孫超 袁媛 鄭鵬飛 高星 趙元琳 李樂 常婷 李柱一

小鼠AChR(m97-116)肽段-CD205融合單鏈抗體的表達(dá)及活性檢測

孫超 袁媛 鄭鵬飛 高星 趙元琳 李樂 常婷 李柱一

目的 構(gòu)建小鼠AChR(m97-116)肽段-CD205融合單鏈抗體原核表達(dá)載體，表達(dá)融合單鏈抗體(m97-116-scFv205)，檢測其對未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)的親和力，為通過iDC誘導(dǎo)AChR特異性免疫耐受提供實驗基礎(chǔ)。方法 分離培養(yǎng)小鼠原代骨髓祖細(xì)胞，經(jīng)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)10 ng/mL和白細(xì)胞介素4(IL-4)10 ng /mL刺激培養(yǎng)，經(jīng)脂多糖(LPS)1 ng/mL誘導(dǎo)24 h后，高倍顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞表面相關(guān)分子表達(dá)，對iDC表型進(jìn)行鑒定；構(gòu)建原核表達(dá)載體m97-116-scFv205- pET22b(+)，0.1 mmol/mL異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)18℃誘導(dǎo)表達(dá)18 h，鎳(Ni)柱純化，SDS-PAGE和Western blot檢測融合單鏈抗體m97-116-scFv205表達(dá)及純化；FCM檢測其與iDC的親和力。結(jié)果 形態(tài)學(xué)觀察提示培養(yǎng)細(xì)胞為DC，F(xiàn)CM結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞符合iDC表型；SDS-PAGE和Western blot在上清中檢測到m97-116-scFv205可溶性表達(dá)；親和力檢測顯示m97-116-scFv205與iDC具有較高親和力。結(jié)論 成功構(gòu)建并表達(dá)m97-116-scFv205融合單鏈抗體，該抗體與iDC具有較高的親和力，為下一步靶向iDC誘導(dǎo)AChR特異性免疫耐受治療重癥肌無力奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

重癥肌無力；未成熟樹突狀細(xì)胞；融合單鏈抗體；CD205

樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)是體內(nèi)最強的抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presentingcells，APC)，其最大的特點就是表型和功能的靈活性。未成熟DC(immaturedendriticcells，iDC)具有很強的抗原捕獲和處理能力，因其表面低表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激信號，不能提供T細(xì)胞活化的第二信號，從而導(dǎo)致特異性T細(xì)胞無反應(yīng)性、凋亡或者產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)，誘導(dǎo)免疫耐受。目前，基于iDC誘導(dǎo)免疫耐受已用于各類自身免疫性疾病的預(yù)防和治療[1]。重癥肌無力(myastheniagravis，MG)是典型的主要由乙酰膽堿受體抗體(AChRAb)介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補體參與的神經(jīng)肌接頭(neuromuscularjunction，NMJ)處自身免疫性疾病[2]，AChR自我耐受的打破是MG發(fā)病的關(guān)鍵所在。位于NMJ突觸后膜的AChR是其致病的重要自身抗原，大多數(shù)AChRAb都直接作用于AChRα1亞基胞外域而發(fā)揮作用。研究表明AChRα1亞基胞外域97-116肽段(97-116)共存于大鼠、小鼠和人，且較電鰻97-116更好地誘導(dǎo)實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)[3]。本研究擬將m97-116與iDC表面特異性受體-CD205單鏈抗體在基因水平上耦聯(lián)，并表達(dá)融合單鏈抗體(m97-116-scFv205)，觀察其與iDC的親和力，以期通過iDC誘導(dǎo)AChR特異性免疫耐受，從而為治療MG奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料C57雌性小鼠2只，鼠齡6周，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。RPIM-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、小鼠紅細(xì)胞裂解液購自杭州四季青。PE-CD80、PE-CD86、PE-CD40、FITC-CD11C、FITC-CD11B、PE-MHCⅡ等流式抗體購自美國BD公司。APCanti-mouseCD205購自美國BioLegend公司。GM-CSF、IL-4為美國Peprotech公司。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司。FITC-antihisTag為英國ABDsecrotec公司，HisTagHRP購自康為世紀(jì)公司。NiFASTFLOW購自美國GE公司，流式細(xì)胞(FCM)儀由美國BD公司提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源DC的培養(yǎng)：小鼠脫頸處死，70%酒精浸泡5min，無菌分離股骨和脛骨，RPMI-1640沖洗髓腔，以1500r/min(離心半徑8cm)離心5min，3mL紅細(xì)胞裂解液重懸，裂解3min。再以1500r/min(離心半徑8cm) 離心5min。1640重懸，細(xì)胞計數(shù)，取2×106/mL鋪6孔板同時添加GM-CSF(10ng/mL)和IL-4(10ng/mL)。隔天半量換液及補充GM-CSF，IL-4各至10ng/mL。待培養(yǎng)第6天細(xì)胞分為兩組，一組加入LPS至1ng/mL(LPS刺激組)，另一組不加(非LPS刺激組)。

1.2.2DC鑒定：兩組細(xì)胞培養(yǎng)到第7天，輕輕搖晃六孔板，取懸浮的細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整至1×106/mL，PBS洗兩遍，各加入1μLFITC-CD11C，F(xiàn)ITC-CD11B；2μLPE-CD80，PE-CD86，PE-CD40，PE-MHCⅡ，4℃，避光孵育 30min。同上PBS再洗一遍，最后用200μLPBS及2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定液20μL重懸，F(xiàn)CM分析。在骨髓前體細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，每天在高倍顯微鏡下動態(tài)地觀察細(xì)胞分化生長變化情況。第7天細(xì)胞爬片，過夜后用2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定，在掃描電鏡下觀察分析單個細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 融合單鏈抗體的構(gòu)建和表達(dá)：根據(jù)NCBI的序列CD205VL(GenBank：AEP95113.1) 和CD205VH(GenBank：AEP95114.1)在pET22b上設(shè)計融合單鏈抗體m97-116-scFv205表達(dá)載體，由Generay公司合成，見圖1。酶切鑒定m97-116-scFv205表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑單克隆至12mL2×YT培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)。第2天以1∶100加入1L的2×YT培養(yǎng)液，37℃，以200r/min(離心半徑為8cm)搖菌，待其600nm處吸光度〔D(λ)〕約為0.6時，加入終濃度為0.1mmol/LIPTG和0.4mmol/L蔗糖，18℃，200r/min(離心半徑為8cm)，18h搖菌。提取周質(zhì)蛋白[4]：4℃，5000r/min(離心半徑為10cm)，離心10min收集大腸桿菌，用200mmol/LTris，1mmol/LEDTApH7.0重懸沉淀，冰上靜止45min，間斷振蕩。然后12 000 r/min (離心半徑為10 cm)，4℃離心30 min，收集上清，用50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl pH 7.0透析，2 mL Ni離子裝柱，以3倍柱體積50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl pH 7.0平衡Ni柱，透析后的上清過柱，再以20倍柱體積50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl 20 mmol/L咪唑 pH 7.0及50 mmol/L Tris，1 mol/L，NaCl 20 mmol/L咪唑pH 7.0過Ni柱，最后以50 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl 500 mmol/L咪唑 pH 7.0 洗脫。洗脫后的液體用PBS透析，取一部分加入2×Loading buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE和 Western blot檢測。

pelB：信號肽；VL：輕鏈可變區(qū)；VH：重鏈可變區(qū)；CL-p：部分輕鏈可變區(qū)及15個氨基酸linker；G：甘氨酸；S：色氨酸；His6：6個組氨酸his標(biāo)簽

圖1 m97-116-scFv205- pET22b(+)原核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)

1.2.4 融合單鏈抗體親和力檢測：取培養(yǎng)7 d的iDC，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)至2×106，PBS洗2遍后用200 μL PBS重懸，分別加入融合單鏈抗體m97-116-scFv205(5 μL/mL)和APC anti-mouse CD205 10 μL，4℃孵育30 min，PBS洗2遍，200 μL重懸，融合單鏈抗體再加入FITC標(biāo)記的抗his標(biāo)簽的抗體(FITC-anti his Tag)10 μL，4℃孵育 30 min，PBS洗2遍，最后200 μL重懸，上機進(jìn)行流式檢測。

2 結(jié)果

2.1 DC形態(tài)學(xué)觀察 見圖2、3。在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞，從第2天開始出現(xiàn)集團(tuán)的細(xì)胞簇，懸浮的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞體積大且形態(tài)不規(guī)則, 出現(xiàn)許多短的毛刺狀突起；在掃描電鏡下觀察，培養(yǎng)第7天的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙層疊狀皺褶，呈明顯鋸齒樣突起，短而多似樹杈狀。

圖2 顯微鏡下觀察小鼠骨髓DC細(xì)胞培養(yǎng)第2天時的形態(tài)學(xué)改變(比例尺50 μm)

圖3 掃描電子顯微鏡下觀察小鼠骨髓DC細(xì)胞培養(yǎng)第7天單個細(xì)胞形態(tài)(比例尺30 μm)

2.2 DC表型分析 FCM結(jié)果顯示經(jīng)GM-CSF和IL-4刺激后CD11C+DC可以達(dá)到80%左右，經(jīng)LPS刺激組的DC表面活性標(biāo)志分子表達(dá)較非LPS刺激組明顯增多，提示非LPS刺激組為iDC(表1)。

表 1 FCM檢測小鼠骨髓DC表面分子表達(dá) (%)

注：FCM：流式細(xì)胞術(shù)；LPS：脂多糖

2.3 融合單鏈抗體載體構(gòu)建及蛋白表達(dá) m97-116-scFv205- pET22b(+)載體經(jīng)NcoI和NotI酶切，780 bp處有目的條帶，提示原核表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖4)。0.1mmol/L IPTG，18℃，18 h誘導(dǎo)融合單鏈抗體m97-116-scFv205表達(dá)，蔗糖滲透抽提法裂解細(xì)胞周質(zhì)，Ni柱純化融合單鏈抗體，SDS-PAGE顯示純化富集后上清中有符合目的蛋白分子量大小的條帶(圖5)，經(jīng)ant -His Tag Western blot檢測證實為目的蛋白(圖6)。

M：Marker 1：m97-116-scFv205 /NcoI+NotI

圖4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

1：菌液；2：上樣液；3：洗滌液；4：洗脫液；M：Marker

圖5 SDS-PAGE分析融合單鏈抗體的表達(dá)

1：菌液；2：上樣液；3：洗滌液；4：洗脫液

圖6 Western blot分析融合單鏈抗體的表達(dá)

2.4 融合單鏈抗體親和力檢測 APC anti-mouse CD205，m97-116-scFv205分別同iDC共孵育后，用FITC-anti his Tag 檢測融合單鏈抗體上的his標(biāo)簽，從而間接證實融合單鏈抗體對iDC的親和力。APC anti-mouse CD205為CD205的完全抗體，流式檢測顯示完全抗體親和力為49.9%，m97-116-scFv205親和力為41.1%(圖7)，提示融合單鏈抗體與iDC具有較高親和力。

圖7 FCM檢測anti-mouse CD205及m97-116-scFv205與iDC的親和力

3 討論

盡管皮質(zhì)類固醇激素、靜脈注射丙球(IVIg)及免疫抑制劑的應(yīng)用可顯著緩解MG的癥狀，然而，由于該類藥物是非特異性免疫抑制劑，不可避免地會出現(xiàn)一些副作用，如機會性感染及腫瘤發(fā)生。因此，MG的治療仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。AChR 自我耐受的打破是MG發(fā)病的關(guān)鍵，調(diào)控AChR特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，重建AChR自我耐受，有可能為 MG的治療提供新思路。

DC是迄今發(fā)現(xiàn)功能最強的專職抗原遞呈細(xì)胞，近年來的研究表明DC在誘導(dǎo)和維持機體免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，尤其是iDC，因其低表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激信號，不能提供T細(xì)胞活化的第二信號，從而導(dǎo)致特異性T細(xì)胞無反應(yīng)性、凋亡或者產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細(xì)胞，在移植免疫耐受誘導(dǎo)、自身免疫性疾病治療方面，展現(xiàn)出其獨特的應(yīng)用價值[5-6]。本研究結(jié)果顯示未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞低表達(dá)MHCⅡ類分子、CD40、CD86和CD80，證實其未成熟表型。

單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過15～20個氨基酸的短肽(linker)連接而成。scFv能較好地保留其對抗原的親和活性，并具有分子量小、穿透力強和抗原性弱等特點，但是具有親和力低等缺點。本實驗中通過SDS-PAGE和Western blot證實融合單鏈抗體m97-116-scFv205表達(dá)及純化成功。FCM顯示相比完整抗體CD205，融合單鏈抗體m97-116-scFv205與iDC仍具有很高親和力。

通過iDC誘導(dǎo)免疫耐受對EAMG的預(yù)防和治療具有重要價值。實驗證明體外負(fù)載AChR抗原或其免疫優(yōu)勢肽段α146-162的髓系iDC，可誘導(dǎo)EAMG免疫耐受，阻止EAMG的發(fā)生；并顯著降低EAMG小鼠的疾病評分、抑制AChR特異性淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-6的分泌，對EAMG顯示出良好的治療作用。實驗證明體外將iDC和AChR抗原共孵育后皮下注射后，可以抑制AChR特異性淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-6的分泌，并顯著降低EAMG大鼠的疾病評分，阻止EAMG的發(fā)生[7]。研究者還通過一些細(xì)胞因子阻止DC的成熟，用于EAMG的治療。Yarilin等[8]取新鮮健康的Lewis鼠的脾臟DC并與TGF-β1體外孵育48 h，于EAMG的第5天 皮下注射, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)EAMG的臨床癥狀明顯減輕，分泌抗乙酰膽堿抗體的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。Duan等[9]分離EAMG Lewis 鼠的脾臟DC，并將DC與IL-10共孵育72 h，皮下注射給EAMG造模5 d的大鼠，可減輕EAMG的臨床癥狀，降低抗乙酰膽堿抗體的細(xì)胞數(shù)量及協(xié)同刺激分子CD80和CD86的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明iDC在治療重癥肌無力等自體免疫性疾病有巨大的研究前景。然而，這些實驗均涉及到DC的分離和培養(yǎng)，不僅耗時費力，而且代價昂貴；DC一旦進(jìn)入體內(nèi)也可能會受到各種細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞等體內(nèi)環(huán)境的影響而干擾功能，在一定程度上限制了繼續(xù)的研究應(yīng)用和臨床開發(fā)。因此，理想的治療方法應(yīng)該是靶向體內(nèi)的iDC，從而引起其免疫耐受的作用。

本實驗利用DC特異性受體CD205，將CD205 scFv與MG自身抗原(97-116)多肽融合表達(dá)，期望iDC將自身抗原遞呈給AChR特異性T細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受，該融合單鏈抗體的制備為重癥肌無力特異性治療奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

[1]Lanzavecchia A, Sallusto F. Ralph M. Steinman 1943-2011[J]. Cell, 2011,147(6):1216-1217.

[2]Avidan N, Le Panse R, Berrih-Aknin S, Miller A. Genetic basis of myasthenia gravis - A comprehensive review[J]. J Autoimmun, 2014, 52:146-153.

[3]Baggi F, Annoni A, Ubiali F, et al. Breakdown of tolerance to a self-peptide of acetylcholine receptor alpha-subunit induces experimental myasthenia gravis in rats[J]. J Immunol, 2004,172(4):2697-2703.

[4]Wang WW, Das D, Suresh MR. A versatile bifunctional dendritic cell targeting vaccine vector[J]. Mol Pharm, 2009,6(1):158-172.

[5]Bonifaz L, Bonnyay D, Mahnke K, et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+T cell tolerance[J]. J Exp Med, 2002,196(12):1627-1638.

[6]Shrimpton RE, Butler M, Morel AS, et al. CD205 (DEC-205): a recognition receptor for apoptotic and necrotic self[J]. Mol Immunol, 2009,46(6):1229-1239.

[7]Xiao BG, Duan RS, Link H, et al. Induction of peripheral tolerance to experimental autoimmune myasthenia gravis by acetylcholine receptor-pulsed dendritic cells[J]. Cell Immunol, 2003,223(1):63-69.

[8]Yarilin D, Duan R, Huang YM, et al. Dendritic cells exposed in vitro to TGF-beta1 ameliorate experimental autoimmune myasthenia gravis[J]. Clin Exp Immunol, 2002,127(2):214-219.

[9]Duan RS, Adikari SB, Huang YM, et al. Protective potential of experimental autoimmune myasthenia gravis in Lewis rats by IL-10-modified dendritic cells[J]. Neurobiol Dis, 2004,16(2):461-467.

(本文編輯：時秋寬)

Determining the expression and affinity of mice acetylcholine receptor peptide 97-116 and CD205 fusion single chain antibody fragment

SUNChao,YUANYuan,ZHENPengfei,GAOXing,ZHAOYuanlin,LILe,CHANGTing*,LIZhuyi*.

*Department of Neurology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medicine University, Xi’ an Shaanxi 710038, China

CHANGTing，Email：changting1981@163.com;LIZhuyi，Email：lizhuyi@fmmu.edu.cn

ObjectiveToconstructprokaryoticexpressionvectorofmiceacetylcholinereceptorpeptide(m97-116)andCD205fusionsinglechainantibodyfragment(m97-116-scFv205),andtoanalyzetheaffinityofthefusionproteintoimmaturedendriticcell(iDC).MethodsBonemarrowcellswereharvestedfromthefemurandtibiaeofC57BL/6miceandwashedinRPMI1640followinglysisofredbloodcell.Remainingcellswereculturedincompletemedium(RPMI1640supplementedwith5%FCS,)with10ng/mLGM-CSFand10ng/mLIL-4.ThecellswerestimulatedwithLPS(1ng/mL)orwithoutLPSfor24hours.Themorphologyofthecellswasobservedbythemicroscopeandscanningelectronmicroscopy.Flowcytometry(FCM)wasusedtoanalyzetheexpressionoflineageandspecificmarker.Thefragmentm97-116-scFv205wasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET22b(+)andtheproteinexpressionwasinducedby0.1mmol/LIPTGat18℃for18h,andthenpurifiedbyNicolumnviaHisTag.ProteinproductionandpurificationstepswereanalyzedbySDS-PAGEandWesternblot.Theaffinityofm97-116-scFv205withiDCwastestedbyFCMviaFITC-antiHisTag.ResultsThemorphologicalandphenotypicalanalysisshowedthatculturedcellsweretypicaliDC.Theexpressionofm97-116-scFv205wasdemonstratedbySDS-PAGEandWesternblot.Them97-116-scFv205showedhighaffinitywithiDC.ConclusionsTheprokaryoticexpressionvectorofm97-116-scFv205wassuccessfullyconstructedandthem97-116-scFv205canspecificallybindtoiDC,providingbasisforfurtherstudiesinducingAChRspecificimmunologictolerancethroughtargetediDC.

myastheniagravis;immaturedendriticcell;fusionsinglechainantibodyfragment;CD205

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(81102217)

710038 陜西省西安市第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(孫超、常婷、李柱一)；710032 第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室(袁媛、高星、趙元琳、李樂)；710032 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心臟內(nèi)科(鄭鵬飛)

常婷，Email：changting1981@163.com；李柱一，Email:lizhuyi@fmmu.edu.cn

R746.1

A

1006-2963 (2015)01-0004-05

2014-09-17)