能副作用也較大，激素水平在補充治療前是重要的參考因素[15]。

總之，本研究發(fā)現DM大鼠的勃起功能明顯降低、血清睪酮水平降低、陰莖纖維化程度增高。雄激素和長期PDE5抑制劑治療均可改善DMED大鼠的勃起功能，而聯(lián)合治療效果更優(yōu)，可為臨床用藥提供一定參考。但是臨床治療一定是以個體化治療為準，我們只能推測對于伴性腺功能低下且對按需PDE5抑制劑不敏感的難治性DMED，雄激素補充和長期小劑量PDE5抑制劑可作為試驗性治療并觀察具體療效。

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(編輯 王 瑋)

Androgen combined with phosphodiesterase type 5 inhibitor for the treatment of erectile dysfunction in diabetic rats

XIA Lei-lei, WANG Xian-jin, XU Tian-yuan, QIN Liang, ZHANG Xiang, ZHU Zhao-wei, ZHANG Xiao-hua, ZHONG Shan, ZHANG Min-guang, SHEN Zhou-jun

(Department of Urology, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

Objective To establish the rat model of diabetes mellitus erectile dysfunction (DMED) and evaluate the therapeutic effect of androgen combined with phosphodiesterase type 5 (PDE5) inhibitor. Methods DMED models were established by peritoneal injection of streptozotocin (STZ). Four weeks later the DMED rats were randomly divided into 4 groups: DM group, testosterone group, sildenafil group, and testosterone plus sildenafil group. Healthy rats served as controls. Six weeks after the initiation of treatments, the erectile function of each group was evaluated using electrostimulation of the cavernous nerve. The serum testosterone levels were determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The morphological changes of corpus cavernosum of penis were evaluated with hematoxylin-eosin staining and masson staining. The endothelial nitric oxide synthase (eNOS) level were determined with Western blot and immunohistochemistry. Results Compared with healthy rats, the erectile function, testosterone level and eNOS level of diabetic rats were significantly decreased. The smooth muscle cells of diabetic rats’ corpus cavernosum were reduced while extracellular matrix fibrosis was increased. Testosterone replacement and chronic sildenafil treatment could ameliorate erectile function and extracellular matrix fibrosis, and combined treatment with testosterone and sildenafil had the most significant effect. Conclusions The erectile function of DM rats is significantly impaired. The pathogenesis of DMED may be partly attributed to the low androgen level. Combined treatment of testosterone and sildenafil can significantly improve erectile function and extracellular matrix fibrosis of DMED rats.

diabetes mellitus; erectile dysfunction; androgen; phosphodiesterase inhibitor

2014-10-08

2015-01-25

國家自然科學基金面上項目(No. 81270695，81472379)

沈周俊，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導師．E-mail：shenzj6@sina.com

夏磊磊(1990-)，男(漢族)，碩士在讀. 研究方向：泌尿外科，男科．E-mail：xll7188@126.com

R698.1

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.05.015