郝溥辰 張星虎

糖皮質(zhì)激素受體α對預測多發(fā)性硬化患者激素反應性的價值

郝溥辰 張星虎

目的 探討糖皮質(zhì)激素受體α(glucocorticoid receptorα，GRα)對預測多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)患者激素反應性的價值。方法 使用ELISA法檢測19例MS患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中平均GRα濃度；于治療前、治療后28 d對患者行擴展殘疾狀況評分量表(expanded disability status scale, EDSS)評分；測定7例患者的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration of a substance,IC50)并與19名健康對照進行比較。結(jié)果 治療有效組MS患者平均GRα濃度顯著高于治療無效組〔(131.94±76.28)ng/106細胞vs. (56.98±25.28)ng/106細胞，P<0.05〕。MS患者治療前平均GRα濃度與IC50間呈負相關(guān)(r=-0.826，P<0.05)。結(jié)論 GRα對MS患者的激素反應性存在一定預測價值，可能成為預測MS患者激素反應性的新指標。

多發(fā)性硬化；糖皮質(zhì)激素受體；激素反應性；IC50；EDSS評分

多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫病。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)是MS急性期的首選治療藥物[1]。糖皮質(zhì)激素受體α(glucocorticoidreceptorα,GRα)通過調(diào)控GC使其發(fā)揮生理、藥理功能。既往研究結(jié)果提示[2]GRα與MS患者的激素反應性之間存在密切聯(lián)系。本研究通過ELISA法檢測MS患者平均GRα濃度，評價其與神經(jīng)功能評分和半抑制濃度(IC50)的關(guān)系，旨在建立一個預測MS患者激素反應性的新指標。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2012-01-2014-01首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科復發(fā)-緩解型MS住院患者19例，其中男8例，女11例。入組標準：(1)年齡18～60歲；(2)符合McDonald(2010年)診斷標準中確診MS；(3)末次復發(fā)在1個月之內(nèi)；(4)發(fā)作期擴展殘疾狀況評分量表(expandeddisabilitystatusscale,EDSS)評分較緩解期至少增加1分；(5)同意入組并簽署知情同意書。排除標準：(1)入組前3個月內(nèi)正在使用免疫抑制劑(硫唑嘌呤或環(huán)孢素等)或干擾素；(2)入組前1個月正在使用激素；(3)合并全身感染性疾?。?4)合并嚴重心、肝、腎疾?。?5)合并系統(tǒng)性自身免疫性疾病(如類風濕關(guān)節(jié)炎等)。對照組為年齡18～60歲的健康成年人，共19例，其中男10例，女9例。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞(PBMC)GRα濃度測定：所有患者(于使用GC前、使用GC后7d)及對照者均在早晨7：00～9：00空腹抽取外周靜脈血2mL，置于EDTA抗凝管。將2mL血液與2mLRPMI1640培養(yǎng)液均勻混合，用加樣槍將混合液緩慢加于3mL淋巴細胞分離液之上，以400 g離心40min，吸取其中單個核細胞層，計數(shù)。用PBS將PBMC水平調(diào)至1×106細胞/mL。取1mLPBMC懸液置于Ep管內(nèi)，使用超聲震碎法裂解細胞。將裂解后的PBMC懸液于300 g離心10min，吸取上清液，使用ELISA試劑盒(武漢伊艾博公司)檢測GRα濃度(ng/mL)，結(jié)合PBMC水平為1×106細胞/mL，可將平均GRα濃度單位換算為ng/106細胞。

1.2.2IC50檢測：抽取患者(未用激素治療前)和正常人外周靜脈血3mL，置于EDTA抗凝管。于無菌操作臺中，將全血加入24孔板中，每孔加入400μL，共6孔。并于6孔中再分別加入以下物質(zhì)：第1孔加入100μLRPMI1640培養(yǎng)液；第2孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μLRPMI1640培養(yǎng)液；第3孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-5mol/L)；第4孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-6mol/L)；第5孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-7mol/L)；第6孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-8mol/L)。置于無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將樣本轉(zhuǎn)移至Ep管中，以600 g離心10min，吸取上清液，使用ELISA試劑盒(BenderMedSystems)檢測白細胞介素-6(IL-6)濃度(ng/mL)。根據(jù)IL-6濃度與其對應的地塞米松終濃度，通過專門軟件計算使IL-6濃度下降50%時的地塞米松濃度，即IC50。

1.2.3EDSS評分：在MS患者治療前及治療后28d進行EDSS評分，將EDSS評分下降至少1分定義為治療有效，以此標準將MS患者分為治療有效組和治療無效組。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗；平均GRα濃度與EDSS評分和IC50的關(guān)系采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組平均GRα濃度比較MS患者治療前平均GRα濃度低于對照組〔(96.42±68.36)ng/106細胞vs.(506.58±495.58)ng/106細胞，P<0.05〕；MS患者治療后7d平均GRα濃度〔(539.06±620.78)ng/106細胞〕較治療前增高(P=0.003)。MS患者IC50為(1.73×10-8±2.49×10-8)mol/L，對照組IC50為(5.37×10-10±4.48×10-10)mol/L，MS患者IC50高于對照組，但兩者間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.126)。

2.2MS患者治療前后平均GRα濃度比較 19例患者中治療有效組10例，治療無效組9例。治療有效組治療前、后平均GRα濃度和平均GRα濃度變化值均高于治療無效組(均P<0.05，表1)。

2.3 平均GRα濃度與EDSS評分和IC50的關(guān)系 19例MS患者治療前平均GRα濃度與EDSS評分變化(治療前后EDSS評分之差)無明顯相關(guān)性(r=0.419，P=0.074)；7例進行IC50測定的MS患者，治療前平均GRα濃度與IC50呈負相關(guān)(r=-0.826，P=0.022)。

3 討論

GRα主要存在于細胞質(zhì)中。當GC與GRα結(jié)合后，形成GR-GC同源二聚體復合物，誘導GR-GC二聚體進入細胞核，最終激活或抑制靶基因的表達，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)合成。GRα表達量的下降是激素反應性降低的重要原因之一[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)MS患者治療前PBMC中平均GRα濃度明顯低于健康對照組，這與Matysiak等研究結(jié)果一致[4]，表明反復應用GC后可導致GRα表達量下降，進而可能造成激素反應性下降。其可能的機制包括：(1)反復應用GC導致T細胞凋亡，造成T細胞平衡紊亂和功能下降，進而使GRα表達下降[5]；(2)GRα的信號傳導通路中的多種輔助蛋白可能在GC作用下出現(xiàn)表達異常，造成GRα蛋白轉(zhuǎn)錄減少[6]；(3)GRα的亞型GRβ表達上升，通過直接或間接與GRα結(jié)合，減少GRα表達[7]；(4)MS患者存在數(shù)個與健康人明顯不同的基因，這些基因本身和其轉(zhuǎn)錄而來的蛋白可能造成GRα表達量的改變[8]。治療后GRα表達量增加考慮為機體正反饋所致。

表 1 不同療效組間平均GRα濃度比較細胞)

注：與無效組比較，*P<0.05

本研究結(jié)果顯示，治療有效組治療前、治療后平均GRα濃度和平均GRα濃度變化顯著高于治療無效組，這與既往研究結(jié)果一致[10]，也與GRα的作用機制相符合，表明GRα表達量越高，患者臨床癥狀改善越明顯，對激素反應性越好，提示GRα可以反映MS患者激素療效。

治療前平均GRα濃度與治療前后EDSS評分變化之間無明顯線性關(guān)系，這與既往研究結(jié)果一致[10]，提示兩者間可能不是簡單的線性關(guān)系，也可能與EDSS評分不能充分反映患者癥狀改變有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)7例MS患者與健康對照組IC50間比較差異無統(tǒng)計學意義。這與DeRijk 等[11]研究結(jié)果不一致，考慮可能為本研究樣本較少所致。

7例MS患者的治療前平均GRα濃度與IC50呈負相關(guān)，提示治療前平均GRα濃度越高，其IC50越小，激素體外敏感性越高，對激素的反應性越好。本研究結(jié)果提示平均GRα濃度在與IC50可能存在一致性，或許可以成為預測MS患者激素療效的新指標，但由于樣本數(shù)較少，故確切結(jié)論有待進一步驗證。

綜上所述，GRα對MS患者的激素反應性存在一定預測價值，可能成為預測MS患者激素反應性的新指標。

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(本文編輯：時秋寬)

The value of glucocorticoid receptorαin predicting steroid response in patients with multiple sclerosis

HAOPuchen,ZHANGXinghu*.

*Department of Neurology, Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

ZHANGXinghu,Email:xhzhtiantan@hotmail.com

ObjectiveTostudythevalueofglucocorticoidreceptor(GRα)inpredictingsteroidresponseinpatientswithmultiplesclerosis(MS).MethodsGRαinperipheralbloodmononuclearcell(PBMC)of19MSpatientswasdetectedbyELISA.Expandeddisabilitystatusscale(EDSS)scorewasevaluatedbeforeand28daysaftertreatment.IC50of7MSpatientsandcontrolgroupweredetectedbeforetreatment.ResultsTheaverageconcentrationofGRαinMSpatientswhosetreatmentwaseffectivewashigherthantherestofMSpatients[(131.94±76.28)ng/106cellsvs. (56.98±25.28)ng/106cells，P<0.05].TheaverageconcentrationofGRαandIC50hadanegativecorrelation,thePearsoncorrelationcoefficientwas-0.826, P=0.022.ConclusionsDetectingtheaverageconcentrationofGRαmaybeanewmethodtopredictthesteroidresponseofMSpatients.

multiplesclerosis；glucocorticoidreceptor；steroidresponse；IC50；EDSSscore

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.003

教育部神經(jīng)病學重點學科、國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2007AA02Z453)

100050 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

張星虎，Email：xhzhtiantan@hotmail.com

R744.5+2；R544.1

A

1006-2963 (2015)01-0009-03

2014-05-19)