王景，何超明

(海南省農墾三亞醫(yī)院神經內科，三亞 572000)

白藜蘆醇對星形膠質細胞氧化損傷的保護作用*

王景，何超明

(海南省農墾三亞醫(yī)院神經內科，三亞 572000)

目的 探討白藜蘆醇(RES)對過氧化氫誘導星形膠質細胞氧化損傷的保護作用及其機制。方法 星形膠質細胞傳代培養(yǎng)，隨機分為陰性對照組(以正常培養(yǎng)液培養(yǎng))，模型對照組(100 μmol·L-1的過氧化氫作用12 h)，RES小劑量組(20 μmol·L-1RES孵育24 h后，加入過氧化氫作用12 h)和RES大劑量組(40 μmol·L-1RES孵育24 h后，加入過氧化氫作用12 h)。采用MTT比色法測定細胞活力，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Hochest33258染色觀察凋亡細胞形態(tài)，比色法檢測凋亡相關因子caspase-3及caspase-9的表達。結果 MTT結果顯示5，10，20，40 μmol·L-1RES孵育24 h后細胞活性分別為(100.46±3.17)%，(101.33±3.14)%，(101.33±1.30)%，(99.67±2.62)%，與陰性對照組(98.33±2.13)%比較，差異無統計學意義(P>0.05)。表明RES對星形膠質細胞活性無影響。用20及40 μmol·L-1RES處理后，星形膠質細胞在過氧化氫作用12 h后引起損傷，其活性分別提高到(54.67±4.11)%和(70.33±2.61)%，與模型對照組比較，差異有統計學意義(t=3.59，7.13，P<0.01)。RES可以抑制過氧化氫誘導的細胞活性的下降。流式細胞計數結果顯示用20，40 μmol·L-1RES處理后，星形膠質細胞凋亡率分別下降到(35.51±3.56)%和(14.12±3.19)%，與模型對照組(46.31±4.16)%比較，差異有統計學意義(t=4.26，6.33P<0.01)。Hochest33258染色結果顯示RES可以抑制過氧化氫誘導的細胞凋亡。此外，RES還可以減少過氧化氫所致星形膠質細胞內caspase-3及caspase-9的表達，并且伴隨RES作用時間的延長其表達量呈下降趨勢。結論 RES通過抑制caspase-3及caspase-9的表達有效抑制了過氧化氫對星形膠質細胞的損傷，從而為其用于治療中樞神經疾病提供實驗依據。

白藜蘆醇；星形膠質細胞；氧化損傷

許多神經性疾病的發(fā)病機制都與氧化應激密切相關[1]。星形膠質細胞(astrocytes)對維持神經系統正常功能具有重要作用。該細胞受到氧化損傷后會觸發(fā)一系列改變，進而影響其發(fā)揮保護作用，從而成為神經損傷發(fā)展過程中的促進因素[2]。白黎蘆醇(resveratrol，RES)，化學名為為(E)-5-[2-(4-羥苯基)-乙烯基]-1，3-苯二酚；3，4'，5-三羥基芪(3，4'，5-trihydrolystil-bene)，為脂溶性抗氧化劑，廣泛存在于多種食用及藥用植物中，具有抗炎、抗菌、抗氧化、調節(jié)血脂、抗癌等多種功效[3]。近年來已有研究表明，天然RES有較強的抗氧化活性，有學者通過體外實驗發(fā)現，RES可以有效地清除氧自由基，它對過氧化氫(H2O2)清除能力強于玉米黃質及角黃質[4]。但是否對星形膠質細胞具有保護作用尚不清楚。筆者在本實驗中通過體外培養(yǎng)星形膠質細胞，利用H2O2誘導星形膠質細胞損傷模型，探討RES對星形膠質細胞氧化損傷的預防作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 取出生2 d內的健康清潔級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD) 乳鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所動物資源中心提供，生產許可證號：中科動管第003號，動物使用合格證號：0127011)，體質量20～25 g，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學院動物實驗中心，飼養(yǎng)條件：相對濕度50%，溫度22 ℃，晝夜明暗交替時間12 h：12 h，常規(guī)配方飼料喂養(yǎng)，自由進食。

1.2 試劑 RES(Sigma公司，含量：>95%，批號：111535) 用0.2%二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO,上海生物工程有限公司，批號：D5879)溶解后分別配成溶液4 ℃保存待用，H2O2購自Sigma公司并在使用前用去離子水液配成100 μmol·L-1，胎牛血清(杭州四季青生物公司，批號：HB0205)，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，美國GIBCO公司，批號：31600034)，噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、Hoechst33258試劑盒(碧云天上海生物技術有限公司，批號：C0009，C1011)，Annexin V FITC/PI(美國BD公司，批號：556547)，caspase-3、caspase-9試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：G007，G009)。

1.3 儀器 酶標儀(上海雷勃分析儀器有限公司，型號：MK3)，流式細胞儀(美國B-D FACScan，型號：FACSCalibur)。

1.4 星形膠質細胞的分離和培養(yǎng) 剝離乳鼠大腦并剪碎腦皮質，剔除腦膜、血管，用DMEM培養(yǎng)液充分沖洗3次，過濾去除組織塊，37 ℃下胰酶消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吹打分散細胞，以1.0×106·mL-1細胞密度接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)11 d后去培養(yǎng)液，用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌3次后用0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1(r=6 cm)離心5 min，去上清液后進行傳代培養(yǎng)，傳至第3代即得純化的星形膠質細胞。

1.5 RES對星形膠質細胞活力的影響 為了檢測RES對星形膠質細胞活性是否存在潛在影響，先進行不同濃度RES對星形膠質細胞活力影響的檢測。星形膠質細胞接種于96孔培養(yǎng)板(細胞密度5×104·L-1，每孔120 μL)培養(yǎng)24 h后，共分5組，每組18孔，分別加入0，5，10，20，40 μmol·L-1RES，繼續(xù)孵育24 h，MTT法測定細胞活力。具體方法如下：向各孔細胞中加入MTT 20 μL(5 g·L-1)，培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL，室溫下微量振蕩器振蕩10 min，然后用酶標儀測定492 nm的吸光度，按下式求得星形膠質細胞的存活率：存活率(%)=(各組細胞吸光度值/陰性對照組細胞吸光度值)×100%。

1.6 細胞分組 星形膠質細胞接種于96孔培養(yǎng)板后，根據SPSS11.5版統計軟件產生的隨機數字分為以下4組，每組24孔。陰性對照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型對照組：除上述培養(yǎng)液以外，加入100 μmol·L-1的H2O2，制備氧化損傷模型；RES小劑量組：20 μmol·L-1RES孵育24 h后，加入H2O2作用12 h；RES大劑量組：40 μmol·L-1RES孵育24 h后，加入H2O2作用12 h。對培養(yǎng)和處理的細胞用MTT法檢測細胞活力(具體方法同“1.5”項下)。

1.7 細胞凋亡檢測 各組星形膠質細胞接種于6孔板，經過相應處理后于12 h后進行檢測。具體操作如下：用0.1%胰酶消化并收集細胞，制備細胞懸液，1 000 r·min-1離心(r=6 cm)棄上清液，洗滌收集細胞，在冰浴中避光進行下述操作：用Annexin V-FITC試劑盒中緩沖液懸浮細胞，調節(jié)細胞濃度為5×104·L-1，取上述細胞分別按試劑盒說明，加入膜聯蛋白A5和碘化丙啶，混勻后孵育20 min，于1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 Hoechst33258染色觀察凋亡細胞形態(tài) 細胞接種于6孔板中，各實驗組按要求給予不同因素處理后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗3次，每次2 min，用固定液固定20 min后去固定液，PBS洗2次后加入染色液在暗處染色20 min，吸掉染色液后PBS洗2次置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.9 caspase活性檢測 20，40 μmol·L-1RES預處理細胞12，24，48 h后，H2O2作用12 h，用0.1%胰酶消化后，1 200 r·min-1(r=6 cm)離心12 min，棄上清液，收集細胞并用PBS沖洗2次，每份樣品加30 μL細胞裂解液，冰上孵育20 min，10 000 r·min-1(r=6 cm)離心10 min，進行caspase活性檢測。caspase活性=A405 nm/A595 nm。檢測方法和所用試劑均按南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行。

2 結果

2.1 不同濃度RES對星形膠質細胞活性的影響 5，10，20，40 μmol·L-1RES孵育24 h后細胞活性分別為(100.46±3.17)%，(101.33±3.14)%，(101.33±1.30)%，(99.67±2.62)%，與陰性對照組(98.33±2.13) %比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 RES對H2O2致星形膠質細胞氧化損傷的影響 模型對照組星形膠質細胞經H2O2處理后，細胞活性下降(32.67 ± 3.81) %，與陰性對照組比較差異有統計學意義(t=10.58，P<0.01)。用20及40 μmol·L-1RES處理后，星形膠質細胞活性分別提高到(54.67±4.11)%和(70.33±2.61)%，與模型對照組比較差異有統計學意義(t=3.59，7.13，P<0.05和P<0.01)。見圖2。

2.3 RES對氧化損傷致星形膠質細胞凋亡的抑制作用 星形膠質細胞經氧化損傷處理后，細胞凋亡率明顯升高，平均凋亡率(46.31±4.16)%，與陰性對照組(1.39±0.54) %比較差異有統計學意義(t=13.29，P<0.01)。用20，40 μmol·L-1RES處理后，星形膠質細胞凋亡率分別下降到(35.51±3.56)%和(14.12%±3.19)%，與模型對照組比較，差異有統計學意義(t=4.26，6.33，P<0.01)。實驗結果表明H2O2可以導致星形膠質細胞凋亡，經20及40 μmol·L-1RES處理后，其凋亡率呈下降趨勢。見圖3。

A.陰性對照組；B.模型對照組；C.RES小劑量組；D.RES大劑量組；與模型對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

A.negative control group；B.model control group；C.low-dose RES group； D.high-dose RES group；compared with model control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.4 RES對H2O2誘導星形膠質細胞凋亡的影響 Hoechst33258核染色法檢測結果顯示，與陰性對照組比較，模型對照組星形膠質細胞經過100 μmol·L-1H2O2處理12 h后，凋亡明顯增多，染色質固縮，細胞核呈致密濃染，熒光較強。與模型對照組比較，RES作用后凋亡細胞減少且細胞核形態(tài)改善，熒光強度減弱。見圖4。

2.5 RES對H2O2致星形膠質細胞氧化損傷caspase-3、caspase-9活性的影響 模型對照組星形膠質細胞內caspase-3、caspase-9活性明顯增加，與相同作用時間點的陰性對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。20及40 μmol·L-1RES處理后，可見caspase-3、caspase-9表達量下降，且呈時間依賴性，與相同作用時間點的模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

RES作為一種天然活性成分，主要存在于花生、豆科、葡萄皮、蓼科、百合科和多種藥用植物中，是一種具備抗氧化、抗癌、抗炎等作用的多酚類化合物[4-5]。筆者將不同濃度RES作用于星形膠質細胞，發(fā)現其對細胞并無損傷作用。正常星形膠質細胞給予H2O2處理后，細胞凋亡率明顯上升，說明氧化損傷可以誘導細胞凋亡的發(fā)生。而給予不同劑量的RES后，凋亡受到抑制，而且這種藥物對細胞的保護作用呈劑量依賴性，進而證實RES可以在一定程度上能夠抑制H2O2誘導的細胞凋亡。

A.陰性對照組；B.模型對照組；C.RES小劑量組；D.RES大劑量組

A.陰性對照組；B.模型對照組；C.RES小劑量組；D.RES大劑量組

Tab.1 Content of caspase-3 and caspase-9 in four groups of astrocytes

組別caspase-312h24h48hcaspase-912h24h48h陰性對照組55.36±2.3454.09±2.7555.43±2.1369.56±3.2271.56±2.4374.42±2.34模型對照組99.67±3.22*1113.34±3.71*1119.44±3.56*1109.31±3.32*1122.34±3.21*1130.61±2.98*1RES 小劑量組76.65±3.12*287.13±3.81*3100.54±3.21*389.32±3.41*3112.31±3.22*2119.53±3.72*2 大劑量組61.34±3.41*369.49±3.14*384.79±2.06*379.44±3.47*389.79±3.22*395.34±2.94*3

與陰性對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

細胞的氧化損傷在神經系統疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。而氧自由基對星形膠質細胞的損傷作用已日漸引起廣泛重視[6]?；钚匝跏侨梭w內最重要的自由基，活性氧過多可致蛋白質、核酸等生物大分子氧化損傷，當氧化損傷產生大量的自由基時，很容易誘發(fā)細胞凋亡，從而引起疾病的發(fā)生。H2O2是一種極易透過細胞膜的強氧化劑，通過增加細胞內活性氧含量發(fā)揮對細胞的氧化損傷作用[7-9]。本實驗以活性氧形式之一的H2O2作用于星形膠質細胞，造成星形膠質細胞氧化損傷，研究RES對該細胞的保護作用。

凋亡是存在于生命體內的一種基本的生物學現象，它在生物體正常生理活動中可去除不需要的或異常的細胞，對生物體內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統的發(fā)育起著重要作用。caspases蛋白酶家族參與該機制并發(fā)揮著重要作用[10-11]。雖然氧化應激引起星形膠質細胞凋亡的具體機制至今仍不清楚，但多個研究顯示caspase家族在其中起著重要的作用，caspase蛋白酶家族是細胞凋亡下游的關鍵酶，細胞凋亡的誘導實質上是通過caspase蛋白的次序激活來實現的[12]。研究表明，氧化損傷可以激活線粒體信號通路，觸發(fā)caspase的級聯反應。而caspase-3和caspase-9是細胞凋亡的必經之路。有實驗證實，過氧化氫損傷可以使星形膠質細胞凋亡過程中caspase-3及caspase-9的活性明顯增強[13]。本實驗結果顯示，模型對照組星形膠質細胞內caspase-3及caspase-9的表達均增加，提示caspases參與氧化損傷的病理生理過程，是星形膠質細胞凋亡的重要調控因子。用RES處理后caspase-3及caspase-9的活性顯著下降，其下降趨勢與RES的劑量和作用時間正相關，提示caspases參與氧化損傷的病理生理過程，是星形膠質細胞凋亡的重要調控因子。

綜上所述，本研究證實RES可以明顯抑制星形膠質細胞凋亡，其抑制凋亡的作用可能是其防止和延緩神經系統相關疾病發(fā)生、發(fā)展的細胞學基礎，從而為尋求有效的防治神經系統損傷藥物提供實驗依據。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.004

Protective Effect of Resveratrol on Oxidative Injury in Astrocytes

WANG Jing, HE Chaoming

(DepartmentofNeurology,NongkenSanyaHospital,HainanProvince,Sanya572000,China)

Objective To investigate the protective effect of resveratrol (RES) against hydrogen peroxide (H2O2)-induced oxidative injury to astrocytes and the related mechanism. Methods Subcultured astrocytes were randomly divided into four groups： negative control group (treated with normal culture medium), model control group (treated with 100 μmol·L-1H2O2for 12 h), resveratrol low dose group (treated with 20 μmol·L-1RES for 24 h H2O2for 12 h) and resveratrol high dose group (treated with 40 μmol·L-1RES for 24 h before H2O2for 12 h).Cell viability was detected by MTT assay, apoptosis rate was detected by flow cytometry, apoptotic cell morphology was detected by hochest33258 staining, and the expression of apoptosis-related factors such as caspase-3 and caspase-9 were measured by colorimetric detection. Results MTT assay showed that after treatment with 5, 10, 20, and 40 μmol·L-1RES for 24 h, cell viability was (100.46±3.17)%, (101.33±3.14)%, (101.33±1.30)%, and (99.67±2.62)%, respectively, and the difference was not statistically significant compared with the negative control group [(98.33±2.13)%,P>0.05].RES showed no effect on astrocyte activity. After treatment with 20 and 40 μmol·L-1RES, astrocyte activity was significantly elevated to (54.67±4.11)% and (70.33±2.61)% compared with model control group (t=3.59, 7.13,P<0.05), RES inhibited hydrogen peroxide-induced decrease in cell viability.Flow cytometry results showed that after treatment with 20, 40 μmol·L-1RES, the apoptosis rate of astrocytes significantly decreased to (35.51±3.56)% and (14.12%±3.19)% (t=4.26, 6.33,P<0.01) compared with model control group (46.31±4.16)%.Hochest 33258 staining showed that RES inhibited hydrogen peroxide-induced cell apoptosis, besides, the RES treatment also could reduce H2O2-induced expression of caspase-3 and caspase-9 in astrocytesin a time-dependent manner. Conclusion RES can inhibit hydrogen peroxide-induced astrocytes apoptosis through inhibiting the expression of caspase-3 and caspase-9, which can provide experimental evidence for its treatment of central nervous disorders.

Resveratrol；Astrocytes；Oxidative damage

2014-07-14

2014-10-15

*三亞市醫(yī)療衛(wèi)生科技創(chuàng)新項目(YW1216)

王景(1981-)，女，海南三亞人，主治醫(yī)師，學士，研究方向：神經內科。電話：(0)13895757226，E-mail：bee21212@163.com。

何超明(1970-)，男，海南三亞人，主任醫(yī)師，學士，研究方向：神經內科。電話：(0)13697558895，E-mail：chen7707177@163.com。

R286；R285.5

A

1004-0781(2015)08-1002-05