韋可聰 朱云中 梁韡斌 張高煉

低氧預處理激活神經(jīng)元細胞JAK/STAT并促進血管內(nèi)皮生長因子受體-2的表達

韋可聰 朱云中 梁韡斌 張高煉

目的 研究低氧預處理對神經(jīng)元細胞Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號通路以及血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)表達的影響。方法 將培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元細胞分為細胞對照組、細胞類缺血組和細胞低氧預處理組，細胞類缺血組細胞經(jīng)95% NO2+5% CO2混合氣體處理30 min，細胞低氧預處理組細胞于89%N2、l%O2和10%CO2環(huán)境中處理8次，每次20 min，2 d后進行類缺血處理。定量分析各組細胞中VEGFR-2、JAK及STAT蛋白磷酸化(p-STAT)的表達變化。細胞轉(zhuǎn)染JAK 特異性小干擾RNA(siRNA)，之后進行低氧預處理和類缺血處理，檢測p-STAT和VEGFR-2的表達。另取45只BALB/c小鼠分為動物對照組(n=8)、動物對照+血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)組(n=7)、動物腦缺血組(n=8)、動物腦缺血+VEGF組(n=7)、動物低氧預處理組(n=8)和動物低氧預處理+VEGF組(n=7)，分析各組海馬神經(jīng)元細胞p-STAT和VEGFR-2的表達，并檢測細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase 3)的活化情況。結(jié)果 與細胞對照組相比較，細胞類缺血組細胞中VEGFR-2 mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與細胞類缺血組相比，細胞低氧預處理組細胞VEGFR-2 mRNA表達上調(diào)(P<0.05)，并促進JAK mRNA和蛋白的表達(P<0.05)以及STAT蛋白的活化(P<0.05)。與非特異性轉(zhuǎn)染組相比，JAK沉默組細胞p-STAT和VEGFR-2的表達顯著降低(均P<0.05)。在小鼠體內(nèi)，腦缺血降低p-STAT和VEGFR-2的表達(P<0.05)，而低氧預處理則可有效逆轉(zhuǎn)缺氧對p-STAT和VEGFR-2的抑制(P<0.05)。與動物腦缺血+VEGF組相比，動物低氧預處理+VEGF干預可顯著抑制caspase3的活化(P<0.05)。結(jié)論 低氧預處理可以激活神經(jīng)元細胞JAK/STAT信號通路并誘導VEGFR-2的表達，并增強VEGF的神經(jīng)保護作用。

缺氧，腦；缺血預處理；細胞內(nèi)信號肽和蛋白質(zhì)類；Janus激酶類；JAK/STAT；血管內(nèi)皮生長因子受體-2

腦缺血預處理可誘導機體產(chǎn)生缺血耐受[1]，而低氧預處理能使許多器官對再次的缺血缺氧有保護作用，可以誘發(fā)機體的自我保護機制[2]。低氧預處理誘導缺血耐受與細胞內(nèi)多種分子機制相關(guān)，其中包括誘導血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)合成[3-4]。血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2，VEGFR-2)是VEGF受體之一，研究發(fā)現(xiàn)VEGFR-2的表達與Janus激酶(Januskinase，JAK)/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(signaltransducersandactivatorsoftranscription，STAT)相關(guān)[5]，然而目前尚不清楚低氧預處理誘導的神經(jīng)保護是否與VEGFR-2表達及JAK/STAT激活有關(guān)。本研究利用低氧預處理培養(yǎng)的神經(jīng)元和小鼠，觀察小鼠海馬神經(jīng)元和培養(yǎng)神經(jīng)元VEGFR-2及JAK/STAT的表達變化，旨在為闡明缺血耐受機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 觀察

1.1.1 神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：選取新生24h內(nèi)的BALB/c小鼠，乙醇消毒后處死取腦，分離腦海馬，用0.25%(質(zhì)量濃度)的胰酶結(jié)合機械吹打的方法制備單細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞水平至106/mL，種板。首次換液于種板24至48h進行，培養(yǎng)到第3～4天。加入阿糖胞苷(10μmol/L)抑制膠質(zhì)細胞生長，純化神經(jīng)元。處理1～2d后全量換液，以后每周換液2～3次，每次半量換液。

1.1.2 實驗動物：45只成年雄性BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，體質(zhì)量20～35g，飼喂在(24±2)℃，(50±10)% 相對濕度條件下。實驗動物的使用嚴格遵守本院倫理道德委員會制定的指導原則，并且盡量減輕實驗動物所受的損傷和痛苦。

1.2 主要試劑 阿糖胞苷和MEM培養(yǎng)基購自Gibico公司，噻唑藍(MTT)試劑購自美國Amresco公司，RNA-SolveReagent試劑盒購自Invitrogen，DyNAmoSYBRGreenqPCR試劑盒購自寶生物工程有限公司，兔抗鼠p-STAT抗體、procaspase3和cleavagecaspase3以及酶標羊抗兔二抗均購自英國Abcam。

1.3 方法

1.3.1 低氧預處理：將培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞分為3組，即細胞對照組、細胞類缺血組和細胞低氧預處理組。(1)細胞低氧預處理組：將神經(jīng)元接種于24孔培養(yǎng)板中，定時將細胞移入2000cm3充有低氧氣體(89%N2+l%O2+10%CO2，均為體積分數(shù))的恒溫密閉容器內(nèi)(保持溫度36℃)，低氧條件下處理20min后立即取出，再恢復常氧培養(yǎng)。細胞每天定時接受20min低氧預處理，并反復處理8次，之后進行類缺血處理。(2)細胞對照組：在常氧環(huán)境中培養(yǎng)。(3)細胞類缺血組：直接進行類缺血處理：將神經(jīng)元細胞移入37℃恒溫密閉容器中，連續(xù)充以95%NO2+5%CO2(均為體積分數(shù))混合氣體，流速為20mL/min，持續(xù)30min。

1.3.2 小鼠腦缺血造模及分組：參考Koizumi等[6]與Longa等[7]方法，采用頸內(nèi)動脈尼龍線(3-0)線栓法，建立小鼠腦缺血模型。術(shù)中保留自主呼吸，體溫由肛溫探頭連接多功能監(jiān)測儀(Spacelab，USA)監(jiān)測，并用烤燈維持在37.0～37.5℃。所有造模小鼠均造模成功，未發(fā)生死亡現(xiàn)象。將45只小鼠隨機分為動物對照組、動物腦缺血組、動物低氧預處理組，每組15只。動物對照組小鼠只分離中動脈但不夾閉。動物低氧預處理組小鼠先置于8%O2+92%N2(均為體積分數(shù))的環(huán)境中處理2h，而后建立腦缺血模型。各組動物隨機抽選7只接受VEGF治療，經(jīng)尾靜脈注射5μg/mLVEGF鹽溶液,共治療7d，另8只小鼠處死用于檢測p-STAT和VEGFR-2表達。

1.3.3MTT法檢測細胞的生長情況：各組細胞經(jīng)處理后棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，每孔加入MTT100μL(終濃度為0.15mg/mL)，置于5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4～6h，加入10%(質(zhì)量濃度)十二烷基硫酸鈉與50%(體積分數(shù))異丙醇(100μL/孔)助溶。37℃放置過夜后于全自動酶標儀490nm波長處測定吸光度〔D(λ)〕值。實驗重復3次，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

1.3.4siRNA的合成和轉(zhuǎn)染：根據(jù)JAK的基因序列，設(shè)計含有SalⅠ 和XbaⅠ酶切位點的siRNA序列，序列1為：5′-GTCGACGTCTTGGTCTACAGGCTACGCTCTAGA-3′，序列2為：5′-GTCGACCAGTTACAAAGCCTGTCTGCCTCTAG-A-3′，引物通過SalⅠ-XbaⅠ限制性位點克隆到shRNA質(zhì)粒pAVU6+27中，重組質(zhì)粒序列由測序進行鑒定。陰性對照siRNA序列為：5′-GTCGACAGTTCACAACTAGCTCGTCCGTC-TAGA-3′，序列由上海生工合成。細胞接種到24孔培養(yǎng)板中，取5 μL LipofectamineTM2000稀釋到250 μL減血清培養(yǎng)基MEM(minimum essential media)培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；取8.0 μL siRNA稀釋到上述含5 μL LipofectamineTM2000的250 μL減血清MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育20 min。取50 μL siRNA-Lipofectamine復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖動混勻，37 ℃，5% (體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率為17.5%。

1.3.5 熒光定量PCR方法檢測mRNA表達水平:利用RNA-Solve Reagent 試劑盒提取培養(yǎng)神經(jīng)元細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板合成VEGFR-2、JAK基因片斷擴增，擴增所用引物如表1所示。擴增產(chǎn)物電泳后染色、觀察?；虮磉_的測定采用DNA Engine OpticonTM2熒光檢測系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒。目的基因和β-actin 基因的拷貝數(shù)分別根據(jù)產(chǎn)生的Ct值從各自的標準曲線獲得。取3次重復的平均值，用目的基因的拷貝數(shù)除以β-actin 的拷貝數(shù)作為靶基因的相對表達量。

表 1 實時熒光定量PCR擴增基因引物序列

1.3.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達:提取神經(jīng)元細胞中總蛋白，先進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。之后將膜放在10 mL封閉液中(2%脫脂奶粉)1 h；加入兔抗鼠p-STAT抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(procaspase 3)和 裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleavage caspase 3)(1∶1000)，4℃過夜孵育；加入酶標羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育2 h；化學法發(fā)光，在暗盒中覆蓋X光膠片曝光。膠片拍照，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料采用均值±標準差表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧預處理促進神經(jīng)元細胞VEGFR-2表達 與細胞對照組相比較，細胞類缺血組細胞VEGFR-2 mRNA表達下調(diào)(P<0.05)；與細胞類缺血組相比，低氧預處理組細胞VEGFR-2 mRNA表達上調(diào)(P<0.05)(圖1)。VEGFR-2蛋白水平的變化與其mRNA水平變化一致(圖2)。

VEGFR-2：血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2；與細胞對照組比較，aP<0.05；與細胞類缺血組比較，bP<0.05。圖2同

圖1 qRT-PCR法檢測各組小鼠細胞VEGFR-2 mRNA表達

圖2 Western blot分析各組小鼠細胞VEGFR-2蛋白表達水平

2.2 低氧預處理促進JAK/STAT信號通路活化 與細胞對照組相比，細胞類缺血組中JAK mRNA和蛋白表達下降，STAT磷酸化受到抑制。與細胞類缺血組相比，細胞低氧預處理組JAK mRNA和蛋白的表達上調(diào)(P<0.05)，同時也促進了STAT蛋白的活化(P<0.05)(圖3、圖4)。

與細胞對照組比較，aP<0.05；與細胞類缺血組比較，bP<0.05。圖4同

圖3 qRT-PCR法檢測各組小鼠細胞JAK mRNA表達水平

2.3 低氧預處理對VEGFR-2表達的影響 與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA對照組相比，沉默JAK組p-STAT和VEGFR-2表達顯著降低(均P<0.05)(圖5)，表明低氧預處理通過JAK/STAT信號通路調(diào)控VEGFR-2的表達。

2.4 低氧預處理促進小鼠海馬神經(jīng)元JAK/STAT信號通路活化和VEGFR-2表達 與動物對照組相比，動物腦缺血組小鼠海馬神經(jīng)元p-STAT和VEGFR-2表達下降(P<0.05)；與動物類缺血組相比，低氧預處理則可有效逆轉(zhuǎn)缺氧對p-STAT和VEGFR-2的抑制(P<0.05)(圖6)。

圖4 Western blot分析各組小鼠細胞JAK和p-STAT蛋白表達水平

VEGFR-2：血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2，p-STAT：信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白磷酸化，圖6同；與非特異轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.05

圖5 Western blot分析各組小鼠細胞蛋白表達水平

2.5 低氧預處理+VEGF治療可逆轉(zhuǎn)小鼠神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生 動物腦缺血+VEGF組小鼠活化的 caspase3表達高于動物對照+VEGF組(P<0.05)；而與動物腦缺血+VEGF組相比，動物低氧預處理+VEGF組活化的 caspase3則顯著降低(P<0.05)(圖7)。

3 討論

低氧預處理能夠誘導產(chǎn)生局灶性缺血耐受，全腦(心)缺血耐受和新生兒缺血耐受[8]。Gidday等首先發(fā)現(xiàn)將剛出生的小鼠用含8%(體積分數(shù))O2的低氧條件預處理3 h，在預處理后1 d可顯著保護小鼠因缺血損傷誘導的休克[9]。之后，很多實驗都對動物低氧預處理進行研究，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)短時間的低氧環(huán)境暴露可誘導小鼠產(chǎn)生缺血耐受[10]。研究發(fā)現(xiàn)低氧預處理可通過多種分子包括腺苷[11]、鉀通道[12]、低氧誘導因子(HIF)[13]、VEGF[14]等誘導耐受。本研究觀察到類缺血處理神經(jīng)元細胞誘導VEGFR-2表達降低，而低氧預處理則促使VEGFR-2表達升高，提示低氧預處理誘導缺血耐受以及對神經(jīng)元的保護作用與VEGF受體相關(guān)。腦缺血耐受的誘導與神經(jīng)元細胞內(nèi)多種信號通路的激活及多種蛋白的合成有關(guān)。同時研究證據(jù)也表明細胞中JAK/STAT信號通路的活化能夠影響細胞分裂增殖等重要生理過程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)類缺血處理降低了神經(jīng)元中JAK mRNA的表達水平，同時也降低了細胞中p-STAT表達量，與之相反，低氧預處理顯著上調(diào)JAK表達水平并且也促進p-STAT的表達，表明低氧預處理可活化神經(jīng)元細胞中JAK/STAT信號通路。

與動物對照組比較，aP<0.05；與動物腦缺血組比較，bP<0.05

圖6 Western blot分析各組小鼠海馬神經(jīng)元p-STAT和VEGFR-2蛋白表達水平

與動物對照+VEGF組比較，aP<0.05；與動物腦缺血+VEGF 組比較，bP<0.05

圖7 Western blot分析各組小鼠海馬神經(jīng)元procaspase3和cleavage caspase3蛋白表達水平

有研究表明，VEGFR的表達受到JAK/STAT的調(diào)控。Dudley等在小血管內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境可以誘導JAK/STAT通路的活化并導致細胞VEGFR表達升高[16]。本研究利用siRNA沉默神經(jīng)元中的靶基因JAK，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)低氧預處理和類缺血處理后，其中p-STAT和VEGFR-2蛋白水平顯著降低，表明低氧預處理對VEGFR-2的表達影響可能受JAK/STAT信號通路調(diào)控。在小鼠海馬神經(jīng)元中，腦缺血處理降低了細胞的p-STAT和VEGFR-2表達水平，然而低氧預處理顯著上調(diào)兩者的表達量，表明低氧預處理可在小鼠體內(nèi)誘導JAK/STAT通路活化并誘導VEGFR表達。

某些研究顯示注射外源VEGF常用于腦缺血后的神經(jīng)元保護[17]。Sun等通過在大鼠缺血再灌注1～3 d后腦靜脈注射VEGF發(fā)現(xiàn)VEGF可顯著減少大腦壞死面積，改善神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，增強新生神經(jīng)元的存活時間并刺激血管再生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧預處理+VEGF組中活性caspase 3顯著低于腦缺血+VEGF組，其原因可能是低氧預處理上調(diào)了神經(jīng)元細胞中VEGFR-2的表達從而增加了VEGF的治療效果。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示低氧預處理能夠通過活化JAK/STAT通路而上調(diào)類缺血處理神經(jīng)元細胞中VEGF受體(VEGFR-2)的表達，這在腦缺血小鼠模型中也得到驗證，同時低氧預處理也增強了VEGF對腦缺血小鼠的神經(jīng)保護作用。低氧預處理誘導缺血耐受的具體機制還不完全清楚，誘導神經(jīng)保護作用是其中的重要部分，尚需進一步研究證明。

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(本文編輯：時秋寬)

Hypoxia preconditioning activates JAK/STAT signaling and promotes vascular endothelial growth factor receptor-2 expression in neurons

WEIKecong,ZHUYunzhong,LIANGWeibing,ZHANGGaolian*.

*Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning Guangxi 530023, China

ZHANGGaolian,Email:submission029@gmail.com

ObjectiveToinvestigatetheeffectofhypoxiapreconditioningonJAK/STATsignalingandvascularendothelialgrowthfactorreceptor-2(VEGFR-2)expressionofneurons.MethodsCulturedmouseprimaryneuronsweredividedintocontrol,ischemiaandhypoxiapreconditioninggroup.Neuronsinischemiagroupweretreatedwith95%NO2+5%CO2for30minandcellsinhypoxiapreconditioninggrouppretreatedwith89%N2,l%O2and10%CO2for8times,eachfor20min,followedbyischemiatreatment.Attheendofthetreatment,VEGFR-2mRNAandproteinexpressionsaswellastheexpressionofJAKandphosphorylatedSTAT(p-STAT)inneuronswereanalyzed.Moreover,neuronsweretransfectedwithJAKspecificsiRNApriortohypoxiapreconditioningandischemiatreatment.Then,p-STATandVEGFR-2expressionswereanalyzed.Furthermore,forty-fiveBALB/cmicewererandomizedintocontrol(n=8),control+VEGF(n=7),ischemia(n=8),ischemia+VEGF(n=7),hypoxiapreconditioning(n=8),hypoxiapreconditioning+VEGFgroups(n=7).Afterthetreatment,neuronsinhippocampuswereseparatedfortheanalysisofp-STATandVEGFR-2expressionsalongwiththeactivationofcaspase3protein.ResultsComparedwiththecontrol,theexpressionsofVEGFR-2mRNAweremarkedlydownregulated(P<0.05)byischemia.Comparedwiththeischemicgroup,hypoxiapreconditioningsignificantlyelevatedtheexpressionsofVEGFR-2mRNA,JAKmRNAandprotein,andthephosphorylationofSTAT.ComparedwithnonspecificsiRNAgroup,knockdownofJAKinhibitedthelevelsofp-STATandVEGFR-2expression.Inmousemodels,ischemiasignificantlydownregulatedtheexpressionsofp-STATandVEGFR-2,whichwerereversedbyhypoxiapreconditioning.Comparedwithischemia+VEGFgroup,hypoxiapreconditioning+VEGFremarkablyinhibitedtheactivationofcaspase3.ConclusionsHypoxiapreconditioningmightactivateJAK/STATandinduceVEGFR-2expressions,leadingtoenhancementofneuroprotectioninducedbyVEGFinneuronsafterischemiatreatment.

brain,hypoxia;ischemicpreconditioning;intracellularsignalingpeptidesandproteins;januskinases;JAK/STAT;vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.010

530023 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

張高煉，Email: submission029@gmail.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0040-06

2014-05-30)