陸 暢， 李 斌， 鄭勇奇

(國家林木遺傳育種重點實驗室 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室， 北京 100091)

低溫脅迫下鵝掌楸抗寒性相關基因的差異表達分析

陸 暢， 李 斌， 鄭勇奇①

(國家林木遺傳育種重點實驗室 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室， 北京 100091)

對4 ℃和-30 ℃低溫條件下引種自安徽大別山的1株鵝掌楸〔Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.〕植株頂芽總RNA進行了數字基因表達譜構建和差異表達基因篩選，并對篩選出的抗寒性相關基因進行了實時熒光定量PCR分析。結果表明：獲得的總RNA樣品質量符合實驗要求。數字基因表達譜分析結果表明：每個樣品的質量控制后序列的總長度均在0.5 Gbp以上，堿基錯誤率為0.01%，Q20值超過99%，Q30值為96.99%～97.23%，GC含量為44.97%～47.06%，并且每個樣品比對成功的序列條數占質量控制后序列總數的百分率均在90%以上。差異表達基因篩選結果顯示：共發(fā)現(xiàn)9個與鵝掌楸抗寒性有關的差異表達基因，分別為HSP、MYB、NAC、AP2、Zincfinger、WRKY、FAD、Phospholipase和β-amylase基因。實時熒光定量PCR分析結果表明這9個基因共有3種表達模式，其中，HSP和FAD基因的相對表達量均隨著溫度的降低而減少，表現(xiàn)為基因下調表達；AP2、NAC和Zincfinger基因的相對表達量隨著溫度的降低而增多，表現(xiàn)為基因上調表達；而β-amylase、WRKY、Phospholipase和MYB基因的相對表達量則表現(xiàn)為4 ℃時增加、-30 ℃時減少。從基因的相對表達量來看，最大相對表達量超過5的基因有NAC和WRKY，介于2～5之間的基因有AP2、Zincfinger、β-amylase和MYB，低于2的基因有Phospholipase、HSP和FAD。結果顯示NAC和WRKY基因可能在鵝掌楸的抗寒過程中起主要作用。

鵝掌楸； 低溫脅迫； 抗寒性相關基因； 數字基因表達譜； 差異表達基因； 相對表達量

鵝掌楸〔Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.〕為木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬(LiriodendronLinn.)植物，為中國特有種，屬于少數花葉共賞樹種，并為世界珍貴樹種[1]；鵝掌楸材性良好，具有一定的藥用價值，被列為中國珍稀瀕危保護植物[2]，自然分布于中國南方江西、貴州、福建等省的山地中。在引種栽培過程中，抗寒性差是限制鵝掌楸向北方推廣種植的主要因素。因此，明確鵝掌楸的抗寒機制對于鵝掌楸的推廣種植和培育抗寒品種具有重要意義。然而，目前關于鵝掌楸抗寒性的研究主要集中在表型性狀評價方面[3-4]，尚未見從基因水平上探究鵝掌楸抗寒性的相關研究報道。

目前研究基因功能的方法較多，其中，差減雜交、cDNA代表性差異分析及mRNA差異顯示技術等無法全面系統(tǒng)的分析基因功能，基因克隆技術和遺傳轉化技術則存在實驗周期較長的問題[5]，只有轉錄組測序技術可以實現(xiàn)大規(guī)模轉錄本的快速鑒定和功能分析[6]。因此，轉錄組測序技術已成為研究植物基因功能的重要手段，被廣泛應用于植物的冷適應和低溫響應基因的研究[7-9]。

為了從基因水平上明確鵝掌楸的抗寒機制，作者對4 ℃和-30 ℃低溫條件下來源于鵝掌楸天然分布區(qū)北緣的安徽大別山10年生植株的頂芽總RNA進行數字基因表達譜構建和差異表達基因篩選，并對獲得的抗寒性相關基因進行實時熒光定量PCR分析，以期比較鵝掌楸各抗寒性相關基因間的表達差異，為從基因水平上研究其抗寒機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試樣株引種自鵝掌楸天然分布區(qū)北緣的安徽大別山，種植于中國林業(yè)科學研究院內，為10年生植株。于2014年7月中旬分別采集植株樹冠上、中、下層北側的1年生幼嫩枝條(帶葉，且枝條頂端保留葉芽)，每層各采集3份樣品，每份樣品10個枝條，根據預實驗結果進行低溫凍害實驗。各取1份樹冠上、中、下層枝條，分別混勻后平均分成3組：第1組為對照(CK)，于常溫下立即采集枝條頂芽，并用錫箔紙包裹后迅速投入液氮中，并用液氮罐帶回實驗室，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用；第2組和第3組枝條樣品分別用塑料袋包裝后置于4 ℃冰箱中，24 h后取出；采集第2組枝條的頂芽，用錫箔紙包裹后迅速投入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用，記為T1；同時將第3組枝條樣品迅速放入-30 ℃冰箱中，30 min后取出，采集枝條的頂芽，用錫箔紙包裹后迅速投入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用，記為T2。對各層枝條樣品均如此處理，每個溫度處理各3個重復，共9份樣品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及質量檢測 采用離心柱型RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕分別提取各樣品的總RNA，并利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定獲得的總RNA樣品溶液的濃度及OD260/OD280，并對獲得的總RNA樣品質量進行檢測。將質量檢測合格的總RNA樣品分成兩部分：一部分用于數字基因表達譜構建；另一部分置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后期的實時熒光定量PCR分析。

1.2.2 數字基因表達譜的構建 數字基因表達譜構建過程由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，采用RNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(美國NEBNext?UltraTM公司)、按照操作指南構建表達譜測序文庫。使用帶有Oligo(dT)的小磁珠分離純化出總RNA樣品中的mRNA；隨后加入Fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，并使用隨機引物將待測的mRNA逆轉錄合成單鏈cDNA；加入緩沖液、dNTPs、DNA polymerase Ⅰ和RNase H合成雙鏈cDNA；使用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒(美國Backman公司)純化雙鏈cDNA，并對其進行末端修復、3′末端加polyA尾巴和連接測序接頭等工作，對獲得的產物進行PCR擴增，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化獲得的PCR產物，得到待測序文庫。使用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國Agilent公司)并采用Q-PCR方法對待測序文庫進行質量檢測；使用Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺(美國Illumina公司)進行單端測序(single-end, SE)，測序的序列標簽長度為50 bp。實驗共構建了3個數字基因表達譜數據庫，分別為CK、T1和T2，每個表達譜樣本測序進行3次生物學重復。

1.2.3 差異表達基因的篩選 將上述測序獲得的序列與Nr、Nt、SwissProt、GO、KOG和KEGG數據庫進行比對，獲得上述測序序列的注釋信息；對3個表達譜數據庫進行兩兩組合，比較基因的差異表達水平。共3個比較組合，分別為CK vs. T1、CK vs. T2和T1 vs. T2。本研究中的差異基因篩選條件為q-value <0.005并且|log2(foldchange)|>1。對差異檢驗的p值進行多重假設檢驗校正，并通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)來決定p值。根據測序獲得的轉錄組數據和表達譜測序數據，按基因功能對轉錄組數據中的KEGG代謝通路顯著富集的序列進行分類。對候選基因序列在GenBank中重新進行BLASTx同源性比對，以獲取基因的準確信息。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 從-80 ℃超低溫冰箱中取出總RNA樣品，室溫下解凍后配制逆轉錄反應體系，包括總RNA 0.5 μg、50 μmol·L-1Oligo(dT) 0.5 μL、100 μmol·L-1random 6mers 0.5 μL、5×PrimeScript buffer 2.0 μL和PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL，并用Nuclease-free H2O將反應體系總體積補足至10 μL。將上述反應體系置于9700型PCR儀(美國ABI公司)中于37 ℃保溫15 min完成逆轉錄反應，再于85 ℃保溫5 s終止逆轉錄反應；加入90 μL Nuclease-free H2O，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

采用Roche LCPDS2軟件、根據篩選出的差異表達基因序列設計引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，各引物序列及其擴增的條帶長度見表1。選擇穩(wěn)定表達的18SrRNA作為內參基因進行PCR擴增。在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)上使用LightCycler?480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒(瑞士Roche公司)進行PCR擴增反應，每個擴增反應重復3次。反應體系總體積為10 μL，包括2×LightCycler?480 SYBR Green Ⅰ Master 5 μL、10 μmol·L-1正向引物 0.2 μL、10 μmol·L-1反向引物 0.2 μL、cDNA模板 1.0 μL和Nuclease-free H2O 3.6 μL。擴增程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸各30 s，共40個循環(huán)。擴增反應結束后利用熔解曲線檢測產物特異性：將該反應體系從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每升高1 ℃采集5次熒光信號。

采用2-ΔΔCt法進行基因相對表達量的計算，計算公式為：基因相對表達量=2-ΔΔCt。其中，ΔΔCt計算公式為：ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，實驗組或對照組的ΔCt計算公式為：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)。

表1 用于鵝掌楸差異表達基因實時熒光定量PCR擴增的特異引物序列及擴增條帶長度

Table 1 Sequence and amplified band length of special primers used for real-time fluorescence quantitative PCR amplification of differential expression gene ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.

序列編號No．ofsequence引物序列(5′→3′) Primersequence(5′→3′) 正向引物Forwardprimer 反向引物Reverseprimer擴增條帶長度/bpLengthofamplifiedbandcomp144834＿c1 CATTCTTATGCTCGGTTCTTT TCTCGACTCGAACCATACT114comp118790＿c0 CTCCAAGGGCCTTTGATT TCTGCTCCCATCTCCTCTA113comp133557＿c0 TTCTCTCCAAATAATCGGCG AGTCAAGCCGTTCGTTCA109comp138270＿c0 CCCTCCAATTCGATGACC ACACCTGTTTCCTTTCTTCATA113comp143973＿c0 TATGGTCACCCACAACCG ACTAAAGTTCACACATGGCTA109comp132916＿c0 CAAACCTGCCCTTAATCTAGT GTTGTGGTTCCCTTCGTAT123comp142526＿c0 CATAACAGTATCTGGCAAGGTC TCTGTGTGCTGTGTTGTAGT100comp141644＿c0 ATCAATGGATGGGTTAATGCAA AATTCTCCTTCGACGAGAC107comp137127＿c0 AGCTTGTTAGCGGTTCTAT CCATTACATTGAGAATCGCC11218SrRNA CGGCTACCACATCCAAGGAA GCTGGAATTACCGCGGCT187

2 結果和分析

2.1 總RNA樣品質量的檢測結果分析

檢測結果(表2)顯示：提取獲得的鵝掌楸頂芽總RNA樣品溶液的OD260/OD280介于1.8～2.1之間，說明提取獲得的總RNA樣品的純度較高，雜質污染程度較小，獲得的總RNA樣品的質量能夠滿足后續(xù)實驗的要求；獲得的每份總RNA樣品的總量為34～117 μg，均可以滿足2次或者2次以上后續(xù)實驗的需要量，便于開展3次重復實驗。

電泳檢測結果(圖1)顯示：獲得的總RNA樣品的18S和28SRNA條帶清晰、亮度高，并且后者條帶亮度高于前者，說明獲得的總RNA樣品可用于實時熒光定量PCR分析。

表2 低溫脅迫下鵝掌楸頂芽總RNA質量的檢測結果

Table 2 Detection result of quality of total RNA from apical buds ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg. under low temperature stress

編號1)Number1)濃度/μg·μL-1Concentration體積/μLVolume總量/μgTotalOD260/OD280CK-12．0935732．06CK-20．37100372．03CK-30．9945452．03T1-10．63100632．07T1-20．42135572．06T1-30．9735342．04T2-10．37100372．08T2-20．631851172．01T2-30．5769392．03

1)CK-1，CK-2，CK-3: 表示對照(常溫)的3個重復 Representing three replications of the control (normal temperature); T1-1，T1-2，T1-3: 表示4 ℃低溫處理的3個重復 Representing three replications of 4 ℃ low temperature treatment; T2-1，T2-2，T2-3: 表示-30 ℃低溫處理的3個重復 Representing three replications of -30 ℃ low temperature treatment.

CK-1，CK-2，CK-3: 表示對照(常溫)的3個重復 Representing three replications of the control (normal temperature); T1-1，T1-2，T1-3: 表示4 ℃低溫處理的3個重復 Representing three replications of 4 ℃ low temperature treatment; T2-1，T2-2，T2-3: 表示-30 ℃低溫處理的3個重復 Representing three replications of -30 ℃ low temperature treatment.

圖1 低溫脅迫下鵝掌楸頂芽總RNA檢測的電泳圖譜

Fig. 1 Electrophoretogram of detection of total RNA from apical buds ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg. under low temperature stress

2.2 數字基因表達譜的測序結果分析

對9份鵝掌楸頂芽總RNA樣品的數字基因表達譜進行測序，結果(表3)表明：每個樣品的質量控制后序列的總長度均在0.5 Gbp以上，堿基錯誤率均為0.01%；Q20值均超過99%，Q30值在96.99%～97.23%之間，GC含量為44.97%～47.06%。每個樣品比對成功的序列條數占該樣品質量控制后序列總數的百分率均在90%以上。

2.3 差異表達基因的篩選結果分析

使用log2(foldchange)表示比較組合中某一基因在2個樣品間的表達差異。假設log2(foldchange)值為x，則樣品A對比樣品B的表達倍數(fold change)為2x倍。使用校正后的p值表現(xiàn)基因表達量變化的統(tǒng)計學顯著程度，校正后的p值越小，-log10(校正后的p值)越大，即差異越顯著。在實驗設置的3個比較組合中，CK vs. T2組合的差異表達基因數最多，共有3 485個差異表達基因，包括2 272個上調基因和1 213個下調基因；CK vs. T1組合的差異表達基因有1 687個，包括1 126個上調基因和561個下調基因；T1 vs. T2組合的差異表達基因數最少，僅有152個，包括28個上調基因和124個下調基因。

結合前人關于植物抗寒性相關基因的研究結果[7-9]，共篩選出9個與鵝掌楸抗寒性相關的差異表達基因(表4)。與GenBank數據庫中的相關信息進行同源比對，其中6個差異表達基因(序列編號分別為comp144834_c1、comp118790_c0、comp133557_c0、comp138270_c0、comp143973_c0和comp132916_c0)被認為是潛在的轉錄因子，推測其分別為HSP、MYB、NAC、AP2、Zincfinger和WRKY基因；推測序列編號comp141644_c0的差異表達基因為脂肪酸去飽和酶(fattyaciddesaturase，F(xiàn)AD)基因；推測序列編號comp142526_c0的差異表達基因為與β-淀粉酶合成相關的基因，即β-amylase基因；推測序列編號comp137127_c0的差異表達基因為磷脂酶(Phospholipase)基因。

表3 低溫脅迫下鵝掌楸頂芽總RNA的數字基因表達譜的分析結果1)

Table 3 Analysis result of digital gene expression profile of total RNA from apical buds ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg. under low temperature stress1)

編號2)Number2)NrNqLq/GbpRe/%Q20/%Q30/%GC含量/%GCcontentP/%CK-111560846111253130．560．0199．0997．0647．0693．21CK-211597108111583840．560．0199．1097．1046．2792．89CK-310706615102423430．510．0199．1297．2146．9693．73T1-111323359108704700．540．0199．0596．9946．6092．61T1-210882719104734020．520．0199．0997．1145．6592．60T1-310787546103089740．520．0199．0997．1046．2691．65T2-110508686101308830．510．0199．0297．0444．9792．52T2-210383784100108910．500．0199．1197．2345．7492．47T2-311677850112403800．560．0199．0797．1345．9692．12

1)Nr: 原始序列總條數 Total number of raw reads; Nq: 質量控制后的序列總條數Total number of reads after quality control; Lq: 質量控制后序列的總長度Total length of reads after quality control; Re: 堿基錯誤率Error rate of base; P: 比對成功的序列條數占質量控制后序列總數的百分率Percentage of successfully mapped read number to total read number after quality control.

2)CK-1，CK-2，CK-3: 表示對照(常溫)的3個重復 Representing three replications of the control (normal temperature); T1-1， T1-2， T1-3: 表示4 ℃低溫處理的3個重復 Representing three replications of 4 ℃ low temperature treatment; T2-1，T2-2，T2-3: 表示-30 ℃低溫處理的3個重復 Representing three replications of -30 ℃ low temperature treatment.

表4 低溫脅迫下鵝掌楸差異表達基因的篩選結果

Table 4 Selection result of differential expression gene ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg. under low temperature stresses

序列編號No．ofsequenceGenBank中相似序列的蛋白名稱NameofproteinwithsimilarsequenceinGenBank基因名稱Genename序列長度/bpLengthofsequencecomp144834＿c1HSF30(葡萄Vitisvinifera)HSP2668comp118790＿c0MYB124(大豆Glycinemax)MYB866comp133557＿c0NAC(蘋果Malusdomestica)NAC1141comp138270＿c0AP2/ERF(predicted)(可可Theobromacacao)AP21491comp143973＿c0Zincfingerprotein(擬南芥Arabidopsisthaliana)Zincfinger3633comp132916＿c0WRKY6(野大豆Glycinesoja)WRKY2116comp142526＿c0β-amylase9(predicted)(葡萄Vitisvinifera)β-amylase2176comp141644＿c0UncharacterizedproteinLOC100245192(predicted)(葡萄Vitisvinifera)FAD753comp137127＿c0HypotheticalproteinVITISV＿043921(葡萄Vitisvinifera)Phospholipase1232

2.4 實時熒光定量PCR檢測結果分析

對篩選出的9個鵝掌楸抗寒性相關基因進行實時熒光定量PCR檢測，結果(圖2)表明：篩選出的9個鵝掌楸抗寒性相關基因共有3種表達模式：其中，HSP和FAD基因的相對表達量均隨著溫度的降低而逐漸減少，表現(xiàn)為基因下調表達；AP2、NAC和Zincfinger基因的相對表達量隨著溫度的降低而逐漸增多，表現(xiàn)為基因上調表達；β-amylase、WRKY、MYB和Phospholipase基因的相對表達量則隨著溫度降低表現(xiàn)為4 ℃時增多、-30 ℃時減少。

由圖2還可以看出：在不同低溫脅迫條件下，在9個鵝掌楸抗寒性相關基因中，最大基因相對表達量超過5的高表達基因為NAC和WRKY；最大基因相對表達量在2～5的基因為AP2、Zincfinger、β-amylase和MYB；最大基因相對表達量低于2的低表達基因為HSP、FAD和Phospholipase。

CK: 對照(常溫) The control (normal temperature); T1: 低溫處理(4 ℃) Low temperature treatment (4 ℃);

A:HSP基因HSPgene; B:FAD基因FADgene; C:AP2基因AP2 gene; D:NAC基因NACgene; E:Zinicfinger基因Zinicfingergene; F:β-amylase基因β-amylasegene; G:WRKY基因WRKYgene; H:Phospholipase基因Phospholipasegene; I:MYB基因MYBgene.

圖2 低溫脅迫下鵝掌楸9個抗寒性相關基因相對表達量的變化

Fig. 2 Change in relative expression of nine cold resistance related genes ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg. under

low temperature stress

3 討 論

轉錄因子(transcription factor)既是植物對冷脅迫特異性反應的開關，又是信號傳導的終點[6]。上調表達的轉錄因子很可能在植物防御和應激反應中起到重要作用[10-11]。本研究中，隨著低溫脅迫溫度的降低，基因表達上調的3個基因AP2、NAC和Zincfinger均為轉錄因子類基因，其中AP2和Zincfinger基因的相對表達量變化幅度在25 ℃降溫至4 ℃的過程中最大，而NAC基因的相對表達量變化幅度則在4 ℃降溫至-30 ℃的過程中最大；并且，NAC基因的最大相對表達量超過5。陳新[12]的研究結果表明：NAC基因能夠參與植物對冷脅迫的響應，并調控植物的開花過程，而且還能夠誘導SNAC2等基因的表達，提高植物對冷和鹽脅迫的抗性。據此推測該基因可能與鵝掌楸的抗寒性密切相關。

為了達到滲透平衡，植物體可積累包括可溶性糖、糖醇和低分子量化合物在內的物質作為應對冷脅迫的低溫保護劑[13]。因此，參與上述物質相關新陳代謝的基因同樣會在植物對低溫脅迫的響應過程中發(fā)生表達量的變化。β-淀粉酶可以將淀粉降解為可溶性糖，鵝掌楸的β-淀粉酶基因在25 ℃降溫至4 ℃的過程中表現(xiàn)為上調表達，而在4 ℃降溫至-30 ℃的過程中則表現(xiàn)為下調表達。根據鄧菊慶等[14]的研究結果推斷：溫度下降初期，淀粉酶活性提高，可溶性糖含量隨之升高，細胞膜流動性增強，從而提高鵝掌楸的抗寒性；但是，當溫度持續(xù)下降至極端低溫時，淀粉酶活性受到抑制，可溶性糖合成受阻，細胞膜流動性減弱，從而使鵝掌楸的抗寒性也隨之減弱。植物遇冷害后，凍害造成細胞脫水致使膜系統(tǒng)首先受到傷害，脂肪酸去飽和酶起到調節(jié)不飽和脂肪酸的作用，從而進一步調節(jié)細胞膜的流動性。徐呈祥[15]認為：植物細胞膜中的不飽和脂肪酸含量越高，其抗寒性越強。本研究中鵝掌楸的FAD基因在低溫脅迫過程中始終表現(xiàn)為下調表達，說明隨著溫度的降低，鵝掌楸體內的脂肪酸去飽和酶活性降低，不飽和脂肪酸合成減少，細胞膜的流動性減弱，從而使鵝掌楸的抗寒性減弱。磷脂酶是植物體內重要的磷脂水解酶，兼具跨膜信號轉導的作用，能夠影響植物的抗凍性[16]。鵝掌楸的Phospholipase基因在25 ℃降溫至4 ℃的過程中表現(xiàn)為上調表達，說明在對低溫環(huán)境的響應過程中鵝掌楸的抗寒性增強，但是該基因在4 ℃降溫至-30 ℃的過程中表現(xiàn)為下調表達，這一變化是否與-30 ℃造成鵝掌楸細胞組織損傷、致使該基因無法正常表達有關，尚待進一步研究。

總體而言，通過數字基因表達譜技術從鵝掌楸頂芽總RNA中共篩選出9個差異表達基因，這9個基因均與鵝掌楸的抗寒性有關，表現(xiàn)為3種表達模式，其中NAC和WRKY基因的相對表達量最大，推測這2個基因可能在鵝掌楸的抗寒過程中起到主要作用。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志: 第三十卷第一分冊[M]. 北京: 科學出版社, 1980: 196-198．

[2] 傅立國. 中國植物紅皮書: 稀有瀕危植物(第一冊)[M]. 北京: 科學出版社, 1992: 408-409.

[3] 吳 君, 李慶衛(wèi), 王 悅. 不同小氣候對雜種鵝掌楸凍害情況的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學, 2013, 41(3): 165-167.

[4] 姜 磊, 王恭祎. 華北地區(qū)鵝掌楸屬樹種苗木生長特性初探[J]. 林業(yè)應用技術, 2007(6): 4-6.

[5] WANG J M, YANG Y, LIU X H, et al. Transcriptome profiling of the cold response and signaling pathways inLiliumlancifolium[J]. BMC Genomics, 2014, 15: 203-222.

[6] ZHANG G J, GUO G W, HU X D, et al. Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome[J]. Genome Research, 2010, 20: 646-654.

[7] PANG T, YE C Y, XIA X L, et al. De novo sequencing and transcriptome analysis of the desert shrub,Ammopiptanthusmongolicus, during cold acclimation using Illumina/Solexa[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 488-502.

[8] XU W R, LI R M, ZHANG N B, et al. Transcriptome profiling ofVitisamurensis, an extremely cold-tolerant Chinese wildVitisspecies, reveals candidate genes and events that potentially connected to cold stress[J]. Plant Molecular Biology, 2014, 86: 527-541.

[9] WANG X C, ZHAO Q Y, MA C L, et al. Global transcriptome profiles ofCamelliasinensisduring cold acclimation[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 415-430.

[10] SINGH K B, FOLEY R C, OATE-SNCHEZ L. Transcription factors in plant defense and stress responses[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2002, 5: 430-436.

[11] SARAH F, THOMASHOW MF. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway[J]. Plant Cell， 2002, 14： 1675-1690.

[12] 陳 新. 榛子花芽轉錄組文庫的Solexa測序及冷調節(jié)基因的表達譜分析[D]. 北京: 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所, 2011: 35-38.

[13] XIN Z， BROWSE J. Cold comfort farm: the acclimation of plants to freezing temperatures[J]. Plant， Cell and Environment， 2000, 23： 893-902.

[14] 鄧菊慶， 蹇洪英， 李淑斌， 等. 五種野生薔薇屬植物抗寒力的綜合評價[J]. 西南師范大學學報： 自然科學版， 2012， 37(4)： 70-75.

[15] 徐呈祥. 提高植物抗寒性的機理研究進展[J].生態(tài)學報， 2012, 32(24)： 7966-7980.

[16] 曾正兵， 梅旭榮， 鐘秀麗， 等. 磷脂酶Dα在擬南芥低溫馴化過程中的作用途徑分析[J]. 基因組學與應用生物學， 2009， 28(4)： 703-708.

(責任編輯： 佟金鳳)

Analysis on differential expression of cold resistance related genes ofLiriodendronchinenseunder low temperature stress

LU Chang, LI Bin, ZHENG Yongqi①

(State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry， Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Beijing 100091, China),J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(3): 25-31

Under 4 ℃ and -30 ℃ low temperature conditions, digital gene expression profile of total RNA from apical buds of one individual ofLiriodendronchinense(Hemsl.) Sarg. introduced from Dabieshan of Anhui was constructed and differential expression genes were selected, and cold resistance related genes selected were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The results show that qualities of total RNA samples obtained meet the experimental requirements. Analysis results of digital gene expression profile show that total length of reads after quality control of each sample is above 0.5 Gbp, error rate of base is 0.01%, Q20 value is more than 99%, Q30 value is 96.99%-97.23%, GC content is 44.97%-47.06%, and percentage of successfully mapped read number to total read number after quality control of each sample is above 90%. Selection result of differential expression genes shows that nine differential expression genes related to cold resistance ofL.chinenseare founded totally, they areHSP,MYB,NAC,AP2,Zincfinger,WRKY,FAD,Phospholipaseandβ-amylasegenes, respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis result shows that these nine genes have three expression modes, in which, relative expressions ofHSPandFADgenes both decrease with decreasing of temperature, appearing gene down-regulated expression; those ofAP2,NACandZincfingergenes increase with decreasing of temperature, appearing gene up-regulated expression; while those ofβ-amylase,WRKY,PhospholipaseandMYBgenes appear increasing at 4 ℃ and decreasing at -30 ℃. On the view of gene relative expression, genes with maximum relative expression over 5 areNACandWRKY, genes with that between 2-5 areAP2,Zincfinger,β-amylaseandMYB, and genes with that under 2 arePhospholipase,HSPandFAD. It is suggested thatNACandWRKYgenes may play a major role in the process of cold resistance ofL.chinense.

Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.; low temperature stress; cold resistance related gene; digital gene expression profile; differential expression gene; relative expression

2015-05-31

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD01B06)

陸 暢(1986—)，女，安徽蚌埠人，博士研究生，主要研究方向為林木遺傳育種。

①通信作者 E-mail： zyq8565@126.com

Q948.112+.2； Q946-33； S792.21

A

1674-7895(2015)03-0025-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.03.04