張廣求，劉文，譚璐，張為，王樹(shù)平

(湖北省黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，黃岡 438000)

參菊洗劑體外抑菌作用*

張廣求，劉文，譚璐，張為，王樹(shù)平

(湖北省黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，黃岡 438000)

目的 研究參菊洗劑的體外抑菌作用。方法 采用瓊脂擴(kuò)散紙片法測(cè)定抑菌圈直徑，采用液體培養(yǎng)液連續(xù)稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)，采用瓊脂培養(yǎng)液平板法測(cè)定最低殺菌濃度(MBC)，并與市售某婦科洗液比較抑菌作用。結(jié)果 參菊洗劑對(duì)5種病原菌株的抑菌作用明顯優(yōu)于相同濃度的市售某婦科洗液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參菊洗劑對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌的MIC分別為33.75，67.50，67.50，67.50，33.75 mg·mL-1；參菊洗劑對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌的MBC分別為33.75，67.50，67.50，135.00，33.75 mg·mL-1。結(jié)論 參菊洗劑具有較明顯的抑菌和殺菌作用。

參菊洗劑；瓊脂擴(kuò)散紙片法；液體培養(yǎng)液連續(xù)稀釋法；瓊脂培養(yǎng)液平板法；抑菌作用，體外

參菊洗劑是我院根據(jù)臨床驗(yàn)方研制的中藥制劑，主要由苦參、野菊花、黃柏、蛇床子等中藥組成。具有消炎、止癢、除穢、殺菌功效，用于細(xì)菌性、真菌性、滴蟲(chóng)性陰道炎的治療，具有較好的臨床療效。為了進(jìn)一步證實(shí)其抗菌、消炎作用，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-3]，采用瓊脂擴(kuò)散紙片法、液體培養(yǎng)液連續(xù)稀釋法和瓊脂培養(yǎng)液平板法對(duì)參菊洗劑的體外抗菌活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 YC-875S醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；SZK202凈化工作臺(tái)(蚌埠凈化設(shè)備廠)；HHB11420電熱恒溫培養(yǎng)箱(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)；DG-1多功能恒溫箱(上海醫(yī)療器械修理廠)；高壓蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；(0～150) mm×0.02 mm游標(biāo)卡尺(上海九量五金工具有限公司)；KWY-100型電熱干燥箱(武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠)；打孔器(ф6 mm)。

1.2 培養(yǎng)液 水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)液(M-H瓊脂培養(yǎng)液)(批號(hào)：20130818)、水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)液(M-H肉湯培養(yǎng)液)(批號(hào)：20130808)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)：20131117)、改良馬丁培養(yǎng)液(批號(hào)：20140118)均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；蛋白胨(批號(hào)：20130430)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液(批號(hào)：20130314)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液(批號(hào)：20131210)均由北京雙旋微生物培養(yǎng)液制品廠生產(chǎn)；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(上?；瘜W(xué)試劑廠，AR，批號(hào)：130622)。

1.3 菌株 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白念珠菌[CMCC(F)98001]均為第0代冷凍保藏菌株，購(gòu)自湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。

1.4 稀釋液及樣品 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(均按《中華人民共和國(guó)藥典》方法[4]配制)；市售某婦科洗液(含生藥量為1 g·mL-1)；參菊洗劑(含生藥量為0.54 g·mL-1，黃岡市中心醫(yī)院自制，批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20110230，規(guī)格：每瓶250 mL，批號(hào)：130804，131221，140318)。

2 方法與結(jié)果

2.1 0.5麥?zhǔn)媳葷峁艿闹苽?采用比濁法控制菌液的濃度[5]。量取1.175%氯化鋇(BaCl2·H2O)溶液0.5 mL，置100 mL量瓶中，加1%硫酸至刻度，充分搖勻，分裝于試管中，每管5 mL，其濁度相當(dāng)于菌液濃度為1.5×108CFU·mL-1[6]，置室溫、暗處保存，用前搖勻。

2.2 菌液的制備 按無(wú)菌操作法，將菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌解凍后，轉(zhuǎn)種至M-H瓊脂培養(yǎng)液斜面上，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18～24 h，使菌株復(fù)壯和純化；再用接種環(huán)挑起復(fù)壯并純化的菌株適量于5 mL的M-H肉湯培養(yǎng)液中，35 ℃培養(yǎng)16～18 h[4]。將菌株白念珠菌解凍后，轉(zhuǎn)種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液斜面上，經(jīng)25 ℃培養(yǎng)24～48 h，使菌株復(fù)壯和純化；再用接種環(huán)挑起復(fù)壯并純化的菌株適量于5 mL的改良馬丁培養(yǎng)液中，25 ℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物，分別置15 mm×175 mm的滅菌試管中，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液5 mL，搖勻，以黑襯紙為背景，調(diào)節(jié)濁度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，使菌液濃度為1.5×108CFU·mL-1，備用。

2.3 藥敏紙片的制備 選用吸水力強(qiáng)且質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔器制成直徑6 mm的圓紙片，分裝于西林瓶中，其中，每瓶30片×12瓶，每瓶90片×5瓶，用棉塞和牛皮紙封口，115 ℃熱壓滅菌30 min后，60 ℃干燥。取參菊洗劑3批或市售某婦科洗液，以無(wú)菌操作用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，分別稀釋成含生藥400，200，100 mg·mL-1的溶液。取濾紙片，分別浸泡上述參菊洗劑3批或市售某婦科洗液原液及其含生藥400，200，100 mg·mL-1的溶液30 min。參菊洗劑每一批、每一濃度組30片，12瓶共360片；市售某婦科洗液每一濃度組90片，4瓶共360片。另取濾紙片1瓶90片，浸泡于無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液30 min，作為陰性對(duì)照。置60 ℃溫箱干燥后，備用。

2.4 瓊脂擴(kuò)散紙片法藥敏實(shí)驗(yàn) 按無(wú)菌操作法，分別取已融化并冷卻至約50 ℃的M-H瓊脂培養(yǎng)液或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液，傾入內(nèi)徑為9 cm的無(wú)菌平皿中，每平皿25 mL，使瓊脂培養(yǎng)液平板厚度為4 mm，冷卻至凝固。用無(wú)菌棉拭子蘸取“2.2”項(xiàng)下制備的菌液，在試管內(nèi)壁液面上方擠去多余的菌液，從3個(gè)不同方向均勻涂布于上述瓊脂培養(yǎng)液平板表面。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌菌液各涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)液平板27個(gè)，共108個(gè)，白念珠菌菌液涂布于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液平板27個(gè)。并將各實(shí)驗(yàn)菌均分為5組，即參菊洗劑或市售某婦科洗液原液組及含生藥200，100，50 mg·mL-1的溶液組、無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液組。用無(wú)菌小鑷子夾取“2.3”項(xiàng)下制備的藥敏紙片，按順時(shí)針?lè)较?，每平板等距均勻貼6片，各紙片中心距離相距>25 mm，同時(shí)紙片距平板內(nèi)緣>15 mm，蓋上平皿蓋。倒置，M-H瓊脂培養(yǎng)液平板置35 ℃培養(yǎng)24 h，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液平板置25 ℃培養(yǎng)48 h。取出平板，在透射光上用游標(biāo)卡尺量取各紙片的抑菌圈直徑，包括完全抑菌帶和遲生長(zhǎng)帶的直徑，抑菌圈邊緣以肉眼不可見(jiàn)細(xì)菌或真菌明顯生長(zhǎng)為限。結(jié)果顯示，不同濃度的參菊洗劑在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白念珠菌等5種菌株的抑菌圈直徑，與相同濃度的市售某婦科洗液比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示參菊洗劑具有較好的體外抑菌作用。見(jiàn)表1。

2.5 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定 采用液體培養(yǎng)液連續(xù)稀釋法，以市售某婦科洗液作為陽(yáng)性對(duì)照藥。按無(wú)菌操作法，取13 mm×100 mm的滅菌帶棉塞的試管11支，編號(hào)，排列在試管架上。于每管中先加入M-H肉湯培養(yǎng)液(白念珠菌用改良馬丁培養(yǎng)液)2.0 mL。于第1管中加入?yún)⒕障磩┗蚴惺勰硧D科洗液原液2.0 mL，混勻后吸取2.0 mL加入第2管中，混勻后再吸取2.0 mL加入第3管中，如此連續(xù)倍比稀釋至第9管，混勻后自第9管吸取2.0 mL棄去，使成1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，1/512的各種藥液濃度。此時(shí)，各管參菊洗劑濃度依次為270.00，135.00，67.50，33.75，16.88，8.44，4.22，2.11，1.06 mg·mL-1，市售某婦科洗液濃度依次為500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.62，7.81，3.91，1.95 mg·mL-1。第10管不加受試藥液作為陽(yáng)性對(duì)照，以便觀察培養(yǎng)液是否適合細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)；第11管加受試藥液2.0 mL，混勻后吸取2.0 mL棄去，不加菌液，作為陰性對(duì)照，以便觀察受試藥液是否被污染。分別取“2.2”項(xiàng)下制備的細(xì)菌或真菌菌液50 μL，依次加入到上述第1～10管中。充分混勻后，置35或25 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)，如無(wú)法判斷，則將可疑管接種到相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)液上，置35或25 ℃培養(yǎng)24 h，以受試藥液最低濃度管中無(wú)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)者，為該試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度。每菌株2管，平行操作3次，以2或3次相同結(jié)果為準(zhǔn)。結(jié)果顯示，參菊洗劑對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌均有抑菌活性，其中，對(duì)金黃色葡萄球菌和白念珠菌的MIC均為33.75 mg·mL-1，對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的MIC均為67.50 mg·mL-1。市售某婦科洗液對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的MIC均為125 mg·mL-1，對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為250 mg·mL-1，對(duì)白念珠菌的MIC為62.50 mg·mL-1。提示參菊洗劑對(duì)上述5種致病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，且效果優(yōu)于市售某婦科洗液。見(jiàn)表2，3。

2.6 最低殺菌濃度(minimum bactericidal concen-tration，MBC)的測(cè)定 從MIC測(cè)定中未生長(zhǎng)細(xì)菌或真菌的試管，分別吸取0.1 mL接種于M-H瓊脂培養(yǎng)液或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液平皿上，置35或25 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小稀釋度的藥物濃度，為該藥的最低殺菌濃度。每菌株2管，平行操作3次，以2或3次相同結(jié)果為準(zhǔn)。結(jié)果，參菊洗劑對(duì)金黃色葡萄球菌、白念珠菌的MBC均為33.75 mg·mL-1，對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的MBC均為67.50 mg·mL-1，對(duì)枯草芽孢桿菌的MBC為135.00 mg·mL-1。

表1 不同濃度參菊洗劑和市售某婦科洗液對(duì)5種病原菌株的抑菌圈直徑

表2 不同濃度參菊洗劑對(duì)5種病原菌株的MIC

“-”表示無(wú)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)；“+”表示有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)

“-”means no bacterial or fungal growth；“+”means bacterial or fungal growth

表3 不同濃度市售某婦科洗液對(duì)5種病原菌株的MIC

“-”表示無(wú)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)；“+”表示有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)

“-”means no bacterial or fungal growth；“+”means bacterial or fungal growth

3 討論

文獻(xiàn)[7-10]對(duì)臨床感染病原菌的分布進(jìn)行分析，結(jié)果表明病原菌感染位居前幾位的依次是大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷白桿菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌(即白念珠菌)。苦參有抗滴蟲(chóng)作用，對(duì)痢疾埃希菌、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用；黃柏有殺滅陰道滴蟲(chóng)作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和多種致病性皮膚真菌均有抑制作用；蛇床子有抗滴蟲(chóng)作用，對(duì)絮狀表皮癬菌、石膏樣小芽胞菌、羊毛狀小芽胞菌有抑制作用[11]。研究結(jié)果顯示，一定濃度的參菊洗劑對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白念珠菌等陰道常見(jiàn)致病菌均有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，且效果優(yōu)于市售某婦科洗液。參菊洗劑處方組成除含有市售某婦科洗液中的苦參、黃柏、蛇床子外，尚含野菊花、魚腥草、千里光、雄黃、尋骨風(fēng)等藥材。野菊花對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌及多種致病性桿菌、皮膚真菌均有一定抗菌作用[11]，魚腥草、千里光、雄黃、尋骨風(fēng)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌及真菌等多種微生物均有抑制作用[12]。

瓊脂擴(kuò)散紙片法能定性測(cè)定藥物的體外抑菌活性，可用于體外抑菌試驗(yàn)的初篩。采用液態(tài)培養(yǎng)液連續(xù)稀釋法，藥液與菌液充分混合，能客觀反映藥物的抑菌效果，可定量測(cè)定藥物抑制微生物生長(zhǎng)的能力。

菌液的濃度對(duì)抑菌圈的影響較大，菌液濃度越高，抑菌圈越小。若菌液濃度過(guò)高，會(huì)出現(xiàn)該菌對(duì)所有濃度的藥物耐藥的結(jié)果；相反，菌液濃度過(guò)低，則會(huì)出現(xiàn)該菌對(duì)所有濃度的藥物均敏感的結(jié)果。接種的菌液濃度應(yīng)稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝粸橐?，相?dāng)于1.5×108CFU·mL-1[12]。

本研究?jī)H從體外抑菌試驗(yàn)方面，探討了參菊洗劑對(duì)上述5種常見(jiàn)菌的藥效作用，得出其體外抑菌效果明顯的結(jié)論，對(duì)其他細(xì)菌如加德納桿菌的抑菌作用以及體內(nèi)抑菌效果，有待進(jìn)一步探討。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.011

Antibacterial Effect ofShenjuLotioninVitro

ZHANG Guangqiu,LIU Wen,TAN Lu, ZHANG Wei, WANG Shuping

(DepartmentofPharmacy，HuanggangCentralHospital，Huanggang438000,China)

Objective To study the antibacterial effect ofShenjulotioninvitro. Methods The diameter of inhibition zone was determined by paper-disc agar-diffusion method.Minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum bactericidal concentration (MBC) was determined by culture medium dilution methodand agar medium plate method, respectively.Antibacterial effect was compared betweenShenjulotion and city sale of the gynecological lotion. Results Inhibitory effects ofShenjulotion on 5 pathogenic strains were significantly better than that of city sale of the gynecological lotion at the same concentrations (P<0.05).MIC ofShenjulotion onStaphylococcusaureus,Pseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,BacillussubtilisandCandidaalbicanswas 33.75, 67.50, 67.50, 67.50 and 33.75 mg ·mL-1, respectively.MBC ofShenjulotion onStaphylococcusaureus,Pseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,BacillussubtilisandCandidaalbicanswas 33.75, 67.50, 67.50, 135.00 and 33.75 mg ·mL-1, respectively. ConclusionShenjulotion has obvious bacteriostasis and sterilization effect.

Shenjulotion；Paper-disc agar-diffusion method；Liquid culture medium dilution method；Agar medium plate method；Antibacterial effect,invitro

2014-07-28

2014-10-16

*湖北省黃岡市科技計(jì)劃項(xiàng)目(黃科字[2013]76號(hào))

張廣求(1964-)，男，湖北黃梅人，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、藥物分析。電話：0713-8625312，E-mail：ccnpa@163.com。

R286；R978

B

1004-0781(2015)08-1032-04