李新明，王 韋，戴建輝，高利斌，袁明龍，孫蔚青，曾曉麗，黃相中,3

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500;2.云南民族大學 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050)

麻櫟樹皮的化學成分研究

李新明1,2，王 韋1,2，戴建輝1,2，高利斌1,2，袁明龍1,2，孫蔚青1,2，曾曉麗1,2，黃相中1,2,3

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500;2.云南民族大學 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050)

采用硅膠層析色譜、凝膠層色譜及高效液相色譜等多種常規(guī)分離方法對麻櫟樹皮乙醇提取物乙酸乙酯萃取部分進行化學成分研究，從中分離得到8個單體化合物，根據(jù)波譜數(shù)據(jù)和文獻鑒定結(jié)構(gòu)分別為：(+)-5′-methoxy-isolariciresinol-9′-O-α-L-rhamnopyranoside(1),isolariciresinol rhamnopyranoside(2),(+)-lyoniresinol 3α-O-α-L-rhamnopyranoside(3),槲皮素(4),5,7,3′,4′-四羥基黃酮醇-3-O-葡萄糖苷(5),β-香樹脂醇(6),β-谷甾醇 (7),胡蘿卜苷(8).其中,化合物1～6和8為首次從該種植物中分離得到.

麻櫟;木脂素;抗氧化

麻櫟(QuercusacutissimaCarruth)為殼斗科櫟屬落葉喬木，在我國分布廣泛，栽培歷史悠久，是傳統(tǒng)的優(yōu)良能源樹種[1-3].麻櫟在我國常被作為中藥材使用，其果實，樹葉，樹皮具有解熱、收斂、止血等功效[4-5].袁久志等[4]對麻櫟葉的化學成分進行了研究，從中獲得了表木栓醇、木栓醇等5個化合物，尚未見到有關(guān)麻櫟樹皮化學成分的研究的文獻報道，本課題組研究發(fā)現(xiàn)麻櫟樹皮的乙醇提取有很好的抗氧化活性，本論文對麻櫟樹皮乙醇提取物進行活性跟蹤分離，從麻櫟樹皮乙醇提取物乙酸乙酯萃取部分分離并鑒定得到8個化合物,并采用DPPH法對化合物1～3進抗氧化活性評估，研究結(jié)果顯示化合物1～3有較好的抗氧化活性，其EC50值在41.8～48.9 μM之間.

1 材料與儀器

麻櫟樣品于2010年9月采自云南騰沖，經(jīng)楊青松副教授鑒定為QuercusacutissimaCarruth，標本存于云南民族大學化學與生物技術(shù)學院標本室.

紫外分光光度計(Aglient 8453);Bruker AV400核磁共振儀，TMS為內(nèi)標；UltraScan ESI-MS(bruker);制備色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C1821.2×250 mm,7 μm；Agilent 1260制備色譜儀(包括單元泵，手動進樣器，二極管陣列檢測器DAD，Chemstation色譜工作站)；半制備色譜柱：YMC-Pack ODS-A 10×250 mm,7 μm;Agilent 1260半制備色譜儀(包括二元泵,手動進樣器,多波長檢測器MWD,Chemstation色譜工作站).

柱層析硅膠(100～200目,200～300目)，薄層層析硅膠GF254為青島海洋化工廠產(chǎn)品; 二苯代苦味基自由基(DPPH),日本東京化成株式會社生產(chǎn);水為二次蒸餾水,其他常用試劑如乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、等均為工業(yè)重蒸后使用.正丁醇為分析純,制備色譜所用溶劑為重蒸分析純甲醇、色譜純乙腈和二次蒸餾水.

2 提取分離

麻櫟樹皮15 kg，用95%的乙醇浸泡提取數(shù)次，每次48 h,過濾，合并濾液減壓濃縮，得到1.3 kg浸膏.將浸膏混懸于適量的溫熱水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部分浸膏650 g.乙酸乙酯萃取部分粗提物160 g用100～200目硅膠進行柱層析，洗脫梯度系統(tǒng)以V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)為30∶1～2∶1分為11個組分(Fr.1～11).

組分Fr.2(3.4 g)通過凝膠層析柱甲醇為流動相進行洗脫得到3個組分(Fr.2A～Fr.2C),Fr.2A(873 mg)以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)為5∶1～1∶1為洗脫劑，通過硅膠柱層析反復洗脫，得到化合物6(10 mg),化合物7(20 mg).Fr.3(105 mg)經(jīng)V(CHCl3)∶V(MeOH)=15∶1為洗脫劑硅膠層析柱得到化合物8(19 mg).Fr.5(892 mg)通過凝膠層析柱，流動相為甲醇，得到化合物4(6 mg).

組分Fr.8(6.5 g)通過硅膠層析柱，用流動相V(氯仿)∶V(甲醇)=15∶1～1∶1梯度洗脫得到4個組分(Fr.8A～8D)，F(xiàn)r.8A(310 mg)用制備高效液相色譜以甲醇/水體積分數(shù)為37%作為流動相，3 mL/min的流速進行反復制備，減壓蒸餾，得到3個單體化合物1(13 mg),2(34 mg)和3(6 mg).Fr.8C(430 mg)用制備高效液相色譜以甲醇/水體積分數(shù)為34%作為流動相,3 mL/min的流速進行反復制備，并通過凝膠層析住甲醇為流動相純化得到化合物5(7 mg).

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末，ESI-MS 559 [M+Na]+,分子式為C27H36O11,1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.68(1H,s,H-6),6.41(2H,s,H-2′,H-6′),6.21(1H,s,H-3),4.57(1H,brs,H-1″),3.88(1H,m,H-7′),3.83(1H,m,H-9′a),3.12(1H,dd,J1=6.8 Hz,J2=2.4 Hz,H-9′b),3.71(1H,m,H-9a),3.64(1H,m,H-9b),2.85(2H,d,J=5.2 Hz,H-7),2.04(1H,m,H-8),1.90(1H,m,H-8′),3.85(1H,m,H-2″),3.66(1H,m,H-3″),3.35(1H,m,H-4″),3.53(1H,m,H-5″),1.20(3H,d,J=4.4 Hz,H-6″),3.82(3H,s,5-OCH3),3.79(3H,s,3′-OCH3),3.79(3H,s,5′-OCH3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:149.6(C-3′),149.6(C-5′),147.6(C-5),145.7(C-4),137.7(C-1′),135.4(C-4′),129.4(C-1),117.7(C-3),113.0(C-2),112.4(C-6),109.4(C-2′),108.0(C-6′),102.5(C-1″),74.6(C-4″),73.3(C-3″),72.7(C-2″),70.5(C-5″),68.8(C-9′),66.4(C-9),57.9(3′-OCH3),57.9(3′-OCH3),57.5(3′-OCH3),49.6(C-7′),45.9(C-8′),40.6(C-8),34.5(C-7),18.9(C-6″).以上數(shù)據(jù)與文獻[6]基本一致，鑒定為(+)-5′-methoxy-isolariciresinol-9′-O-α-L-rhamnopyranoside.

化合物2黃色粉末，ESI-MS 529[M+Na]+,分子式為C26H34O10,1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.73(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.62(1H,s,H-5),6.61(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.56(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),6.18(1H,s,H-8),4.52(1H,d,J=1.6 Hz,H-1″),3.82(1H,m,H-1),3.80(1H,m,H-2a1),3.13(1H,m,H-2a2),3.73(1H,m,H-3a1),3.60(1H,m,H-3a2),2.82(2H,d,J=5.6 Hz,H-4),2.01(1H,m,H-3),1.94(1H,m,H-2),3.85(1H,m,H-2″),3.61(1H,m,H-3″),3.34(1H,m,H-4″),3.59(1H,m,H-5″),1.24(3H,d,J=5.2 Hz,H-6″),3.82(3H,s,6-OCH3),3.74(6H,s,3′-OCH3),13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:147.5(C-6),145.6(C-3′),144.4(C-7),143.6(C-4′),136.5(C-9),132.4(C-1′),127.4(C-10),121.8(C-6′),115.8(C-8),114.6(C-5′),111.9(C-2′),110.9(C-5),100.6(C-1″),72.4(C-5″),71.1(C-2″),70.7(C-4″),68.5(C-3″),66.6(C-2a),64.1(C-3a),55.2(3′-OCH3,7-OCH3),46.8(C-1),43.9(C-2),38.4(C-3),32.2(C-4),16.6(C-6″).以上數(shù)據(jù)與文獻[7]基本一致，鑒定為isolariciresinol rhamnopyranoside.

化合物3白色粉末，ESI-MS 589[M+Na]+,分子式為C28H38O12.1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.61(1H,s,H-8),6.38(2H,s,H-2′,H-6′),4.54(1H,brs,H-1″),3.83(1H,m,H-4),3.81(1H,m,H-3a1),3.15(1H,m,H-3a2),3.74(1H,m,H-2a1),3.61(1H,m,H-2a2),2.87(2H,d,J=5.6 Hz,H-1),2.02(1H,m,H-2),1.91(1H,m,H-3),3.89(1H,m,H-2″),3.68(1H,m,H-3″),3.32(1H,m,H-4″),3.58(1H,m,H-5″),1.22(3H,d,J=5.2,H-6″),3.87(3H,s,7-OCH3),3.74(6H,s,3′-OCH3,5′-OCH3),3.71(3H,s,5-OCH3);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:149.5(C-3′,C-5′),149.1(C-7),147.9(C-5),139.5(C-6),139.2(C-1′),135.0(C-4′),130.9(C-9),126.5(C-10),108.9(C-8),107.3(C-2′,C-6′),102.3(C-1″),74.5(C-4″),73.2(C-3″),72.8(C-2″),70.6(C-5″),67.4(C-2a),64.3(C-3a),61.6(5-OCH3),58.0(3′-OCH3,5′-OCH3),57.8(7-OCH3),48.9(C-3),43.4(C-4),41.5(C-2),34.3(C-1),18.8(C-6″).以上數(shù)據(jù)與文獻[8]基本一致，鑒定為(+)-lyoniresinol 3α-O-α-L-rhamnopyranoside.

化合物4黃色針狀結(jié)晶(MeOH),ESI-MS 325[M+Na]+,分子式為C15H10O7,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:11.27(1H,s,C5-OH),10.04(1H,s,C7-OH),9.44(1H,s,C4-OH),9.18(1H,s,C3-OH),7.79(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.67(1H,dd,J=8.0 Hz,2.0 Hz,H-6),7.00(1H,d,J=8.0,H-5′),6.52(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.25(1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:147.3(C-2),136.6(C-3),176.4(C-4),161.7(C-5),99.0(C-6),165.1(C-7),94.4(C-8),157.9(C-9),104.5(C-10),123.5(C-1′),115.5(C-2′),145.8(C-3′),148.9(C-4′),116.0(C-5′),121.3(C-6′).以上數(shù)據(jù)與文獻[9-10]報道的槲皮素(quercetin)基本一致.

化合物5黃色無定型粉末,ESI-MS 487[M+Na]+,分子式為C21H20O12,1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.80(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.52(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6′),6.82(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.53(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.15(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.12(1H,d,J=7.6 Hz,H-1″),4.04(1H,m,H-2″),3.48(1H,m,H-3″),3.14(1H,m,H-4″),3.26(1H,m,H-5″),4.36(2H,m,H-6″);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:157.7(C-2),135.6(C-3),179.0(C-4),162.3(C-5),99.2(C-6),164.3(C-7),94.4(C-8),157.8(C-9),106.2(C-10),122.5(C-1′),116.4(C-2′),145.9(C-3′),148.5(C-4′),116.5(C-5′),122.7(C-6′),102.3(C-1″),74.8(C-2″),78.5(C-3″),71.3(C-4″),78.7(C-5″),62.3(C-6″).以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道的5,7,3′,4′-四羥基黃酮醇-3-O-葡萄糖苷(5,7,3′,4′-tetrahydroxy-flavonol-3-O-glycoside)基本一致.

化合物6無色針狀結(jié)晶(CHCl3)，m.p.183～184 ℃.ESI-MS(m/z):449[M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.16(1H,t,J=6.0 Hz,H-12),3.47(1H,t,J=3.2 Hz,H-3),1.16(3H,s,H-27),1.14(3H,s,H-23),1.09(3H,s,H-25),1.04(3H,s,H-24),1.00(3H,s,H-29),0.99(3H,s,H-30),0.95(3H,s,H-28),0.85(3H,s,H-26).以上數(shù)據(jù)與文獻[12-13]報道的β-香樹脂醇基本一致.

化合物7無色針狀結(jié)晶(CHCl3)，m.p.138～140 ℃.薄層Rf值與標準品β-谷甾醇一致，混熔點不下降，故鑒定該化合物為β-谷甾醇.

化合物8白色無定型粉末，m.p.278～280 ℃.薄層Rf值與標準品胡蘿卜苷一致，混熔點不下降，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷.

4 DPPH法測定化合物1～3抗氧化活性

4.1 實驗原理

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈紫色，其N上有一個游離電子，能接受一個電子或氫離子，在517 nm處有最大的吸收峰.當加入自由基清除劑時，DPPH的單電子被捕捉，紫色逐漸消失，在最大吸收波長處的吸光值也隨之減小，且下降程度與樣品濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而用以評價樣品的抗氧化能力.該法簡便易行，靈敏可靠[14].

4.2 實驗方法

向試管中依次加入3.0 mL 65 μmol/L DPPH溶液和2.0 mL甲醇，總體積為5.0 mL，混勻，避光放置30 min后，測定吸光度(測定波長為517 nm),記為A0；加入3.0 mL DPPH溶液和2.0 mL待測試樣溶液，測定值記為As；加入3.0 mL甲醇和2.0 mL待測試樣溶液，測定值記為Ar，按下式計算DPPH自由基清除率.

清除率/K=[1-(As-Ar)/A0]×100%

樣品清除DPPH自由基能力采用清除的EC50(自由基清除率為50%時所對應的待測液質(zhì)量濃度)值表示.測定時將每一待測試樣配制成系列溶液,測定并依上式計算DPPH清除率(重復測定3次,平均值即為測定結(jié)果),繪制其對待測樣質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線,根據(jù)此曲線得到在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的回歸方程,通過線性方程計算EC50,本論文使用市售的標準品butylated hydroxytoluene(BHT)為陽性對照，EC50越大，物質(zhì)的抗氧化活性越小.

4.3 實驗結(jié)果

表1 化合物1-3和標準品BHT的EC50

通過和標準品BHT比較,化合物1～3的EC50值分別為41.8± 2.9,48.9± 3.4,45.1 ± 1.5,與陽性對照品BHT的EC50值45.2 ± 6.9相比較相差很小,說明化合物1～3有較強的自由基清除能力,表明化合物1～3具有較好的抗氧化活性.

5 結(jié)語

本論文從麻櫟樹皮提取物乙酸乙酯萃取部分分離得到8個化合物，其中化合物1～3為木脂素類化合物，化合物4～5為黃酮類化合物.其中化合物1～6和8為首次從該種植物中分離得到.化合物1～3在DPPH自由基抗氧化實驗中均顯示有較好的抗氧化活性.

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(責任編輯 梁志茂)

Studies on the barks ofQuercusacutissimaCarruth

LI Xing-ming1,2,WANG Wei1,2,DAI Jian-hui1,2,GAO Li-bin1,2,YUAN Ming-long1,2,SUN Wei-qing1,2,ZENG Xiao-li1,2,HUANG Xiang-zhong1,2,3

(1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China; 2. Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China; 3.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines,Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

In this research,8 compounds were isolated from the ethyl acetate(EtOAc) barks ofQuercusacutissimaCarruth with the silica gel column chromatography,Sephadex LH-20,HPLC et al. On the basis of the spectra analysis,the 8 compounds were elucidated as the flowing:(+)-5′-methoxy-isolariciresinol-9′-O-α-L-rhamnopyranoside(1),isolariciresinol rhamnopyranoside(2),(+)-lyoniresinol-3α-O-α-L-rhamnopyranoside(3),quercetin(4),5,7,3′,4′-tetrahydroxy- flavonol-3-O-glycoside(5),β-amyrin(6),β-sitosterol(7),and daucosterol(8). Among these compounds,compounds 1-6 and 8 were obtained from this plant for the first time.

QuercusacutissimaCarruth; lignans; antioxidant activity

2014-09-18.

國家自然科學基金(21262047)；云南省應用基礎研究項目(S2012FZ0227)；云南民族大學傳統(tǒng)傣藥研究創(chuàng)新團隊項目；云南民族大學化學與生物技術(shù)學院SRT創(chuàng)新性實驗項目(2013HXSRTY06).

李新明(1987-)，男，碩士研究生.主要研究方向：天然產(chǎn)物化學.

黃相中(1974-)，男，博士，碩士生導師.主要研究方向：天然產(chǎn)物化學.

R284.1

A

1672-8513(2015)02-0104-04