馬茜 朱潔 王辛 王愛紅

牛肉水煮液對腦缺血大鼠外周血白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的影響

馬茜 朱潔 王辛 王愛紅

目的 觀察不同劑量牛肉水煮液對局灶性腦缺血大鼠血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組及低劑量〔200 mg/(kg·d)〕、中劑量〔400 mg/(kg·d)〕和高劑量〔600 mg/(kg·d)〕牛肉水煮液組，每組12只。采用線栓法復(fù)制局灶性大腦中動(dòng)脈缺血模型，造模后2 h用Longa法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，造模后7 d，再次進(jìn)行神經(jīng)功能評分；用2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法測定腦梗死體積；用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定血清IL-6、TNF-α水平。結(jié)果 造模2 h和7 d后，各劑量牛肉水煮液組Longa評分和模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；和模型組相比，中、高劑量牛肉水煮液組大鼠腦梗死體積分?jǐn)?shù)明顯減小(P<0.01)；與假手術(shù)組相比，模型組血清IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，給予高劑量牛肉水煮液組可明顯降低其水平(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論 高劑量牛肉水煮液可顯著改善腦缺血大鼠的腦梗死體積，降低血清IL-6、TNF-α水平，這可能是牛肉水煮液對腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

牛肉水煮液；局灶性腦缺血；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

腦卒中是世界第三大致死性疾病，其中缺血性腦卒中占85%[1]，是最常見的類型。隨著對缺血性腦損傷的機(jī)制研究越來越深入，腦缺血后的炎性反應(yīng)及其損傷作用日益受到關(guān)注。在腦缺血損傷病理過程中有許多炎性介質(zhì)參與，白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均是重要的炎性細(xì)胞因子，二者相互作用[2]，在腦缺血后炎性反應(yīng)中起重要作用。本課題組前期開發(fā)的牛肉水煮液中含有豐富的肌肽，而肌肽能調(diào)節(jié)腦缺血后的免疫功能，具有腦保護(hù)作用[3]。本研究通過觀察富含肌肽的牛肉水煮液對腦缺血后血清炎性因子IL-6、TNF-α水平的影響，旨在探討其對腦缺血大鼠炎性損傷的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 成年健康雄性SD(SpragueDawley)大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量(300±20)g，合格證號：SCXK(京)2012-0001，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度控制在(19～26)℃，12h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前12h禁食。

1.2 主要試劑和儀器 包括栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司)、大鼠IL-6血清檢測ELISA試劑盒(南京建成生物公司)、大鼠TNF-α血清檢測ELISA試劑盒(南京建成生物公司)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，美國Sigma公司)、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器公司)、酶標(biāo)儀(VICTORTMX3，美國PerkinElmer公司)、臺式高速離心機(jī)(Allegra64R，美國BeckMan公司)、恒溫隔水培養(yǎng)箱(GNP-9050，上海精宏儀器公司)。

1.3 方法

1.3.1 牛肉水煮液制備：精選牛腿肉，去血、去油脂，準(zhǔn)確稱重1kg，切成2cm3的方塊，用絞肉機(jī)將肉塊絞成肉糜。將自來水和肉糜同放入鍋中，牛肉糜/水=1∶2，利用功率調(diào)節(jié)器，使牛肉湯2h沸騰，沸騰后繼續(xù)熬制10h，總計(jì)12h。撇去浮油，倒出牛肉湯后，用漏勺把湯中的牛肉大體濾除，再用紗布二次過濾，最終得到牛肉水煮液約1500mL。最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮25倍，得到約60mL濃縮液。經(jīng)S-433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀分析，濃縮液中肌肽含量為36.34mg/mL，占氨基酸總量的63.05%。

1.3.2 腦缺血模型制作與分組：參照Longa等[4]線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。假手術(shù)組操作步驟同MCAO模型，血管分離后不插線栓。 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及低、中、高劑量牛肉水煮液組，每組12只。排除造模失敗、死亡和血標(biāo)本發(fā)生溶血的情況，最終各組用于統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析的大鼠只數(shù)分別為假手術(shù)組8只，模型組9只，低劑量牛肉水煮液治療組6只，中劑量牛肉水煮液治療組6只，高劑量牛肉水煮液治療組9只。

1.3.3 給藥：根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》[5]及動(dòng)物與人劑量換算方法[6]，牛肉水煮液劑量的確定以湯中肌肽含量為標(biāo)準(zhǔn)，低、中、高劑量組分別按體質(zhì)量200、400、600mg/(kg·d)牛肉水煮液灌胃，分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的10、20、30倍。于術(shù)后2h第1次給藥，之后每天早晚各給藥1次，持續(xù)7d。假手術(shù)組和模型組給予相同體積的生理鹽水。

1.3.4 神經(jīng)功能評分：采用Longa等[4]評分方法，于大鼠MCAO術(shù)后清醒約2h和7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無神經(jīng)功能缺失，活動(dòng)正常；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，爬行時(shí)出現(xiàn)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，爬行時(shí)向癱瘓側(cè)傾倒；4分，不能自行行走，有意識障礙。得分越高表明神經(jīng)功能缺損程度越重，相反損害較輕。術(shù)后評分1～3分者為MCAO模型制作成功；0分、4分者均視為MCAO模型制作失敗，剔除。

1.3.5 腦組織切片TTC染色：術(shù)后7d，將每組6只大鼠用10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，迅速在冰皿上斷頭取腦，放入-20 ℃冰箱冰凍20min，將其置于大鼠腦切片模具中，去嗅球和低位腦干，間隔2mm連續(xù)冠狀切片5片，將腦片置入2%(質(zhì)量濃度)TTC溶液中，在37 ℃條件下避光孵育30min。正常腦組織為深紅色，腦梗死區(qū)呈灰白色。再將腦片置于4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中固定24h，用數(shù)碼相機(jī)拍照，ImagePro-Plus6.0分析圖像。腦梗死體積分?jǐn)?shù)(%)=患側(cè)梗死面積/對側(cè)半腦面積×100%。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)：術(shù)后7d，各組大鼠用10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，左心室取血，全血在37 ℃環(huán)境下孵育30min，以587 g離心10min(低溫)，吸取上清，立即放入-80℃冰箱冷凍保存。采用ELISA方法檢測血清中IL-6、TNF-α的水平，實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書逐步操作，最后在酶標(biāo)儀450nm處測吸光度〔D(λ)〕值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(腦梗死體積、血清IL-6、TNF-α水平)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，兩兩比較采用LSD法；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))表示，采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參Kruskal-Wallis檢驗(yàn)(神經(jīng)功能評分)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，模型組和牛肉水煮液組造模后均出現(xiàn)肢體癱瘓，且各劑量牛肉水煮液組神經(jīng)功能評分與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模后7d，模型組和治療組仍存在神經(jīng)功能缺陷，和模型組相比，各劑量的牛肉水煮液治療組神經(jīng)功能評分均呈下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表 1 各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較

注：表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)(第25百分位數(shù)，第75百分位數(shù))

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術(shù)組腦組織無梗死灶，模型組和各治療組右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的大腦皮質(zhì)、紋狀體等處可見明顯梗死灶(圖1)。模型組以及低、中、高劑量牛肉水煮液組腦梗死體積分?jǐn)?shù)分別為(40.82±4.86)%、(33.95±3.62)%、(21.76±3.54)%、(21.19±5.50)%，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.463，P<0.05)，且中、高劑量牛肉水煮液組腦梗死體積分?jǐn)?shù)較模型組減小(P<0.01)。

圖1 各組大鼠腦缺血7 d后腦梗死體積比較(TTC染色)

2.3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較 模型組大鼠腦缺血后7 d，IL-6和TNF-α水平與假手術(shù)組比較明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量牛肉水煮液組IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.01和P<0.05)；另外，高劑量牛肉水煮液組IL-6水平較低劑量組顯著降低(P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

表 2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較

注：IL-6：白細(xì)胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

3 討論

缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病，病死率和致殘率均高。腦缺血后損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理級聯(lián)反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)等，其中過度炎性免疫反應(yīng)存在于腦梗死壞死及缺血區(qū)域，導(dǎo)致炎性損傷。IL-6和TNF-α作為重要的炎性細(xì)胞因子，是炎癥損傷信號鏈中的上游信號分子，介導(dǎo)了炎性損傷和損傷修復(fù)信號網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)。腦缺血損傷早期，局部受損的神經(jīng)元、大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及活化小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α，介導(dǎo)局部炎性反應(yīng)。隨著血液再通或血-腦屏障結(jié)構(gòu)的破壞，中樞腦區(qū)炎性損傷相關(guān)的炎性反應(yīng)信號可通過血液傳遞至外周，活化外周免疫系統(tǒng)中的炎性細(xì)胞，釋放炎性因子[7]。該研究結(jié)果顯示，模型組大鼠外周血清中可見大量IL-6和TNF-α表達(dá)，并且在腦缺血后7 d，表達(dá)仍高于正常狀態(tài)。這與既往研究結(jié)果一致[8-9]。

中醫(yī)古籍《醫(yī)林纂要》指出，“牛肉味甘，專補(bǔ)脾土”?！侗静菔斑z》也指出，牛肉“消水腫，除濕氣，補(bǔ)虛，令人強(qiáng)筋骨、壯健”。牛肉湯入藥始見于朱丹溪《格致余論·倒倉論》中“倒倉法”，所用之藥，只黃牛肉一味，丹溪云可“治癱、癆、蠱、癩諸證”，且具有寓攻于補(bǔ)，攻邪而不傷正，扶正而不助邪的特點(diǎn)?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究也表明，牛肉富含蛋白質(zhì)、B族維生素及礦物質(zhì)(鉀、鋅、鎂、鐵等)[10]，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)蛋白質(zhì)的新陳代謝和合成、增強(qiáng)肌力的作用。牛肉中蛋白質(zhì)含量尤其豐富，由人體必需的8種氨基酸組成，且比例均衡，熬制成湯后，很多水溶性的氨基酸溶解到湯中，湯刺激胃酸分泌，更利于營養(yǎng)吸收。腦卒中患者由于能量大量消耗，容易出現(xiàn)負(fù)氮平衡，低蛋白血癥，造成營養(yǎng)不良[11]，而營養(yǎng)不良是感染等并發(fā)癥的重要基礎(chǔ)，也是影響腦卒中預(yù)后的重要原因之一，牛肉及牛肉湯中富含各種優(yōu)質(zhì)蛋白，對腦卒中后患者營養(yǎng)的補(bǔ)充有益。2012年賓州大學(xué)的一項(xiàng)研究[12]發(fā)現(xiàn)，每天食用4.0～5.4盎司瘦牛肉，與開始實(shí)驗(yàn)時(shí)比較，其低密度脂蛋白(LDL)降低了10%，而LDL升高是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要脂質(zhì)危險(xiǎn)因素，是腦卒中發(fā)生的關(guān)鍵所在。

此外，本課題組前期采用簡單工藝制作牛肉水煮液，經(jīng)S-433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測，其中肌肽含量豐富。肌肽是一種含組氨酸的二肽，一般存在于脊椎動(dòng)物骨骼肌中，以往研究表明[13]，肌肽具有抗氧化、抗凋亡、抗炎性反應(yīng)、清除自由基、抗糖基化、調(diào)節(jié)免疫等作用，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，減輕腦缺血損傷。本課題組前期研究顯示肌肽可調(diào)節(jié)外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)，改善外周免疫抑制狀態(tài)[3]，進(jìn)一步證實(shí)了肌肽對缺血性腦卒中的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過建立永久性大腦中動(dòng)脈缺血模型，觀察富含肌肽的牛肉水煮液對腦缺血大鼠外周血炎性因子IL-6、TNF-α水平的影響，旨在探討牛肉水煮液是否具有抗炎作用。

本研究結(jié)果顯示：假手術(shù)組血清炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α基礎(chǔ)水平較低，造模后7 d，模型組IL-6、TNF-α水平顯著增高，提示炎性因子IL-6、TNF-α參與腦缺血損傷過程；予不同劑量牛肉水煮液處理后，升高的IL-6、TNF-α水平呈現(xiàn)不同程度下降趨勢，提示牛肉水煮液可降低腦缺血后IL-6、TNF-α水平，抑制炎性反應(yīng)，從而減輕腦缺血時(shí)炎性浸潤對腦組織的損害。而既往研究顯示[14]肌肽能抑制缺血再灌注損傷的炎性因子，如IL-6、TNF-α、核因子κB1等的表達(dá)。因此推測牛肉水煮液中的豐富的肌肽成分在腦缺血后抗炎作用中發(fā)揮了重要作用，但牛肉水煮液中其他成分，如脂肪、維生素、礦物質(zhì)等是否也起到一定作用，還有待進(jìn)一步探討。本研究結(jié)果還顯示，與模型組相比，低、中劑量牛肉水煮液組IL-6、TNF-α水平雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量牛肉水煮液組IL-6、TNF-α水平下降顯著，并且高劑量組IL-6水平明顯低于低劑量組，提示高劑量牛肉水煮液對IL-6、TNF-α的調(diào)節(jié)作用最理想。

另外，本實(shí)驗(yàn)在造模后7 d觀察各組大鼠腦梗死體積發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中、高劑量組可明顯減小腦梗死體積，表明中、高劑量牛肉水煮液可減輕局灶性腦缺血大鼠的腦損傷。此結(jié)果與不同濃度牛肉水煮液對血清IL-6、TNF-α水平影響的變化趨勢相一致，推測其腦保護(hù)作用可能是通過減少腦缺血后炎性因子水平實(shí)現(xiàn)。這與既往的研究結(jié)果相一致[15]。但其腦梗死范圍和血清IL-6、TNF-α水平是否有相關(guān)性，尚需要進(jìn)一步探討。

造模后2 h，各組大鼠神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；造模后7 d，低、中、高劑量牛肉水煮液組神經(jīng)功能缺損評分與模型組相比，雖有隨劑量下降的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能有3方面：(1)本實(shí)驗(yàn)樣本量較?。?2)本實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)功能評分方法采用Longa等的五級四分法，且排除了腦損傷過輕(0分)和過重(4分)的大鼠，導(dǎo)致腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評分的差異性較?。?3)牛肉水煮液屬于食物，其功能上還不足以在短時(shí)間內(nèi)對神經(jīng)癥狀起到明顯的改善作用。

綜上所述，牛肉水煮液可以減小局灶性腦缺血后的腦梗死體積，降低腦缺血大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α的水平，減輕腦缺血后的炎性病理過程，具有神經(jīng)保護(hù)作用，這可能與其富含肌肽有關(guān)。牛肉水煮液取材方便，制作工藝簡單，作為一種簡單食療方可以納入臨床腦卒中患者的飲食方案，輔助腦卒中患者的治療。但是牛肉水煮液發(fā)揮抗炎作用所需時(shí)間以及持續(xù)時(shí)間還需進(jìn)一步探討。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Effect of beef decoction on levels of serum interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in rats of cerebral infarction

MAQian,ZHUJie,WANGXin,WANGAihong*.

*Institute of Nursing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing Jiangsu 210023, China

WANGAihong,Email:wah710630@163.com

ObjectiveToinvestigatetheneuroprotectiveeffectofbeefdecoction(BD)ontheserumlevelsofinterleukin-6 (IL-6)andtumornecrosisfactor-α(TNF-α)inmiddlecerebralarteryocclusionmodel(MCAO)rats.MethodsSixtySDratswererandomlydividedintofivegroups：sham-operatedgroup,modelgroup,lowdosageBD-treatedgroup[200mg/(kg·d)],middledosageBD-treatedgroup[400mg/(kg·d)]andhighdosageBD-treatedgroup[600mg/(kg·d)],therewere12ratsineachgroup.IntraluminalthreadmethodswereappliedtoestablishtheMCAOinthemodelgroupandthethreeBDtreatedgroups.TheneurologicalfunctionwasscoredwithLonga5-pointscaleat2hand7daysaftermodeling,thecerebralinfractvolumewasrevealedby2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)stain,andtheserumlevelsofIL-6andTNF-αweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)methods.ResultsBoth2hand7daysafterMCAO,comparedwiththemodelgroup,theneurologicalfunctionscoresoftheBD-treatedgroupswerenotsignificantlydifferent(P>0.05).TheinfarctionvolumesoftheBD-treatedgroupsweresmallerthanthoseofthemodelgroup,andstatisticallysignificantlyreducedinthehighandmiddledosagegroups(P<0.01).ThelevelsofIL-6andTNF-αinthemodelgroupweremuchhigherthanthoseinthesham-operatedgroup(P<0.01),whilethelevelsofIL-6andTNF-αinthehighdosageBDgroupwerelowerthanthoseinthemodelgroup(P<0.01，P<0.05).ConclusionsHighdosageBDiseffectivetoreduceinfractvolumeandrestrainIL-6andTNF-αexpression,thismaybeitsprotectivemechanismofBDoncerebralischemia.

beefdecoction；localcerebralischemia；interleukin-6；tumornecrosisfactor-α

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.015

江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目資助、江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目資助項(xiàng)目(編號：YSHL0201-26)

210023 南京中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院

王愛紅，Email：wah710630@163.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0062-05

2014-08-20)