陳立強，師尚禮

(1.塔里木大學動物科學學院，塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070)

植物生產(chǎn)層

42份紫花苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析

陳立強1，師尚禮2

(1.塔里木大學動物科學學院，塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070)

為了補充現(xiàn)有苜蓿(Medicagosativa)種質(zhì)資源的遺傳多樣性信息，采用SSR分子標記技術對1份野生紫花苜蓿種質(zhì)和41份栽培紫花苜蓿品種的遺傳多樣性進行了研究。15對引物在供試苜蓿材料中共獲得231條擴增帶，其中163條具有多態(tài)性。引物的多態(tài)位點百分率、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)的平均值分別為71.55%、0.210 0和0.326 3。供試材料間的相似系數(shù)介于0.641～0.913，平均為0.791，栽培品種間的平均相似系數(shù)相對較大，野生種質(zhì)資源與栽培品種間的平均相似系數(shù)相對較小。聚類分析表明，供試材料在相似系數(shù)0.778處可聚為五大類，單獨聚為類的隴東野生紫花苜蓿、CW 200和CW 787都表現(xiàn)出了與其他材料間較遠的親緣關系?；谥鞒煞址治鰣D，可把供試材料分為四大類，其中第Ⅰ、Ⅱ類與第Ⅲ、Ⅳ類材料間的親緣關系較遠。綜上，供試苜蓿種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性，部分種質(zhì)資源表現(xiàn)出了相對獨立的遺傳特性。

苜蓿；遺傳多樣性；親緣關系；SSR

紫花苜蓿(Medicagosativa)產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應性強，是我國栽培歷史最久、分布最廣的豆科牧草，長期以來在生態(tài)治理、畜牧業(yè)發(fā)展和種植業(yè)結構調(diào)整中發(fā)揮著重要作用[1-2]。近年來，隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，苜蓿在奶業(yè)中的作用也日益突出，種植面積不斷擴大。然而，現(xiàn)階段我國苜蓿優(yōu)良品種數(shù)量少，國產(chǎn)苜蓿無論在數(shù)量上還是品質(zhì)上，均無法滿足生產(chǎn)的需求，導致國外品種在我國苜蓿生產(chǎn)中占具主要地位[3]。另外，由于受到栽培區(qū)生態(tài)條件的影響，引進品種的生產(chǎn)性能都會受到不同程度的抑制，潛在的產(chǎn)量和品質(zhì)特性不能完全得到開發(fā)。因此，利用現(xiàn)有種質(zhì)資源，培育適合栽培區(qū)種植的新品種將成為苜蓿產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展的基礎和保障，也將成為我國苜蓿產(chǎn)業(yè)走出困境，擺脫危機的必由之路。

遺傳多樣性是植物育種和遺傳改良的基礎。目前已有大量研究從分子水平對紫花苜蓿種質(zhì)資源及其與近緣植物的遺傳多樣性進行了研究，涉及的材料包括地方品種、育成品種、引進品種[4-5]，野生、逸生種質(zhì)資源[6-7]，抗旱種質(zhì)資源[8]，抗病種質(zhì)資源[9]、抗蟲種質(zhì)資源[10]，耐鹽種質(zhì)資源[11]，不同秋眠型種質(zhì)資源[12]，雜交子代及親本[13]，紫花苜蓿和黃花苜蓿(M.falcata)[14]，紫花苜蓿、黃花苜蓿、多變苜蓿(M.varia)[15]，紫花苜蓿、黃花苜蓿、葫蘆巴屬(Trigonella)植物[16]，紫花苜蓿、黃花苜蓿、蒺藜苜蓿(M.truncatula)、天藍苜蓿(M.lupulina)、蝸牛苜蓿(M.scutellata)、海濱苜蓿(M.littoralis)、刺球苜蓿(M.sphaerocarpos)、南苜蓿(M.polymorpha)[17]，紫花苜蓿、胡盧巴(T.foenum-graecum)、網(wǎng)脈胡盧巴(T.cancellata)、黃花苜蓿、多變苜蓿、天藍苜蓿、花苜蓿(M.ruthenica)、毛莢苜蓿(M.edgeworthii)、闊莢苜蓿(M.platycarpos)、南苜蓿、青海苜蓿(M.archiducis-nicolai)[18]等，其結果為苜蓿種質(zhì)資源研究、保護和利用提供了依據(jù)。但紫花苜蓿種質(zhì)資源種類多、數(shù)量大、分布廣，各研究所涉及的材料也都非常有限且不盡相同，特別是隨著新資源數(shù)量的增加，遺傳多樣性研究需要不斷的完善和補充，以滿足苜蓿育種領域的需求。

DNA分子標記技術是近年來發(fā)展起來且被廣泛應用的遺傳多樣性研究手段，主要包括RAPD、AFLP、SNPs、ISSR、SSR、SCAR、CAPS、RAMP、SRAP、TRAP、SSCP、REMAP、IRAP、IMP、RFLP等[19]，其中SSR標記具有多態(tài)性高、重復性好、方法簡便等優(yōu)勢[20]，是植物品種間遺傳多樣性研究的理想分子標記，目前已被廣泛應用于苜蓿遺傳多樣性的研究領域[21-24]。因此，本研究選用SSR標記對1份野生紫花苜蓿種質(zhì)資源和41份栽培紫花苜蓿品種的遺傳多樣性進行檢測，以期為苜蓿品種的遺傳改良以及雜交親本的選配提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括野生紫花苜蓿種質(zhì)資源1份，栽培紫花苜蓿品種41份(表1)。隴東野生紫花苜蓿采自甘肅清水縣灌叢草原地帶，根系發(fā)達，具水平或斜生的根莖，無主根；莖纖細且平臥或半平臥生長，分枝能力強；葉片小且數(shù)量少；花序短且緊簇，小花較少；具有抗寒、抗旱、耐牧的特性[25]。Pick 3006、Pick 8925、CW 787、CW 200由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供，其余品種由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。

1.2 DNA的提取

每品種隨機選取100粒種子，置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽(光照9 h，黑暗15 h，溫度27 ℃)，至第8 天，隨機剪取40個單株苗的嫩葉，混合后用CTAB法提取DNA[26]。DNA提取后加入200 μL TE緩沖液進行稀釋，并用瓊脂糖凝膠電泳技術對其質(zhì)量進行檢測。合格樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試紫花苜蓿材料及原產(chǎn)地

1.3 PCR擴增及電泳

結合條帶的清晰度、多態(tài)性和穩(wěn)定性，在前人研究[27-29]的基礎上挑選出了15對SSR引物(表2)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系總體積為10 μL，含3 μL 模板DNA，3 μL引物，0.24 μL dNTP(0.20 mmol·L-1)，1.5 μL 10× Buffer，0.9 μL Mg2+(2.0 mmol·L-1)，0.15 μL TaqDNA聚合酶(1 U),ddH2O補足。擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；最后72 ℃保溫8 min，4 ℃保存[17]。擴增產(chǎn)物在30%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，膠板厚1.5 mm，上樣量10 μL，以6×DNA loading buffer(溴酚藍，二甲苯青)為前沿指示劑，1× TBE為電極緩沖液，恒壓電泳，電壓100 V，約5 h，指示劑移至距玻璃板末端2 cm時停止電泳，用硝酸銀染色顯影后進行凝膠成像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以擴增條帶在相對遷移位置的有無，記數(shù)為“1”或“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。計算各引物的多態(tài)位點百分率(Percentage of Polymorphic Bands，PPB)。用POPGENE VERSION 1.31 軟件統(tǒng)計分析Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)。用NTSYSpc 2.1軟件計算供試材料間的相似系數(shù)(Genetic Similarity，GS)；用SHAN程序，以非加權類平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)進行聚類分析，構建聚類圖；基于相似系數(shù)進行主成分分析，構建二維分析圖。

表2 SSR引物序列及名稱

2 結果

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

用SSR標記對供試苜蓿材料的遺傳多樣性進行研究，引物Afl4的擴增及電泳檢測結果見圖1。15對引物在42份苜蓿材料中共獲得231條擴增帶，其中163條具有多態(tài)性。每對引物擴增的總條帶數(shù)介于12～22，平均15.40條，多態(tài)性條帶數(shù)介于6～14，平均10.87條。多態(tài)位點百分率介于50.00%(w6019)～100.00%(AFca1)，平均為71.55%(表3)。引物Nei’s基因多樣性指數(shù)的變幅為0.125 7(Alf1)～0.383 1(AFca1)，平均為0.210 0；Shannon信息指數(shù)的變幅為0.203 3(Alf1)～0.563 8(AFca1)，平均為0.326 2(表3)。

圖1 引物Afl4對42份苜蓿種質(zhì)資源的擴增結果Fig.1 Amplification products of 42 alfalfa accessions by primer Afl4

注：圖中材料編號與表1相同，表4、圖2、圖3同。M，Marker。

Note：Numbers of the accessions refer to Table 1，the same in Table 4,Fig.2 and Fig.3. M, marker.

2.2 相似系數(shù)

基于原始數(shù)據(jù)，用軟件計算出供試材料間的相似系數(shù)矩陣(表4)。相似系數(shù)是用來比較群體或個體間相似程度的度量參數(shù)，材料間相似系數(shù)越小，則親緣關系越遠。結果表明，42份苜蓿種質(zhì)資源861對材料間的相似系數(shù)值介于0.641～0.913，平均為0.791，其中有31對材料間的相似系數(shù)介于0.641～0.697，占3.60%，親緣關系相對較遠；有422對材料間的相似系數(shù)介于0.701～0.797，占49.01%；有404對材料間的相似系數(shù)介于0.801～0.896，占46.92%，有4對材料間的相似系數(shù)介于0.900～0.913，占0.46%，親緣關系相對較近。甘農(nóng)3號(8)和CW 200(41)間的相似系數(shù)最小(GS=0.641)，親緣關系最遠；大西洋(29)和牧歌401+Z(31)間的相似系數(shù)最大(GS=0.913)，親緣關系最近。栽培品種間的相似系數(shù)介于0.641～0.913，平均為0.795。隴東野生紫花苜蓿(1)與栽培品種間的相似系數(shù)介于0.649～0.788，平均為0.711，表明野生紫花苜蓿與栽培品種間的親緣關系相對較遠；CW 200(41)與其他材料間的相似系數(shù)介于0.641～0.801，平均為0.720，相似系數(shù)較小，與其他材料間親緣關系相對較遠。

表3 SSR標記基于42份紫花苜蓿材料的遺傳多樣性參數(shù)

2.3 聚類分析

對42份苜蓿種質(zhì)資源進行聚類分析，并構建聚類圖(圖2)，供試材料在相似系數(shù)為0.778 處可聚為5類。第Ⅰ類由隴東野生紫花苜蓿組成。第Ⅱ類由8份材料組成，在相似系數(shù)為0.795處可聚為兩個亞類，第一亞類由新疆大葉、哥薩克、三得利組成；第二亞類由公農(nóng)2號、秘魯、沃庫、德寶、德福組成。第Ⅲ類由CW 200組成。第Ⅳ類由31份材料組成，在相似系數(shù)為0.812處可聚為4個亞類，第一亞類由河西組成；第二亞類由巴洛法、隴東苜蓿、公農(nóng)1號、博來維、賽特、美國苜蓿王、雷達克之星、巨人、Pick 8925、維多利亞、獵人河、阿爾岡金、皇冠、肇東、大西洋、牧歌401+Z、中牧32號、金皇后、蘇聯(lián)1號、皇后2000、格林、游客、牧歌、中蘭1號、飛馬、Pick 3006、領先者組成；第三亞類由美國放牧型苜蓿組成；第四亞類由甘農(nóng)3號和捷克組成。第Ⅴ類由CW 787組成。單獨聚為類的隴東野生紫花苜蓿、CW 200和CW 787，以及單獨聚為亞類的河西、美國放牧型苜蓿都表現(xiàn)出了與其他材料間較遠的親緣關系。

2.4 主成分分析

用NTSYSpc 2.1軟件對供試材料進行主成分分析，并根據(jù)第1和第2主成分構建主成分分析二維圖(圖3)，圖中材料間位置相互靠近者表示親緣關系較近，遠離者表示親緣關系較遠。根據(jù)材料在圖中的位置分布特征，可明顯地把供試材料劃分為四大類，第Ⅰ類包括隴東野生紫花苜蓿和CW 200；第Ⅱ類包括哥薩克、德福、新疆大葉、公農(nóng)2號、三得利、德寶、沃庫和秘魯；第Ⅲ類包括CW 787、捷克和甘農(nóng)3號；第Ⅳ類包括雷達克之星、河西、美國放牧型、獵人河、Pick 8925、公農(nóng)1號、阿爾岡金、美國苜蓿王、賽特、隴東苜蓿、巴洛法、皇冠、巨人、博來維、中蘭1號、游客、皇后2000、格林、維多利亞、牧歌、中農(nóng)32號、肇東、金皇后、飛馬、領先者、Pick 3006、牧歌401+Z、大西洋、蘇聯(lián)1號。第Ⅰ類和第Ⅱ類之間、第Ⅲ類和第Ⅳ類之間在圖中的位置相對較近，親緣關系相對較近，但第Ⅰ、Ⅱ類與第Ⅲ、Ⅳ類在圖中的位置相對較遠，親緣關系相對較遠。主成分分析從不同角度更直觀地展示了種質(zhì)資源間的親緣關系，其結果與聚類分析基本一致。

圖2 42份苜蓿材料基于15對SSR引物的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 42 alfalfa accessions based on 15 SSR primer pairs

圖3 42份苜蓿材料基于15對SSR引物的主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis of 42 alfalfa accessions based on 15 SSR primer pairs

3 討論與結論

3.1 SSR標記的檢測效率及材料的遺傳多樣性分析

本研究用15對SSR引物在42份紫花苜蓿材料中檢測到了163條多態(tài)性擴增帶，每對引物平均10.87條，多態(tài)位點百分率平均為71.55%；陳斐等[30]用16對SSR引物在82份苜蓿材料中檢測到了190條多態(tài)性擴增帶，每對引物平均11.88條，多態(tài)位點百分率平均為83.05%；李景欣等[31]用8對SSR引物在6個苜蓿品種(品系)中檢測到了106條多態(tài)性擴增帶，每對引物平均13.25條，多態(tài)位點百分率為82.81%；王森山等[10]用6對SSR引物在9個抗蚜苜蓿品種(系)中檢測到了63條多態(tài)性擴增帶，每對引物平均10.50條，多態(tài)位點百分率為91.30%。由于試驗所選材料和引物不同，所得結果也不盡相同，但引物的多態(tài)性條帶平均值及其百分率均相對較高，遠高于Talebi等[32]用14對SRAP引物對4個伊朗紫花苜蓿種群的研究結果、俞金蓉[33]用10條ISSR引物對30個苜蓿品種的研究結果及康俊梅等[8]用48條RAPD引物對9個苜蓿品種的研究結果，表明SSR標記能有效檢測苜蓿材料的遺傳多樣性?；蛐筒煌钠贩N，基因組內(nèi)核苷酸序列也存在差異，當用相同的SSR引物對不同基因組進行體外擴增時，由于基因組上與引物互補DNA片段的數(shù)目、位點不同，擴增產(chǎn)物的大小，數(shù)目也不同，因此，擴增產(chǎn)物的多態(tài)性，能反映材料的遺傳多樣性[20]，以此為依據(jù)，現(xiàn)有苜蓿種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。與多態(tài)位點百分率相比，基于Hardy-Weinberg假設的Nei’s基因多樣性指數(shù)和基于條帶表型頻率的Shannon信息指數(shù)更能客觀地衡量材料的遺傳多樣性水平[34]，其變幅分別為0.125 7～0.383 1、0.203 3～0.563 8，平均為0.210 0和0.326 2，且兩指標大小的變化趨勢基本一致，進一步表明供試苜蓿種質(zhì)資源具有一定水平的遺傳多樣性。

3.2 供試材料間的親緣關系分析

42份苜蓿種質(zhì)資源861對材料中，有31對材料的相似系數(shù)介于0.641～0.697，與Tucak等[35]對歐洲、澳洲、南美及北美品種遺傳多樣性的研究結果相近，表明現(xiàn)有紫花苜蓿種質(zhì)資源中，有部分材料間的親緣關系相對較遠，遺傳背景豐富。聚類分析表明，單獨聚為類的隴東野生紫花苜蓿、CW 200、CW 787及單獨聚為亞類的河西、美國放牧型苜蓿都與其他材料間的親緣關系相對較遠，具有相對獨立的遺傳特性。在育種領域，親本間的親緣關系很大程度上決定著后代群體的選擇范圍，通常認為兩親本遺傳差異越大，其雜種優(yōu)勢也越大，后代分離范圍就越廣泛，獲得優(yōu)良個體的機會也就越多[36-37]。以上結果將為苜蓿雜交親本的選配提供科學依據(jù)。

供試種質(zhì)資源中，有404對材料間的相似系數(shù)介于0.801～0.896，占46.92%，4對材料間的相似系數(shù)介于0.900～0.913，占0.46%，材料間的遺傳相似程度較高，親緣關系較近。李景欣等[31]用8對SSR引物分析苜蓿新品系Dy-2006等6個苜蓿品種(品系)的親緣關系發(fā)現(xiàn)，材料間的遺傳距離介于0.033～0.076；張穎娟和王斯琴花[38]用13條ISSR引物分析12份苜蓿材料的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，材料間的平均遺傳距離為0.063；Mandoulakani等[39]用10條IRAP和14條REMAP引物分析8個紫花苜蓿群體的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，基于兩種標記，群體間的遺傳距離分別介于0.063～0.151和0.048～0.124，平均為0.110和0.089。表明現(xiàn)有苜蓿種質(zhì)資源中，也有大部分材料間的親緣關系相對較近，遺傳基礎狹窄。因此，在常規(guī)育種實踐中，開發(fā)利用野生種質(zhì)資源及遺傳特性相對獨立的材料具有重要意義。

3.3 野生紫花苜蓿種質(zhì)資源的利用潛力分析

隴東野生紫花苜蓿與栽培品種間的相似系數(shù)介于0.649～0.788，平均為0.711，小于栽培品種間的平均相似系數(shù)(0.795)，聚類分析、主成分分析結果也都表明，隴東野生紫花苜蓿與栽培品種間的親緣關系較遠，這與用同工酶研究隴東野生紫花苜蓿遺傳特異性[40-43]時所得結論相同，進一步在分子水平上更準確地驗證了隴東野生紫花苜蓿相對獨立的遺傳特性。在野生苜蓿種質(zhì)資源研究領域，馬向麗和畢玉芬[7]用ISSR標記對云南30份野生和逸生苜蓿資源進行了聚類分析，結果表明，兩份野生紫花苜蓿種質(zhì)資源單獨聚為一類；關瀟[44]用SRAP標記對42份野生紫花苜蓿種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了研究，結果表明，各材料間的相似系數(shù)介于0.498～0.882，平均為0.686，相似系數(shù)較小。表明野生苜蓿種質(zhì)資源之間、野生種質(zhì)資源與栽培品種間的親緣關系較遠。野生種質(zhì)資源是在某一地區(qū)自然條件的作用下，經(jīng)過長期的自然選擇形成的，通常攜帶著抗病、抗蟲、抗旱、抗寒、耐鹽、持久等優(yōu)良基因[36]。野生苜蓿種質(zhì)資源通常具有持久性、匍匐性、根莖性等特點[45]，是新品種培育的寶貴基礎材料，然而野生紫花苜蓿資源在世界范圍內(nèi)都是稀有的，因此，保護和利用現(xiàn)有野生苜蓿種質(zhì)資源具有重要的意義。

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(責任編輯 武艷培)

Genetic diversity of 42 alfalfa accessions revealed by SSR markers

CHEN Li-qiang1, SHI Shang-li2

(1.College of Animal Science, Tarim University; Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Corps, Ala 843300, China; 2.Paracultural College of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

In order to reveal the genetic diversity of alfalfa germplasm resources, the genetic diversity of one wild and 41 cultivated alfalfa accessions were analyzed using SSR markers. The results showed that there were totally 231 alleles and 163 polymorphic alleles generated from these 42 alfalfa accessions by 15 SSR primers. The mean values of polymorphic percentage, Nei’s gene diversity and shannon’s information index for these 15 primer pairs were 71.55%, 0.210 0 and 0.326 3, respectively. The similarity coefficient of accessions ranged from 0.641 to 0.913 with an average of 0.791, and the mean value of similarity coefficient between wild alfalfa accessions and cultivars was lower than that among cultivars. Cluster analysis classified accessions into five defined groups at the genetic similarity value of 0.778, among which Longdong wild alfalfa, CW 200 and CW 787 were clustered into three independent groups, indicating that these accessions had relatively distant genetic relationship with the others. According to principal component analysis, the accessions can be divided into four groups, and the accessions in the Ⅰ and the Ⅱ groups had relatively distant genetic relationship with those in the Ⅲ and the Ⅳ groups. In conclusion, the alfalfa accessions used in the present study had relatively high genetic diversity, and some of which had relatively independent genetic characteristics.

alfalfa; genetic diversity; genetic relationship; SSR

SHI Shang-li E-mail:shishl@gsau.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0333

2014-07-14 接受日期：2014-09-29

新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201103)；新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201405)；農(nóng)業(yè)部全國畜牧總站“牧草種質(zhì)資源保種”項目

陳立強(1981-)，男，甘肅會寧人，講師，碩士，研究方向為牧草種質(zhì)資源與育種。E-mail:clqdky@126.com

師尚禮(1962-)，男，甘肅會寧人，教授，博士，研究方向為牧草種質(zhì)資源與育種。E-mail:shishl@gsau.edu.cn

S812;S541+.102;Q943

A

1001-0629(2015)03-0372-10

陳立強,師尚禮.42份紫花苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J].草業(yè)科學,2015,32(3):372-381.

CHEN Li-qiang,SHI Shang-li.Genetic diversity among 42 alfalfa accessions revealed by SSR markers[J].Pratacultural Science，2015,32(3)：372-381.